一、植入脑源性神经营养因子载体细胞对幼鼠缺氧缺血性脑损伤后记忆的影响（论文文献综述）
刘璐[1]（2021）在《hUC-MSCs对缺氧缺血脑损伤幼鼠学习记忆的影响及机制初步探讨》文中进行了进一步梳理背景:缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）是引起婴幼儿神经系统损害的常见致病因素,患儿常出现运动及认知障碍。足够的神经营养支持是治疗HIBD的关键,但目前缺乏有效的神经修复方法,导致越来越多的患儿遗留多种神经系统损害后遗症。近年来干细胞在HIBD的治疗中具有明显的神经营养作用,但具体机制不详。随着研究的深入,发现干细胞的旁分泌机制的重要性,可通过分泌多种营养因子如神经营养因子、血管生成因子等进行损伤修复。其中脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是大脑中含量最多的神经营养因子,由BDNF介导的BDNF-ERK-CREB信号通路是一条神经营养通路,对学习记忆及认知功能的巩固具有重要意义,其中环磷腺苷效应元件结合蛋白（c AMP-response element binding protein,CREB）对于学习记忆的巩固作用尤为显着,因此也为干细胞治疗HIBD的机制研究提供了新的方向。目的:研究给予人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal ste m cells,hUC-MSCs）干预对HIBD幼鼠学习和记忆功能的影响,并初步探讨hUC-MSCs的治疗机制。方法:（1）选取健康7日龄SD大鼠,将幼鼠分为3组（每组10只）:对照组（sham+0.9%Na Cl）,治疗组（HIBD+hUC-MSCs）,损伤组（HIBD+0.9%Na Cl）。通过缺血（右侧颈总动脉结扎离断）+缺氧（8%O2+92%N2）法制备HIBD幼鼠模型,对照组仅行假手术（sham）处理。（2）设建模当日为第0天,第7天,治疗组每只幼鼠经尾静脉注射200μL hUC-MSCs（5×106cells/ml）,对照组和损伤组每只幼鼠分别经尾静脉注射200μL 0.9%Na Cl溶液。（3）第16天开始进行水迷宫实验评估幼鼠学习、记忆功能,持续至第21天。（4）第21天取各组幼鼠脑组织额叶皮层,HE染色观察大脑前额叶皮层组织损伤情况;NeuN免疫组织化学染色检测前额叶皮层神经元的存活情况;细胞凋亡染色检测前额叶皮层神经细胞凋亡情况;蛋白印迹（Western-blot,WB）法检测前额叶皮层BDNF和p-CREB表达水平。结果:（1）建模后幼鼠出现肌张力异常、对侧偏瘫和行走时向对侧转圈等表现可初步判断建模成功。（2）水迷宫实验显示,与对照组相比,造模组幼鼠逃避潜伏时间较对照组增加,穿台次数减少,差异均有统计学意义（P<0.05）;与损伤组相比,治疗组幼鼠逃避潜伏时间较损伤组减少,穿台次数增加,差异均有统计学意义（P<0.05）。（3）HE染色显示,对照组幼鼠前额叶皮层组织形态正常,造模组均有损伤,但治疗组幼鼠前额叶皮层组织损伤较损伤组减轻。（4）免疫组织化学染色显示,与对照组相比,造模组幼鼠前额叶皮层NeuN阳性细胞数减少,差异有统计学意义（P<0.05）;与损伤组相比,治疗组幼鼠前额叶皮层NeuN阳性细胞数明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。（5）凋亡染色显示,与对照组相比,造模组前额叶皮层凋亡神经细胞数明显增多,差异有统计学意义（P<0.05）;与损伤组相比,治疗组幼鼠前额叶皮层凋亡神经细胞数明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。（6）蛋白印迹法显示,与对照组相比,损伤组前额叶皮层BDNF和p-CREB表达水平明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）;与损伤组相比,治疗组幼鼠前额叶皮层BDNF和p-CREB表达水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1.hUC-MSCs干预能促进HIBD幼鼠学习、记忆功能的改善。2.hUC-MSCs可通过促进前额叶皮层神经元的存活,减少神经细胞凋亡以减轻HIBD幼鼠大脑损伤。3.hUC-MSCs对HIBD幼鼠学习、记忆功能的改善可能与上调了前额叶皮层BDNF、p-CREB的表达有关。
赵慧[2]（2020）在《免疫与炎症反应在脑卒中动物模型中的影响与机制研究》文中进行了进一步梳理目的:脑卒中后脑内炎症反应参与损伤级联扩大及神经功能恶化,但其特点与直接作用尚不明确。本研究通过注射百日咳毒素（pertussis toxin,PTx）增强脑缺血或出血后脑内炎症反应,观察脑内炎症特点、病理变化及临床结局,明确脑卒中后脑内炎症的直接作用。在细胞调节水平,具有获得性免疫功能的固有淋巴细胞（innate lymphoid cell,ILC）亚群对脑卒中的免疫调节作用与机制尚不明确。因此我们研究以2型为代表的ILC及其调节因子白介素（interleukin,IL）-33对脑卒中的影响,以明确脑卒中后免疫细胞介导的炎症反应特征与机制,为免疫调节治疗提供实验依据。方法:第一部分:野生型C57BL/6小鼠100只,雄性,予以分为5组,假手术组（Sham组）、脑缺血组（MCAO组）、PTx处理脑缺血组（20μg/kg PTx+MCAO组）、脑出血组（ICH组）、PTx处理脑出血组（20μg/kg PTx+ICH组）（随机数字法）,每组20只。采用线栓法对野生型C57BL/6小鼠建立60分钟大脑中动脉缺血再灌注模型。采用胶原酶微量泵注射法制备野生型C57BL/6小鼠脑出血模型。应用改良的神经功能缺损评分量表、转棒疲劳实验检测第1-3天各组小鼠的神经功能损伤情况;用流式细胞术对第3天各组小鼠的病灶侧脑组织免疫细胞浸润情况进行分析,包括小胶质细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞;小动物活体成像技术对第3天各组小鼠中枢活性氧进行标记示踪;免疫荧光染色的方法对内皮细胞与紧密连接蛋白ZO-1、内皮细胞与紧密连接蛋白Claudin-5共染,观察第3天各组小鼠的血脑屏障通透性。第二部分:野生型C57BL/6小鼠40只,雄性,予以分为2组,假手术组（Sham组）与脑缺血组（MCAO组）（随机数字法）,每组20只。流式细胞分析比较各组小鼠MCAO模型制备后第3天脑、脾、外周血的ILC2计数;免疫荧光染色法分析少突胶质细胞、星形胶质细胞中IL-33表达水平。应用药理学干预和转基因动物,研究删除、转输或活化ILC2细胞对神经功能评分和梗死体积的影响:分组1)野生型C57BL/6小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组（Vehicle组）与删除ILC2组（anti-CD90.2组）（随机数字法）,每组10只。2)应用免疫缺陷的Rag2-/-γc-/-小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组（Vehicle组）与ILC2转输组（ILC2组）（随机数字法）,每组10只。3)野生型C57BL/6小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组（Vehicle组）与IL-33处理组（IL-33组）（随机数字法）,每组10只。应用小动物磁共振成像仪T2成像比较各组小鼠MCAO模型制备后第1、3、7天脑梗死病灶体积;改良的神经功能缺损评分量表、转角实验比较各组小鼠MCAO模型制备后第1、3、7天神经功能损伤情况。结果:第一部分:（1）各组小鼠神经功能损伤情况:与MCAO组相比,第1-3天20μg/kg PTx+MCAO组小鼠改良的神经功能缺损评分明显增高（*P<0.05）,转棒疲劳实验小鼠停留的时间明显减少（*P<0.05）。与ICH组相比,20μg/kg PTx+ICH组小鼠改良的神经功能缺损评分明显增高（*P<0.05）,转棒疲劳实验的时间明显减少（*P<0.05）。（2）各组小鼠中枢免疫细胞浸润分布:与Sham组相比,MCAO组与ICH组小鼠脑内小胶质细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞显着增多（*P<0.05）。分别与MCAO组、ICH组相比,20μg/kg PTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组小鼠中枢内B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞明显增多（*P<0.05）。此外,分别与MCAO、20μg/kg PTx+MCAO组相比,ICH、20μg/kg PTx+ICH组小鼠中枢内中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD8+T细胞明显减少（*P<0.05）。（3）各组小鼠脑氧化应激对比:与Sham组相比,MCAO组、ICH组第3天的活性氧产生显着增多,氧化应激水平显着增高（*P<0.05）。20μg/kg PTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组的氧化应激水平较未处理组明显增高（*P<0.05）。（4）各组小鼠血脑屏障染色:与Sham组相比,MCAO组、ICH组第3天的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5表达显着减少。分别与MCAO组、ICH组相比,20μg/kgPTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5表达进一步减少。第二部分:（1）与Sham组相比,MCAO组野生型C57BL/6小鼠脑内ILC2计数明显增多（**P<0.01）,脾与外周血中ILC2计数明显减少（*P<0.05）,提示脑缺血后ILC2向中枢浸润增多。（2）为研究ILC2是否影响脑卒中病理进程,我们利用抗CD90.2单抗删除ILC2及将ILC2转输至Rag2-/-γc-/-小鼠（无T、B、NK细胞）体内,经核磁影像与神经功能评分阐述ILC2对脑卒中预后的影响。实验发现,在脑缺血再灌注后第1-3天,抗CD90.2抗体删除ILC2显着增加小鼠脑梗死体积和神经功能缺失（*P<0.05）。而通过将ILC2转输至Rag2-/-γc-/-小鼠可有效降低脑梗死体积和神经功能缺失（*P<0.05）。上述结果表明ILC2对缺血性脑卒中具有保护作用。（3）继而,我们利用病理切片染色发现,少突胶质细胞是表达IL-33的主要细胞,且在脑缺血再灌注后表达显着上调（*P<0.05）。推测胶质细胞来源的IL-33可能是维持脑部ILC2细胞存活与活化的主要细胞。缺血性脑卒中小鼠体内给予IL-33能够扩增ILC2数量,减小脑梗死体积和神经功能缺失（*P<0.05）。结论:第一部分:PTx引起的系统炎症反应可进一步加重小鼠脑卒中后神经功能损伤程度体现为:中枢内小胶质细胞活化,髓系与淋巴细胞的浸润增多;PTx引起的免疫炎症过程可能与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞在中枢内浸润增高有关,而与小胶质细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞的中枢浸润关系不密切。相比ICH模型,MCAO模型以中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD8+T细胞的中枢浸润为主,提示天然免疫可能主要参与了脑缺血急性期损伤加重。PTx对小鼠脑内活性氧的产生及其氧化应激水平有进一步放大作用。PTx诱发的炎症反应下调脑卒中后第3天血脑屏障的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5的表达,使其破坏加重,进一步扩大脑内免疫炎症反应水平。第二部分:MCAO小鼠脑内有大量的ILC2浸润,而外周ILC2显着减少,提示外周ILC2可能在脑缺血后迁移至脑损伤部位。通过删除或转输ILC2的相关实验提示ILC2可减轻脑缺血再灌注小鼠神经功能损伤和病灶体积,证明ILC2对缺血性脑卒中发挥保护作用。IL-33可在体内扩增ILC2,表明脑内胶质细胞来源的IL-33可能是维持ILC2细胞活化的关键分子。ILC2减小梗死体积、帮助神经功能的修复可能是通过其上游的IL-33调节作用完成,其中少突胶质细胞可能是IL-33的主要来源。
张星贺[3]（2020）在《基于“肾脑相关”理论六味地黄膏膏摩干预对脑瘫幼鼠皮层损伤修复及BDNF/TrkB表达的影响》文中研究表明目的:基于“肾脑相关”理论,采用六味地黄膏膏摩对脑瘫（cerebral palsy,CP）幼鼠进行干预,观察六味地黄膏膏摩对CP幼鼠大脑皮层损伤修复及BDNF/TrkB表达的影响,以期为临床采用六味地黄膏膏摩治疗CP提供实验依据。方法:1.文献研究采用文献搜集及数据挖掘的方法,探讨“肾脑相关”理论的渊源及发展脉络,探究中医对CP病因病机的认识,整理总结齐鲁小儿推拿治疗CP的辨证选穴规律,分析六味地黄膏膏摩治疗CP的理论基础及优势。2.实验研究（1）实验动物:50只幼鼠经造模等处理措施随机分为模型对照组、假手术对照组、推拿组、涂膏组及六味地黄膏膏摩组,每组10只。（2）干预方法:推拿组采用指摩法摩肾俞穴;涂膏组将六味地黄膏涂于肾俞穴部位;六味地黄膏膏摩组将六味地黄膏涂于肾俞穴部位,并采用指摩法摩肾俞穴;以上三组每日干预1次,共干预28天。模型对照组、假手术对照组幼鼠给予禁食处理。（3）指标检测:幼鼠麻醉后,提取并制备血清样本、大脑石蜡切片及皮层蛋白样本;采用尼氏染色观察大脑皮层神经元形态及数量;采用ELISA检测血清脑源性神经营养因子（brain-de rived neurotrophic factor,BDNF）及酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B,TrkB）含量;采用免疫荧光染色法观察大脑皮层BDNF/TrkB荧光表达水平;采用Western Blot检测大脑皮层BDNF/TrkB蛋白表达水平。结果:1.文献研究（1）“肾脑相关”理论起源于战国秦汉时期且最早见于《黄帝内经》,其随着中医学的发展而不断充实完善并应于疾病的辨证论治当中。（2）先天禀赋不足、肾精化髓无力而脑髓失养是CP的主要病因病机。（3）齐鲁小儿推拿在“肾脑相关”理论指导下对CP进行辨证论治,采用补肾益脑的肾水穴、二人上马穴、肾俞穴做为治疗CP的核心,但肾水穴、二人上马穴无动物体表定位。（4）六味地黄膏膏摩法由摩肾俞的推拿手法与六味地黄膏组成,能够发挥推拿以及药物的双重效果,具有滋阴补肾、填精益髓的作用,其解决CP患儿服药困难的难题,适宜CP患儿的使用。2.实验研究（1）六味地黄膏膏摩对CP幼鼠大脑皮层神经元形态及数量的影响与模型对照组相比较,六味地黄膏膏摩组、推拿组、涂膏组皮层神经元细胞形态及分布均有所改善,染色深浅、透明度较为一致,尼氏小体较多,且正常形态神经元数量均高于模型对照组,差异有高度统计学意义（P<0.001）。六味地黄膏膏摩组、推拿组、涂膏组皮层神经元细胞形态及分布均较差,染色深浅、透明度不一。但六味地黄膏膏摩组皮层正常形态神经元数量高于推拿组、涂膏组,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;推拿组、涂膏组皮层正常形态神经元数量相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。（2）六味地黄膏膏摩对CP幼鼠血清及皮层BDNF/TrkB表达水平的影响与模型对照组相比较,六味地黄膏膏摩组血清BDNF含量、皮层BDNF蛋白表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.001）。推拿组、涂膏组血清BDNF含量及皮层蛋白BDNF表达水平分别与模型对照组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。六味地黄膏膏摩组、推拿组、涂膏组血清BDNF含量两两相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。六味地黄膏膏摩组皮层BDNF蛋白表达水平高于推拿组、涂膏组,差异有高度统计学意义（P<0.001）;推拿组、涂膏组皮层BDNF蛋白表达水平相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。与模型对照组相比较,六味地黄膏膏摩组、推拿组、涂膏组血清TrkB含量无显着变化,差异无统计学意义（P>0.05）。与模型对照组相比较,六味地黄膏膏摩组皮层TrkB蛋白表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）;推拿组、涂膏组皮层TrkB蛋白表达水平分别与模型对照组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。与推拿组相比较,六味地黄膏膏摩组血清TrkB含量降低,差异有统计学意义（P<0.05）;六味地黄膏膏摩组、推拿组血清TrkB含量分别涂膏组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。与推拿组、涂膏组相比较,六味地黄膏膏摩组皮层TrkB蛋白表达水平降低,差异有统计学差异（P<0.05）。推拿组、涂膏组皮层TrkB蛋白表达水平相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.基于“肾脑相关”理论、CP病因病机、齐鲁小儿推拿治疗CP辨证选穴规律的六味地黄膏膏摩法理论上具有补肾益脑的功效,采用该疗法治疗CP具有可行性、优势性。2.六味地黄膏膏摩、单纯推拿、单纯涂六味地黄膏均能对CP幼鼠皮层神经元损伤起到修复作用,且六味地黄膏膏摩的修复效果最佳。3.六味地黄膏膏摩增强了CP幼鼠血清及大脑皮层BDNF的表达,但其对CP幼鼠血清TrkB表达的影响不显着。单纯推拿及单纯涂六味地黄膏对CP幼鼠血清及大脑皮层BDNF及TrkB表达的影响均不显着。六味地黄膏膏摩抑制了CP幼鼠大脑皮层TrkB的表达,其可能与TrkB的磷酸化有关。
曾友根[4]（2020）在《NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究》文中研究表明目的:本研究通过观察NSCs和OECs联合移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞神经营养因子,凋亡及抗凋亡蛋白因子表达影响,探讨细胞移植对SNHL损伤耳蜗细胞保护作用的部分机制。方法:（1）细胞培养:选取胎鼠作为移植细胞组织来源,对NSCs和OECs培养、形态观察及鉴定。（2）动物造模:采用庆大霉素对大鼠进行SNHL造模,将筛选出符合要求的大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组予NSCs和OECs联合移植,对照组予输注人工外淋巴液代替细胞移植。（3）细胞移植:将荧光标记的NSCs和OECs通过圆窗植入耳蜗内,术后记录各组大鼠体重变化,检测大鼠ABR听力阈值变化和听觉耳动反射阈值,并采集样本检测。（4）耳蜗切片HE染色。（5）耳蜗免疫荧光染色检测移植后NSCs和OECs荧光标记物。（6）TUNEL法检测凋亡细胞阳性细胞数和MOD值。（7）免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞。（8）Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达影响。结果:（1）细胞培养鉴定结果:NSCs染色鉴定标记物呈nestin阳性,OECs染色鉴定标记物呈p75NTR阳性,培养获得了纯度较高的细胞。（2）听觉耳动反射检测结果:实验组大鼠耳廓反射阈值改善,耳廓抖动变化增强,对照组改变不明显。（3）ABR阈值变化结果:与对照组比较,实验组在1周后ABR阈值变化不明显（P>0.05）,在2周后实验组ABR阈值变化升高（P<0.05）。（4）耳蜗免疫荧光染色结果:实验组移植后NSCs标记分化的细胞部分能表达神经元细胞标志物Nestin,OECs标记分化的细胞分能表部达OECs标志物p75NTR,对照组耳蜗未发现荧光标记的细胞。（5）HE染色结果:对照组见内、外毛细胞变性坏死,SGCs部分坏死,核萎缩,损伤明显,细胞空泡样变性,密度降低,排列疏松混乱不齐,实验组整体病理损伤减低。（6）TUNEL阳性细胞数检测结果:与对照组比较,实验组TUNEL阳性细胞数明显减少（P<0.05）,细胞凋亡指数占比减少,MOD值减少（P<0.05）。（7）免疫组化检测结果:与对照组比较,实验组BDNF和NT-3阳性细胞数及IOD值明显增多（P<0.05）,同时抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数及IOD值升高,促凋亡因子Bax、Caspase-3阳性细胞数及IOD值减少（P<0.05）。（8）Western-blot检测结果:与对照组比较,实验组耳蜗组织样本中BDNF、NT-3,Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论:（1）NSC联合OEC移植对SNHL大鼠耳蜗具有保护作用,能减轻耳蜗细胞的损伤。（2）NSC联合OEC移植可能通过调节神经营养因子的表达水平而参与了耳蜗细胞的保护过程。（3）NSC联合OEC移植可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达路径而参与了对SNHL耳蜗细胞凋亡的保护机制。
凌文远[5]（2020）在《化学遗传学靶向激活运动皮层谷氨酸能神经元对脑出血小鼠运动和认知功能的影响及机制研究》文中研究表明全球每年大约有200万人罹患自发性脑内出血（spontaneous cerebral hemorrhage,ICH）,具有死亡率和致残率高的特点,并且目前治疗措施效果不佳。因此,寻找脑出血治疗的新策略和新靶点具有重要的科学意义和临床价值。所谓化学遗传学技术（designer receptors exclusively activated by designer drugs,DREADDs）,是利用遗传学方法,利用化学小分子作为工具解决生物的问题,或者通过干扰、调控正常生理过程,以达到了解蛋白质功能,是利用化学工具进行探索和研究生命过程的一门新兴学科。相关研究表明,刺激大脑皮层可能会促进脑卒中的康复,但是相关的机制目前尚不明确,在本文中,我们将利用腺相关病毒转染使小鼠运动皮层表达hM3D（Gq）,并结合腹腔注射氯氮平-N-氧化物（CNO）,进而特异性激活运动皮层中的谷氨酸能神经元,探讨运动皮层的谷氨酸能神经元在脑出血小鼠的恢复过程中的作用及可能机制。本论文开展的研究如下:首先,本文将能够靶向谷氨酸能神经元的腺相关病毒载体,利用立体定向技术构建化学遗传学小鼠动物模型。饲养3周待病毒载体稳定表达后,给予氯氮平-N-氧化物（CNO）腹腔注射以实现对动物皮层谷氨酸能神经元活性的调节。选取部分模型动物灌注、取材进行免疫荧光检测,验证化学遗传学病毒载体的神经元表达情况,并通过免疫组化技术检测模型动物中标识细胞激活的即早基因c-Fos基因的表达情况,以验证谷氨酸能神经元的化学遗传学激活。随后通过尾动脉血纹状体立体定向注射构建小鼠脑出血动物模型,并对模型的稳定性和成功率进行评估。表明大脑皮层靶向注射腺相关病毒包装的hM3Dq-mCherry工具联合腹腔注射氯氮平-N-氧化物能够化学遗传学激活皮层谷氨酸能神经元;同时,本研究通过自体尾动脉血定向纹状体注射建立的小鼠脑出血模型具有模型成功率高、小鼠存活率高、血肿体积相对固定、组内差异小的特点,能够良好地用于开展脑出血相关研究。进一步,对于化学遗传技术激活皮层谷氨酸能神经元脑出血小鼠,我们通过Longa神经缺失量表评估小鼠神经功能,利用Grip tese、悬吊实验和Rotating beam实验评估小鼠运动感觉功能的恢复情况。并利用Morris水迷宫实验评估小鼠认知功能的恢复情况。实验表明化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元可促进脑出血后整体神经状态、运动感觉功能、协调性和运动耐力的恢复,并促进脑出血导致的小鼠空间学习和记忆功能损害的恢复。为了更深入探讨化学遗传学技术激活皮层谷氨酸能神经元改善脑出血小鼠运动和认知功能,本文通过检测线粒体功能和海马齿状回（DG区）细胞增殖情况探讨谷氨酸能神经元激活改善神经功能恢复的内在机制。首先,制备模型动物的神经元单细胞悬液,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位、ELISA方法检测线粒体ATP水平和DNA氧化损伤生物标记物8-羟基脱氧尿苷（8-OHdG）的含量,揭示皮层谷氨酸能神经元对线粒体功能的影响;然后,通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记,免疫组织化学法,检测海马齿状回（DG）区细胞增殖情况,明确皮层谷氨酸能神经元的激活促进脑出血小鼠认知功能内在机制。实验结果表明运动皮层谷氨酸能神经元激活可以改善线粒体膜电位,提高ATP水平,缓解DNA氧化损伤,改善线粒体功能,会促进小鼠脑出血后功能恢复;针对海马齿状回新生神经元的5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记进行检测,发现海马DG区BrdU+神经元数明显升高,表明皮层谷氨酸能神经元激活后该区神经元增殖能力增强,促进脑出血后小鼠认知功能的恢复。综上所述,本文利用化学遗传学技术靶向激活运动皮层谷氨酸能神经元,通过其突触联系和纤维投射,明显促进脑出血后神经元的线粒体功能改善和海马DG区细胞增殖,有利于运动和认知功能障碍的改善。本研究揭示了运动皮层的谷氨酸能神经元激活可能是潜在的对脑出血后神经功能障碍进行靶向干预的新途径,并为药物研发及临床精准治疗脑出血导致的血肿灶周白质损伤导致的运动、感觉及认知功能障碍提供新的手段或策略。第一部分 构建hM3Dq-mCherry稳定表达的小鼠运动皮层谷氨酸能神经元激活动物模型及其生物学特征验证1.目的:构建化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元的动物模型,进行腺相关病毒转染并激活神经元的生物学验证。2.方法（1）本部分实验,将动物分为以下四组:Sham（假手术）组、hM3Dq组（pAAV2/9-CaMKⅡ α-hM3Dq-mCherry+ICH 模型）、mCherry 组（pAAV2/9-CaMKⅡ α-mCherry+ICH模型）和ICH组（脑出血模型对照组）。在ICH小鼠模型构建3周前,利用脑立体定向注射技术按照不同分组向小鼠右侧运动皮层M1 区两个靶点注射实验真病毒pAAV2/9-CaMKⅡ α-hM3Dq-mCherry（hM3Dq 组）和对照假病毒pAAV2/9-CaMKⅡ α-mCherry（mCherry 组）。共 220 只成年小鼠称取体重随机分组,每组55只动物,另外取30只乳鼠（出生15-17天）按不同分组分别注射 pAAV2/9-CaMKⅡ α-hM3Dq-mCherry、溶剂 Vehicle 和pAAV2/9-CaMKⅡ α-mCherry用于运动皮层化学遗传学转染的鉴定。病毒注射后3周建立ICH小鼠模型,并在建模后7天开始腹腔注射CNO（7 p.m.）,连续注射21天。（2）在AAV病毒注射3周后,将乳鼠主动脉灌注,收集乳鼠脑组织制作脑片,利用荧光显微镜观察乳鼠大脑运动皮层mCherry的荧光表达,利用免疫荧光染色检测CaMKⅡα 阳性谷氨酸能神经元的病毒表达情况。（3）待乳鼠给予连续腹腔注射CNO后1周,升主动脉灌注、取材,免疫组化检测乳鼠大脑运动皮层c-Fos的表达,以验证运动皮层谷氨酸能神经元的化学遗传学激活情况。3.结果（1）病毒表达情况:病毒注射3周后,荧光显微镜激光激发后显示,运动皮层M1区出现红色荧光,表明工具病毒在运动皮层表达。DAPI细胞核染色结果显示运动皮层M1区谷氨酸能神经元细胞中同时DAPI和mCherry 荧光蛋白,表明 pAAV2/9-CaMKⅡα-hM3Dq-mCherry 转染了谷氨酸能神经元,并稳定表达。（2）即早基因c-Fos的免疫组化检测:CNO腹腔注射1周后,灌注、取材,针对表达hM3Dq-mCherry神经元的代表性组织切片的免疫组化显示c-Fos在联合CNO应用之后出现明显的阳性表达水平升高,说明CNO能够化学调整谷氨酸能神经元活性,并引起谷氨酸能神经元兴奋性升高。4.结论:脑立体定位注射腺相关病毒包装的化学遗传学工具pAAV2/9-CaMKⅡα-hM3D（Gq）-mCherry 和 pAAV2/9-CaMKⅡα-mCherry 联合腹腔注射CNO能够转染运动皮层谷氨酸能神经元,而且前者能够调控谷氨酸能神经元的兴奋性。第二部分 化学遗传学激活运动皮层谷氨酸能神经元对脑出血小鼠运动和认知功能的影响（一）自体尾动脉血立体定向靶向注射纹状体构建脑出血动物模型1.目的:建立脑出血小鼠动物模型,并对脑出血模型的稳定性、成功率进行评价。2.方法（1）脑立体定向注射技术构建脑出血动物模型:取体重为25-30 g的C57BL/6小鼠（分组如前）。所有小鼠经5%异氟烷诱导麻醉后,气管插管并2-3%异氟烷维持麻醉进行手术。采用尾动脉血立体定向纹状体注射法构建小鼠ICH模型。术前8h禁食,4h禁水,麻醉成功后,俯卧位固定于小动物脑立体定向手术台上（512600,Stoelting,USA）。剃除小鼠颅骨表面毛发,使用碘伏消毒并75%酒精脱碘后,剪开头皮（为促进术后恢复,皮肤切开尽量短）,骨膜用骨膜剥离器剥离,暴露前囟及冠状缝,少量3%双氧水擦拭,剪去残留的受损组织。立体定向仪调整前囟和后囟高度,保证两者处于同一水平面。根据小鼠脑解剖图谱,以前囟为原点,对靶向运动皮层进行定位（AP=0.00 mm,ML=+2.2 mm,DV=-2.5 mm）。定位后,用牙科钻钻孔至脑膜。用恒温电热垫加温鼠尾,使用乙醇消毒即见充血,距尾端2cm处切断鼠尾,微量注射器抽取非抗凝血50uL,将注射器固定于立体定向仪上,通过微量进样泵将注射器中的尾动脉血缓慢注射（15uL/5min匀速注入）,注射结束后留针5min,然后退针2.0mm停针4min,最后将注射器缓慢退出。注射期间酒精棉球包扎鼠尾断端,术后以骨蜡封闭颅骨骨孔,碘伏消毒,无菌缝线缝合头皮涂抹红霉素软膏预防感染。Sham组没有尾动脉立体定向注射纹状体外,手术过程的麻醉方式和手术操作均同于其余组别。（2）动物脑出血模型评价:分别于脑出血模型构建手术处理后2小时和24小时,用Longa评分量表分别评定各实验分组小鼠的神经缺失情况。小鼠体重损失超过20%及神经功能评分同正常对照组存在统计学差异则排除于后续实验。3.结果（1）存活率:手术2小时后sham组小鼠的存活率为100%,hM3Dq组小鼠的存活率为94.55%,ICH模型组小鼠的存活率为98.18%,mCherry组小鼠的存活率为96.36%。手术24小时后Sham组小鼠的存活率为100%,hM3Dq组小鼠的存活率为92.73%,ICH模型组小鼠的存活率为96.36%,mCherry组小鼠的存活率为94.55%。（2）术后2小时开始进行神经缺失评分,ICH组中神经缺失评分为1-3分的小鼠占76%,hM3Dq组神经缺失评分为1-3分的小鼠占77%,mCherry组神经缺失评分为1-3分的小鼠占76%;术后24小时ICH组中神经缺失评分为1-3分的小鼠占66%,hM3Dq组神经缺失评分为1-3分的小鼠占65%,mCherry组神经缺失评分为1-3分的小鼠占63%。结论:通过自体尾动脉血立体定向纹状体注射建立的小鼠脑出血模型具有模型成功率高、小鼠存活率高、血肿体积相对固定、组内差异小的特点,是开展脑出血相关研究的良好模型。（二）评估运动皮层谷氨酸能神经元激活对脑出血小鼠运动和认知功能恢复的影响1.目的:本部分实验将在激活皮层谷氨酸能神经元的基础上构建脑出血模型后,进一步探讨化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元对脑出血小鼠运动和认知功能的影响。2.方法:本部分研究实验分组如前。脑出血模型构建实验后1周开始对各个实验分组氯氮平-N-氧化物（CNO,3mg/kg）腹腔连续注射。分别于CNO连续腹腔注射的第7天和第21天时,在末次CNO腹腔注射的6小时内进行运动感觉和认知功能的神经学评估。利用Longa神经缺失量表评估受试小鼠总体神经功能,转棒试验、Grip test和悬吊实验评定小鼠运动功能,使用Morris水迷宫实验评估小鼠的认知功能恢复情况。3.结果（1）神经功能缺损和运动功能的恢复:Longa神经缺失量表评定结果表明hM3Dq、ICH、和mCherry组的神经功能缺损评分高于Sham组,具有显着性差异（P=0.031,P<0.0001,P=0.0002）;ICH组和mCherry组的神经功能缺损评分高于hM3Dq组（P=0.0086,P=0.0228）;ICH组的神经功能缺损评分同mCherry组无显着差异（P>0.05）。转棒试验结果显示,从CNO干预第7天开始,hM3Dq组的运动距离和运动速度均显着高于mCherry组和ICH组（均P＜0.05）,但低于Sham组评分（P＜0.05）（表2.4和图2.5）。悬吊实验显示,hM3Dq组、ICH组和mCherry组的评分显着低于Sham组（P＜0.0001）,ICH组和mCherry组的评分低于hM3Dq组（P＜0.001）,ICH组和mCherry组的评分无显着差异（P＞0.05）。（2）皮层谷氨酸能神经元激活对记忆功能的影响:Morris水迷宫实验结果表明,hM3Dq组逃避潜伏期低于其他模型对照组（P＜0.05）,游泳速度明显快于其他模型对照组（P＜0.05）;在探索试验中,将平台移除,hM3Dq组与ICH和mCherry组小鼠在目标象限中花费的时间有显着性差异（P=0.0123,P=0.0112）,两对照组之间无显着差异（P＞0.05）;对位训练中,hM3Dq组与ICH和mCherry两个对照组比较,小鼠穿越平台位置数量显着增加（P=0.0341,P=0.0177）,对照组之间穿越平台位置数无显着差异（P=0.6433）。4.结论:化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元可促进脑出血后整体神经状态、运动功能、协调性和耐力的恢复,进而促进脑出血所导致的小鼠空间学习和记忆损害的恢复。第三部分 化学遗传学激活运动皮层谷氨酸能神经元改善脑出血小鼠运动和认知功能恢复的线粒体相关机制研究1.目的:检测化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元对脑出血小鼠线粒体功能的影响。2.方法（1）流式细胞仪检测线粒体膜电位:实验动物颈椎脱臼处死,冰盒内后续操作。75%酒精浸泡1-3分钟后置于超净工作台内,无菌取大脑。将模型灶周脑组织用小剪刀剪碎,转移至放离心管,加入0.25%胰-EDTA复合消化液置于37℃孵育箱中消化20-30min,消化期间间断震荡和吹打。用预冷NeurobasalTM神经元专用培养基终止消化,吸管轻柔吹打均匀后,静置,取上清液放400目细胞筛过滤,并收集细胞悬液。收集的上清液用吸管吹打均匀后离心（1000rpm,5min）,弃去上清,反复冲洗1-2次后加预冷NeurobasalTM神经元专用培养基,制成模型小鼠神经元单细胞悬液。然后,细胞计数,调整细胞浓度。植入24孔板中,每组设4个平行样本,加入新鲜配置的TMRM线粒体染色液（30nM）移至细胞培养箱内,37℃避光孵育30min。预冷PBS清洗后流式细胞仪上机检测。取每组lx106个神经元荧光强度值的平均值作为该组测得值。其平均荧光强度（mean fluorescence intensity,MFI）又代表神经元细胞 MMP 水平。TMRM的激发波长为561nm、发射波长为581nm,使用CellQuestpro软件对结果进行分析。（2）线粒体ATP水平检测:将动物颈椎脱臼处死,置于冰盒75%酒精1-3分钟后移至超净工作台,无菌操作取大脑,剪取模型灶周小块重量约为50-100mg的脑组织。将每10mg脑组织在100 uL的ATP Assay缓冲液研磨10次,使用10kDa MWCO超滤离心管去除蛋白。将ATP Assay Kit（Sigma,MAK1901KT）试剂置于冰浴中溶解后,用90mL的水稀释10mL 10mM（10 nmole/mL）的 ATP 标准溶液,生成 1mM（1nmole/mL）的ATP标准溶液。向96孔板中加入0、2、4、6、8和10 uL的1 mM ATP标准溶液,配置浓度分别为0（空白）、2、4、6、8和10 nmol/1标准溶液;加入ATP Assay缓冲液,使每孔体积达到50uL。按照产品说明书将ATP Assay 缓冲液、ATP Probe、ATP Converter、Developer Mix 按照固定比例配置反应混合物,96孔板中上样,每孔50uL。在Sample Blank中省略ATP Converter,以校正样品中的背景。为确保读数在标准曲线的线性范围内,每样品上样3个复孔。将50 uL的适当反应混合物添加到每个孔中。用水平振动筛或移液管充分搅拌。在室温下孵育30分钟后在570nm（A570）测量吸光度。制备标准曲线,其中纵坐标代表RLU值,横坐标代表ATP浓度。（3）线粒体DNA氧化产物8-羟基脱氧鸟苷酸（8-OHdG）检测:将动物颈椎脱臼处死,冰盒内用75%酒精浸泡1-3分钟后置于超净工作台,无菌操作取大脑,剪取模型侧重量约为50-100mg的脑组织液氮速冻。以每克组织加入5mL匀浆缓冲液配比（0.1 M PBS,pH值7.4,含1 m M EDTA）使用超声波仪均质样品,在1000 x g下离心10 min,并使用DNA提取试剂盒（abcam,KIT0103）纯化上清液,核酸酶P1（Sigma-Aldrich,N8630-1VL）消化 DNA,1 M Tris 调整 pH 值到 7.5-8.5,每 100μg DNA加入1单位碱性磷酸酶（Sigma,P7640）,37℃孵育30 min,煮10 min,置于冰上备用。将8-OHdG ELISA试剂盒（Abcam,ab201734）复温至室温（20-25℃）,使用超纯水将Wash Buffer（1:10）和8-羟基-2-脱氧鸟苷:HRP结合单克隆抗体（1:100）的储存液稀释,制备工作液。按照ELISA指南配置标准液至终浓度为0（空白）、0.94、1.875、3.75、7.5、15、30、60 ng/mL,然后使用多通道移液器将标准液和样品液各50uL加入96孔板,并加入50uL 8-OHdG准备液（空白孔除外）,向空白孔中加入标准/样品稀释液和抗体稀释液各50uL（各孔总容积为100uL）,混匀后盖上96孔板并室温孵育1小时。使用1X洗涤缓冲液300uL充分洗涤96孔板共4次,再向每孔中加入100uL TMB底物并盖上第2个孔板盖,孵育30min后加入终止缓冲液100uL,酶标仪450nm波长读取吸光度值。制备标准曲线后计算获得各实验组8-OHdG数值,进行统计学数据分析。3.结果（1）皮层谷氨酸能神经元激活改善线粒体膜电位:流式细胞仪的荧光图谱显示脑出血（ICH）组比假手术组（Sham）荧光强度大的神经元细胞比率减少,说明脑出血损伤致线粒体膜电位下降（P＜0.0001）;hM3Dq组的荧光强度大的神经元细胞比率高于ICH组（P＜0.0005）;mCherry组荧光强度大的细胞比率同ICH组比较无显着差异（P＞0.05）。说明运动皮层谷氨酸能神经元激活减轻了脑出血对线粒体膜电位的损伤程度。（2）皮层谷氨酸能神经元激活上调细胞ATP水平:研究发现,化学遗传学技术兴奋运动皮层谷氨酸能神经元后,与Sham组相比,ICH组脑内血肿周边组织内ATP含量明显降低（P＜0.0001）,表明脑出血损伤了细胞ATP生成。同时,hM3Dq组同ICH组和mCherry组相比,具有显着差异（P＜0.0001）。该结果明确提示,化学遗传学技术兴奋谷氨酸能神经元可上调细胞内ATP水平,提示谷氨酸能神经元兴奋与能量生成存在偶联。（3）谷氨酸能神经元激活抑制DNA氧化损伤:本研究表明,ICH组脑组织内8-OHdG含量明显高于Sham假手术组,并且具有显着性差异（P=0.0012）,表明脑出血后氧化损伤明显增加,导致其中氧化损伤产物8-OH-dG升高;hM3Dq组的脑组织8-OHdG含量明显低于ICH组,并且具有显着性差异（P=0.0032）,表明运动皮层谷氨酸能神经元激活后,脑出血导致的氧化损伤得到明显的改善,其氧化损伤的产物8-OHdG下降;mCherry组中受试动物脑组织的8-OHdG含量同ICH组比较,无显着差异（P>0.05）。以上结果表明表明激活运动皮层谷氨酸能神经元,脑出血后自由基生成减少,减轻了 DNA氧化损伤。4.结论线粒体作为细胞的“能量工厂”,为细胞生物活动提供了绝大部分的ATP能量来源。而线粒体的正常功能又直接依赖着线粒体膜电位水平的正常。在细胞活力正常的情况下,线粒体膜电位处于正常高位,能够很好地为细胞提供各种生理活动所必需的能量。在细胞趋近于凋亡时最明显的特点就是往往伴随着线粒体膜电位的降低,线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的标志性事件之一。通过我们得到的关于脑出血后病灶周围组织在运动皮层谷氨酸能神经元不同兴奋性条件下ATP水平、线粒体膜电位、DNA氧化损伤产物8-OHdG等指标的变化趋势,我们可以确定大脑运动皮质谷氨酸能神经元激活具有维护线粒体正常功能的趋势,从而改善脑出血后小鼠的运动和认知功能。第四部分 化学遗传学激活运动皮层谷氨酸能神经元改善脑出血小鼠运动和认知功能恢复的海马DG区细胞增殖相关机制研究1.目的:揭示化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元促进脑出血小鼠认知功能改善的海马齿状回细胞增殖相关机制。2.方法海马齿状回（DG区）细胞增殖检测:实验各组小鼠腹腔注射CNO 21天后给予BrdU溶液（给药剂量为50mg/kg）腹腔注射,每天给药2次,给药间隔12小时,连续给药2天。在给药7d后采用氯胺酮和二甲苯嗪腹腔注射麻醉（氯胺酮100mg/kg,二甲苯嗪25mg/kg）,待角膜反射和肌张力消失后,给予4℃预冷4%多聚甲醛溶液（50mL 0.9%生理盐水预冲洗,然后250mL 4%多聚甲醛前固定,先快后慢）经左心室升主动脉灌注固定脑组织,冰盒内完整取出小鼠脑,保留海马部位,震动切片机上连续冠状切片,脑片厚度为40μm,每切5张选取1张,每个样本共收集12张,置于PBS待行BrdU免疫组化检测。将切片置于50%甲酰胺溶液中65℃水浴 2h,PBS（PH=7.4）洗片,2M 盐酸中 37℃孵育 30min,0.1M硼酸洗片10 min,PBS洗片后用30%H2O2室温孵育半小时,PBS洗片,血清封闭后室温孵育60min,弃血清洗片后加入BrdU一抗（1:1000）,4℃孵育24h,弃一抗并PBS洗片,加入生物素标记二抗（稀释度为1:100）,室温孵育30min,PBS洗片后再以ABC试剂室温孵育半小时,PBS洗片后DAB试剂显色,待染色满意后用ddH2O漂洗切片终止染色。将染好的切片平展贴于载玻片,晾干后中性树胶封片,指甲油固定。3.结果研究表明,ICH组脑出血后的海马DG区BrdU+细胞数低于Sham组,差异具有统计学意义（P＜0.05）,表明脑出血损伤了海马DG区的细胞增殖能力;hM3Dq组海马DG区BrdU+细胞数明显高于ICH组,并且具有显着性差异（P＜0.01）,表明运动皮层谷氨酸能神经元的激活,促进了海马DG区神经元的细胞增殖能力;ICH组同mCherry组比较,BrdU+细胞数量的差异没有统计学意义（P＞0.05）。通过以上结果,可以认为运动皮层M1区谷氨酸能神经元激活,可能促进了海马DG区细胞的增殖能力。4.结论通过化学遗传学方法激活运动皮层谷氨酸能神经元总体上促进了海马DG区神经元的细胞增殖能力,从而促进了脑出血小鼠的认知功能的改善。
臧静[6]（2020）在《经侧脑室和经鼻移植人少突胶质前体细胞对大鼠早产儿脑白质损伤模型神经修复作用的研究》文中提出目的脑白质损伤是早产儿常见的脑损伤形式之一,目前缺乏有效的治疗措施,幸存的患儿多遗留神经系统后遗症,包括脑瘫、认知或行为缺陷等。本文拟研究经侧脑室和经鼻途径移植人少突胶质前体细胞对大鼠早产儿脑白质损伤的治疗作用,为干细胞临床治疗早产儿脑白质损伤提供理论基础。方法1.模型的建立与鉴定:将3日龄的Sprague Dawley（SD）大鼠右颈总动脉离断并缺氧90min,建立早产儿脑白质损伤（PWMI）大鼠模型;采用行为学方法和组织病理学方法评估模型损伤程度;2.hOPCs的培养与鉴定:使用本实验室建立的人胎脑来源神经干细胞系诱导人少突胶质前体细胞（hOPCs）,通过特异性标志物的免疫荧光染色鉴定其纯度;3.移植路径的验证:造模后4天采用正常未标记的hOPCs经侧脑室移植,移植后7天取脑通过stem121免疫荧光染色示踪细胞以确认移植位点的准确性;造模后3天首先采用CM-Dil标记和正常未标记的hOPCs经鼻移植,移植后3天取脑示踪细胞以确认该路径的可行性。4.不同路径疗效研究:将40只3日龄SD大鼠分为假手术组、模型对照组、经侧脑室移植组和经鼻移植组,每组各10只;移植后12w通过stem121和抗人核（h NA）免疫荧光染色观察细胞的迁移,分化和增殖,应用行为学、Luxol FAST Blue髓鞘染色、髓鞘碱性蛋白（MBP）荧光染色和透射电镜等技术验证经侧脑室和经鼻移植髓鞘修复效果。结果1.早产儿脑白质损伤后,神经功能缺损明显。造模后第7天PWMI模型损伤侧扣带、胼胝体和外囊与正常侧对比,MBP阳性面积减少（P<0.05）,髓鞘丢失。HE染色结果显示患侧胼胝体和海马组织结构疏松,炎性细胞浸润。2.hOPCs生长状态良好,其特异性标志物A2B5、NG2、PDGFR-α、SOX10、O4、Olig2免疫荧光染色结果均为阳性,星形胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物Tuj-1免疫荧光染色结果极少为阳性。3.经侧脑室移植后4天在侧脑室内可检测到细胞。经鼻移植后3天在脑内损伤区皮质、海马和侧脑室附近可检测到细胞。4.细胞移植后12w,经侧脑室移植组细胞迁移广泛;部分分化为成熟的少突胶质细胞,未分化为星形胶质细胞和神经元;极少数细胞处于具有分裂能力的增殖状态。神经功能缺损明显改善,髓鞘结构紧密,髓鞘厚度增加;经鼻移植组神经功能缺损明显改善,髓鞘结构紧密,髓鞘厚度增加。结论1.SD大鼠早产儿脑白质损伤模型稳定、初步建立模型损伤程度判断的体系。2.经侧脑室移植的hOPCs可以促进髓鞘修复和再生,改善大鼠功能行为学。3.经鼻移植的hOPCs可以进入大鼠脑组织并迁移至损伤侧周围,促进髓鞘修复,改善大鼠功能行为学,证明经鼻移植路径是可行的。4.经鼻滴注hOPCs可能作为一种新型的治疗早产儿脑白质损伤的手段。
韩朝[7]（2020）在《丝素蛋白水凝胶结合NSC对缺血缺氧脑损伤的修复及姜黄素的干预作用研究》文中进行了进一步梳理背景来自实验动物疾病模型和早期临床试验的有力证据表明,神经干细胞移植是开发临床适用的外源性干细胞疗法的可行途径。基于目前在NSC生物学领域的进展和移植研究的积极成果,当代的观点是移植的NSC作为宿主本地“工厂”能够产生和分泌大量的免疫和神经营养因子,包括那些细胞外膜囊泡中包含因子,NSC移植物作为一种天然的生物制剂来源,能够调节和促进中枢神经系统（CNS）组织在急性或慢性组织损伤后的几个关键功能的恢复。但如何将NSC更为有效的定植于损伤器官组织,更加有效的让其分泌的因子作用于损伤微环境是神经组织工程亟待解决的问题。生物材料、细胞和刺激是神经组织工程的三个主要组成部分。组织工程神经材料已成为神经再生和功能恢复的一种潜在的替代自体神经移植物。各种材料的研究以改善特性和增强功能为出发点,生物可降解、生物相容、导电和免疫惰性的支架最终的目标是准确地模拟我们体内的细胞外基质,并通过各种聚合物、细胞和生长因子诱导出一种生物化学、地形学和电信号的组合,从而高效地进行神经定植及神经网络再生。选择合适的支架材料来促进神经细胞和非神经细胞的分化以及轴突的生长是神经组织工程整体设计策略的关键。在众多支架材料中,水凝胶已被证明是神经源性细胞培养和分化的良好选择。考虑到神经系统对再生的固有抗性,水凝胶已大量用于释放神经营养因子、神经生长抑制剂拮抗剂和其他神经生长促进剂。组内前期研究工作在静电力作用下获得的丝素蛋白水凝胶,电镜结果显示该凝胶具有纳米取向空隙,能够支持神经元的粘附生长。姜黄素广泛应用于各种疾病的防治。近年来,姜黄素作为神经源性和神经保护剂的应用受到越来越多的关注。姜黄素作为炎症条件因子,在神经干细胞的活力维持,神经向分化中的优势也得到了研究者的证实。目的本研究的目的分为三个方面:提取并稳定传代人胚胎来源神经干细胞,鉴定人神经干细胞的增殖能力、特异性标记物表达及分化能力,利用丝素蛋白水溶液来检验丝素蛋白是否影响神经干细胞的活力,增殖及分化能力,为后期利用丝素蛋白制备水凝胶支架结构奠定基础。通过静电场力作用丝素蛋白制备三维取向水凝胶,筛选适合的水凝胶浓度,结合NSC进行粘附培养、检测水凝胶结构对NSC的贴壁性,神经向分化能力的影响,尤其针对神经元轴突发育及伸展取向性进行研究。同步构建大鼠缺血缺氧性脑损伤模型,观察取向水凝胶及对照组无序水凝胶结合NSC移植治疗后的修复效果。探讨姜黄素作为炎症调控,多种信号激活的中药单体对NSC结合丝素水凝胶的神经组织工程组织的干预作用,为神经保护机制的研究和体外药物筛选提供新的思路。方法1.机械法消化提取人胚神经干细胞,无血清法悬浮培养法扩增神经球,CCK8检测NSC增殖能力,流式细胞仪及免疫荧光法检测神经干细胞干性标记物Nestin,Vimentin,Musashi-1,Notch,SOX1,SOX2,SSEA-1,CXCR4表达。经分化培养基培养至14天,经形态学,免疫荧光检测神经元Tub3、少突胶质GFAP、小胶质细胞的特异性标记蛋白O4的表达,明确分化能力。验证提取方法获得的神经干细胞属性。利用丝素蛋白水溶液（SF）加入到神经干细胞的培养基中,观察形态学,利用CCK8及PI染色检测SF对神经干细胞增殖及死亡的影响。免疫荧光染色检测SF对NSC干性的影响。2.静电法制备0.5%、1%、2%丝素蛋白水溶液并筛选合适的水凝胶浓度,将NSC在三维取向丝素蛋白水凝胶中分化培养,并将自然形成的无序丝素蛋白水凝胶作为对照组,Calcein-AM活细胞染色观察细胞形态,检测轴突的伸展方向,分化后经Tub3及GFAP染色并量化计算NSC向神经元及神经胶质细胞的分化比例。利用Fluo-AM试剂染色经流式细胞仪检测钙离子在两种细胞中的变化,共聚焦检测轴突蛋白Bassoon在分化后神经元突触中的表达,RT-PCR检测轴突相关基因GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp在两种细胞中的表达情况,分析有序水凝胶对轴突发育及轴突伸展的影响。3.构建大鼠缺血缺氧模型,选取三组损伤组（HI）、神经干细胞治疗组（NSC）及神经干细胞结合有序丝素蛋白水凝胶组（NSC+Silk）,每组10只。于出生后7天造模,10天治疗,28天行为学实验（圆柱筒、平衡木及水迷宫）,39天处死,固定、切片,进行GFAP免疫组化及Tub3、GFAP及Neu N的免疫荧光染色。获取海马区组织进行神经相关因子检测BDNF,NGF的ELISA检测。4.筛选1mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml不同浓度的姜黄素作用于NSC,利用CCK8染色法检测NSC细胞活力。Ed U染色法检测不同浓度Cur对NSC增殖能力的影响。Annexin-V/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡发生。检测不同浓度下Cur对NSC分化为神经细胞过程的影响,待分化培养12天,通过软件分析单位面积神经元数量及神经元轴突长度,收集分化培养6、12天的细胞样本检测GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp的mRNA表达,分析姜黄素对神经向分化的作用。结果1.经机械法原代提取的神经干细胞经7-10天可以形成标准的神经球集落,海马区的NSC增殖速度快,大小均匀,形态规则,指数生长期为5-7天,P1,3,5代的NSC增殖能力一致,倍增时间无显着性差异。获取的海马区NSC表达神经干细胞特异性标记物Nestin,Vimentin,Musashi-1,Notch,SOX1,SOX2,SSEA-1,CXCR4。能够在分化培养环境下分化为具有神经元形态细胞,并部分表达Tuj1、GFAP,神经元及神经胶质细胞特异性标记蛋白。2.对照组、两种浓度0.01%及0.1%的SF作用于NSC后倍增时间分别为:65.3h、76.2h及42.2h,检测SF对NSC细胞的死亡率影响,对照组,0.01%及0.1%分别为:31.5%,38.5%,40.6%,均不具有显着性差异。0.01%浓度的SF加入至培养基经免疫荧光染色检测Nestin,Vimentin,Musashi-1,Notch,SOX1,SOX2六个神经干细胞特异性标记物表达均为阳性。3.静电场力作用获得1%浓度的取向丝素蛋白水凝胶最适合于NSC悬浮及分化培养,对比无序水凝胶材料,分化后的神经细胞在有序水凝胶表面获得的轴突伸展方向一致性提高,有序丝素蛋白水凝胶能够提升神经元的分化比例为10.7±3.1个,照比无序材料的7.3±2.5个有显着性提高,神经元轴突长度统计分析无序凝胶为105.7±10.2nm,有序凝胶为400.3±25.3nm,神经元轴突长度进行量化并统计。能够显着提高神经元的轴突长度,并增高轴突内Bassoon蛋白及的表达,GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp基因的表达在分化12天时发生显着升高。4.成功建立大鼠缺血缺氧模型,经NSC及NSC+Silk治疗后,脑缺损区域减小,对比损伤组GFAP表达胶质细胞在皮层区、CA1区、DG区及CA3区表达下降,但NSC组与NSC+Silk组之间没有显着性变化。治疗后神经元细胞比例增高,海马区的GFAP比例下降,海马区Neu N的表达在治疗后升高,均据有统计学差异。平衡木试验结果及圆柱桶试验均发生治疗组有明显的修复效果,水迷宫试验结果显示NSC+Silk组有更好的修复效果。在治疗后1天海马组织内的BDNF及NGF因子含量即发生显着性升高,并在后期维持高表达状态。5.1mg/ml姜黄素作用于神经干细胞,不影响NSC增殖,大于5mg/ml的Cur抑制NSC增殖。1mg/ml Cur作用后,Ed U标记率增大但无统计学差异。2.5mg/ml,5mg/ml Cur作用后阳性率降低,表明NSC的增殖率下降。1mg/ml Cur与Cont组相比较没有显着变化。表明高浓度Cur能显着诱导NSC细胞发生凋亡。0.5mg/ml,1mg/ml,2.5mg/ml浓度不影响神经干细胞的分化形态,但5mg/ml,10mg/ml浓度明显抑制神经干细胞分化后贴壁细胞的伸展。经Cur处理,单位面积的神经元数量显着高于对照组,神经元轴突的长度也在分化12天时显着高于对照组。轴突相关基因GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp的mRNA表达检测的表达在12天时照比对照组有所升高。结论1.本实验部分成功提取了人胚胎来源的海马区原代NSCs,能够稳定进行扩增培养及特异性标记物鉴定,NSC能成功分化为神经元、胶质细胞,符合NSCs的基本属性和生物学特性;2.检测了丝素蛋白水溶液作为支架材料的生物安全性,评价了其对NSCs形态学、增殖能力及干性能力均无影响,体现了其良好的生物相容性。可作为后续的神经组织工程材料进行深入研究。1%浓度的丝素蛋白水凝胶能够支持神经干细胞增殖。静电作用获得的有序丝素蛋白水凝胶能够提高神经干细胞向神经元分化比例。有序丝素蛋白水凝胶在向神经细胞分化中能够增强神经元轴突GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp基因表达,促进神经突触的发育及迁移。有序丝素蛋白水凝胶结合NSC治疗大鼠脑缺血缺氧模型,对运动行为及学习记忆有修复功效。3.高浓度（>2.5mg/ml）姜黄素导致NSC细胞死亡,低浓度（<1mg/ml）促进NSC细胞增殖。1mg/ml姜黄素能够促进人神经干细胞向神经元分化,提高分化效率,提高分化后神经元突触长度及突触相关基因GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp表达。
时晓东[8]（2019）在《HIF-1α在骨髓间充质干细胞的过表达对创伤性脑损伤的影响》文中认为研究背景创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）为神经外科中最为常见的疾病之一,通常是由直接或间接的对脑的机械破坏所引起,具有高致残率和高致死率。近几年的统计资料显示,随着城市化和工业化进程的不断加快,脑损伤的发生率也呈逐年上升趋势。尽管现代医疗技术的发展和医疗水平的提高使临床上颅脑损伤的诊治和相关的基础研究取得了突破性进展,但该病造成的患者死亡率和致残率依然居高不下。因此寻求行而有效的治疗TBI的手段极为重要。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）作为间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）的一种,为一种多能干细胞,其自身具有极强的自我更新能力和分化潜能。因此BM-MSCs为干细胞移植治疗中枢神经系统损伤的理想种子细胞。BM-MSCs移植入宿主体内后能够继续存活并向神经细胞分化,分化后的神经元具有相应的生物学活性,从而能够替代死亡的神经元,同时BM-MSCs还能够迁移至中枢神经系统损伤区域,并在该处参与损伤修复过程,促进中枢神经系统功能的恢复、增强内源性细胞增殖、促进血管生成、减少病灶区域等。BM-MSCs移植已被证实能在包括创伤性脑损伤在内的中枢神经系统损伤的治疗中发挥有益作用。除此之外,还可以通过改造BM-MSCs以过表达其中有益于治疗的基因以增强BM-MSCs移植的疗效。BM-MSCs治疗已是TBI细胞治疗的热点之一,如何使BM-MSCs过表达对治疗有益的基因,以增强治疗效果更是TBI治疗的新兴方向,即以BM-MSCs作为有效的基因载体,用某种病毒等转染BM-MSCs,以使BM-MSCs能过表达有益治疗的基因,然后将转染后的BM-MSCs移植入脑内以达到加强TBI的治疗疗效。国内外已有学者把基因治疗与干细胞移植的治疗方法用于TBI模型动物中,并取得·定的可喜的成效。但口前尚无通过改造BM-MSCs过表达HIF-1α基因以增强TBI治疗效果的相关研究。大量研究表明,低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）在由缺氧所导致的细胞应答过程中发挥着重要作用。HIF-1α是一种转录因子,可以调节血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）的转录过程,同时对血管生成和神经再生均具有促进作用,同时有效调控糖酵解途径,促进红细胞生成,提高细胞的生存能力,最终发挥神经保护作用。VEGF是内皮细胞的促分裂原,能够具有通过与酪氨酸激酶受体识别并结合,进而发挥促进内皮细胞增殖、迁移和新血管形成的作用。有报道显示,VEGF还能够在体外和体内刺激神经元前体细胞增殖。还有研究发现,将外源性VEGF作用于创伤性脑损伤小鼠模型,能够显着增加脑室下区和周围皮质中增殖细胞的数量,同时还能在创伤性脑损伤后减小病变体积。EPO为生物机体中的一种与造血相关的生长因子,可以在组织细胞缺氧期间增加氧气的利用率。有研究证实,EPO在血管生成和神经发生中扮演重要角色。过去的研究发现,EPO治疗可以有效减少海马神经元的损伤,并以剂量依赖的方式增强创伤性脑损伤大鼠模型中受损皮层和海马的血管生成和神经再生。目前的研究已经证实,间充质干细胞移植对中枢神经系统损伤的治疗和功能的保护具有积极作用。同时,HIF-1α mRNA和蛋白的含量在发生创伤性脑损伤后也显着上调,提示HIF-1α对创伤性脑损伤后的神经具有保护作用,但MSCs与HIF-1α之间是否存在协同作用需进一步验证。在本实验中,我们首次选取BM-MSCs,非其他来源的MSCs,作为治疗的干细胞,通过腺病毒转染BM-MSCs并使其过表达HIF-Iα基因后移植入创伤性脑损伤小鼠模型,旨在探讨BM-MSCs对TBI模型小鼠的神经功能是否有修复作用以及过表达HIF-1α基因能否促进上述效应。研究目的本实验通过腺病毒转染BM-MSCs并使其过表达HIF-Iα基因后移植入创伤性脑损伤小鼠模型,探讨BM-MSCs对TBI模型小鼠的神经功能是否有修复作用以及过表达HIF-lα基因能否促进上述效应。1.探讨能否通过腺病毒转染的方法在BM-MSCs中过表达HIF-1α基因;2.探讨BM-MSCs能否作为TBI模型小鼠的种植细胞;3.探讨BM-MSCs移植入TBI模型小鼠后,TBI模型小鼠在各时期的行为学改变、神经再生及细胞增殖情况;4.探讨BM-MSCs移植入TBI模型小鼠后,TBI模型小鼠在各个时期脑组织病变体积、脑含水量变化及VEGF、EPO的mRNA和蛋白的表达情况;5.探讨过表达HIF-1α的BM-MSCs移植入TBI模型小鼠后,TBI模型小鼠在各时期的行为学改变、神经再生及细胞增殖情况;6.探讨过表达HIF-1α的BM-MSCs移植入TBI模型小鼠后,TBI模型小鼠在各个时期脑组织病变体积、脑含水量变化及VEGF、EPO的mRNA和蛋白的表达情况。实验动物与方法设计并构建含HIF-1α的腺病毒载体及相应对照载体,分别将之转染293细胞,收集细胞培养上清中的腺病毒并转染BM-MSCs,检测细胞中HIF-1α mRNA和蛋白的表达,以证实HIF-1α过表达的BM-MSCs构建成功。我们用体重相近的若干只BALB/c小鼠（6-8周龄）作为实验动物,采用脑皮质撞击法建立创伤性脑损伤小鼠模型（中度脑损伤）,小鼠完全清醒后通过神经功能缺损评分（Modified neurologicαl severity score,mNSS）（附图表 1）评估各组小鼠的神经系统功能;评分为7-12分为中度脑损伤,并表示建模成功;在模型建立6h后经尾静脉注入HIF-1α过表达的BM-MSCs,同时设空白对照组、注射生理盐水的对照组、注射BM-MSCs组,在第1、3、7、10、14天时检测小鼠神经功能缺损评分。在TBI建立后第7天时处死小鼠,检测大脑含水量和病变体积。分别采用BrdU和和BrdU/NeuN进行免疫荧光染色,检测小鼠脑组织中BrdU-L和BrdU/NeuN+细胞数量,明确HIF-1α过表达的BM-MSCs对TBI后细胞增殖和神经再生的影响。检测各组小鼠脑组织中VEGF、EPO mRNA和蛋白的表达情况。本研究所有的统计分析均使用SPSS22.0软件进行。数据结果表示为平均值±标准差（x±s）。采用卡方检验进行两组之间的比较,并使用Tukey检验的事后对比的单因素方差分析来比较多组的参数。P<0.05被认为有显着统计学差异。研究结果1.HIF-1α在BM-MSCs中的过表达情况我们把HIF-1α转染入BM-MSCs后,用RT-PCR和蛋白质免疫印迹试验分别检测各组的HIF-1α mRNA和蛋白表达的情况,结果如图1、2所示。图1显示,Ad.HIF-1α组的HIF-1α mRNA明显高于对照组和Ad.null组。图2显示Ad.HIF-1α组的HIF-1α蛋白的表达量是最高的,蛋白定量分析进一步显示,Ad.HIF-1α组的HIF-1α蛋白含量是对照组和Ad.null组的3.5倍左右。这些结果证实,HIF-1α成功转染到BM-MSCs中,并导致HIF-1α蛋白水平升高。即HIF-1α过表达的BM-MSCs构建成功。2.TBI小鼠移植治疗后神经功能及脑损伤的改变TBI模型小鼠体内被注射入过表达HIF-1α的BM-MSCs,然后通过mNSS评分评估其神经功能变化。在移植后的1,3,7,10,14天评估TBI模型小鼠的mNSS评分。在四组（空白对照组、Vehicle、MSC组和HIF-1α MSC组）的对照中,我们发现过表达HIF-1α的HIF-1α MSC组的TBI模型小鼠的mNSS评分改善最明显,提示神经功能的恢复程度最大,其次是MSC组（如图3所示）,而HIF-1α MSC组与MSC组的mNSS评分也出现显着性差异。这些结果显示,BM-MSCs可改善TBI模型小鼠的神经功能,而过表达的HIF-1α可促进这一效应。各组小鼠处死后取脑,分别测量脑损伤体积及大脑含水量。在四组中,Vehicle组的病变体积及含水量均为最大,MSC组和HIF-1α MSC组依次下降,并且损伤脑组织体积与损伤脑组织含水量呈同步性（图4、5）。实验结果提示:BM-MSCs移植能起到减小脑损伤体积、减轻脑水肿等保护脑组织的功能,而HIF-1α在BM-MSCs中的过表达可增强BM-MSCs对TBI诱导的脑损伤的保护作用。3.TBI小鼠移植治疗后神经发生及细胞增殖的变化TBI主要导致脑细胞缺失及神经坏死。在TBI小鼠移植治疗7天后,对脑组织进行染色,来评估移植的BM-MSCs对神经元及神经细胞增殖产生的影响。为了分析血管生成,在损伤边界区和齿状回中计数BrdU+细胞。为了分析神经再生,我们计算齿状回及其子区域中的BrdU+细胞和NeuN/BrdU+共标记细胞。阳性细胞的定量显示,MSC组有更多的阳性细胞,几乎是Vehicle组中的2倍（如图6所示）。同时,HIF-1α MSC组与MSC组相比,阳性细胞数量也存在显着性差异（如图7所示）。这些结果提示BM-MSCs移植能引起损伤区神经元及神经细胞增殖相关的阳性细胞的增多,而此种效应在HIF-1 α MSC组中最为明显,意味着过表达HIF-1α能够促进TBI模型小鼠神经元的再生及神经细胞的增殖。4.TBI小鼠移植治疗后VEGF、EPO mRNA和蛋白表达水平的改变部分实验指出,BM-MSCs通过促进血管生成、改善损伤区域微循环而起到促进神经功能恢复的作用,为验证BM-MSCs是否具有促进血管生成等作用,我们通过RT-PCR及蛋白质免疫印迹试验检测VEGF、EPO的mRNA和蛋白的表达水平。结果显示:与Vehicle组相比,MSC组与HIF-1α MSC组的VEGF、EPO mRNA和蛋白的表达水平显着增高（P<0.05）,而HIF-1α MSC组的差异性更明显（如图8、9所示）。因此,HIF-1α过表达能够加增强BM-MSC对VEGF和EPO表达的诱导功能。研究结论1.BM-MSCs移植入TBI小鼠脑内后,mNSS评分下降,细胞增殖及神经再生增多,提示其可作为TBI模型小鼠的种植细胞并能起到修复神经作用。2.BM-MSCs移植入TBI小鼠脑内后,TBI模型小鼠脑组织的病变体积和脑含水量降低,同时,同侧皮质中VEGF、EPO mRNA和蛋白的表达水平增高,提示BM-MSCs移植后通过刺激血管生成和神经再生降低脑损伤程度。3.HIF-1α过表达的BM-MSCs移植入TBI模型小鼠脑内后,mNSS评分进一步下降,细胞增殖及神经再生继续增多,小鼠脑组织的病变体积和脑含水量下降及VEGF、EPO mRNA和蛋白的表达水平的增高较BM-MSCs明显,证明HIF-1α可以在BM-MSCs中过表达,并且HIF-1α基因修饰的BM-MSCs具有更高的增殖活力,能够显着提高BM-MSCs的治疗效果。4.HIF-1α过表达的BM-MSCs移植可作为一种新的治疗创伤性脑损伤的方法,也可作为缺血缺氧性脑病的细胞、基因联合治疗的科研基础。同时,提示我们可以通过病毒感染等方法人为上调MSCs中有益于治疗的基因,以达到提高治疗效果的目的。
马征[9]（2019）在《新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后bFGF对神经元的作用及其机制研究》文中研究指明[目 的]探讨新生鼠缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）后bFGF对神经元的保护作用及其分子机制,为新生儿缺氧缺血性脑病（Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy,NHIE）提供潜在治疗靶标的新证据。[方 法]体内实验:建立了新生7日龄Sprague-Dawley（SD）大鼠的缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型,通过脑大体观、TTC染色、Zea-longa评分、HE染色和组织荧光染色观察缺氧/缺血（Hypoxic-ischemic,HI）后大鼠急性期（24h）的脑损伤情况。然后经NSS评分、转棒、水迷宫、矿场及Y迷宫检测大鼠HI后远期（60d）的运动、空间记忆、自主探寻及学习记忆功能是否出现障碍,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）检测HI后24h大鼠脑组织中bFGF的mRNA和蛋白质相对表达量。体外实验:培养大鼠原代皮质神经元并经氧-葡萄糖剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）处理建立了体外HI模型,并验证了 bFGF的mRNA在体外的相对表达量变化是否与体内相同。把化学合成bFGF-siRNA三个有效片段转染PC12细胞,利用qRT-PCR筛选出最有效干扰片段,然后把最有效的片段转染原代皮质神经元,成功的干扰bFGF,通过MTT检测、细胞免疫荧光染色评价OGD前后bFGF沉默对原代皮质神经元的数量、细胞活力、轴突长度及胞体面积的影响。最后在GENEMANIA网站预测了 bFGF密切相关的分子,经qRT-PCR和Western Blot检测与bFGF相关分子的表达变化。[结 果]体内结果:1、与假手术（Sham）组比较,HI后24h大鼠出现脑肿胀、梗死面积扩大、Zea-longa评分升高（运动能力严重下降）及右侧（梗死侧）皮质神经元的数量减少,差异均有统计学意义（P<0.05）。2、HI后24h经HE染色发现右侧皮质神经元出现空泡化、核固缩、排列紊乱且胞浆疏松淡染。3、与Sham组相比,HI后60d大鼠的NSS评分升高,转棒的时间变短,在水迷宫找到隐藏在水下平台的时间变长、撤掉台子后跨原平台区域的次数变少、原平台所在象限区滞留的时间和路程变短,在矿场中站立时间和理毛时间变短,在Y迷宫找到食物臂的正确率和时间减少、停留错误臂的错误率和时间延长,差异均有统计学意义（P<0.05）。4、HI后24h大鼠右侧皮质bFGF的mRNA和蛋白质的水平均升高（P<0.05）。体外结果:1、与正常组（Normal组）,缺氧（Hypoxia）后24h和OGD后24h的bFGF mRNA相对表达量显着升高（P<0.05）。2、与阴性对照组（NC组）相比,三个特异性bFGF siRNA片段-F1,F2和F3中F3片段的mRNA相对表达量最低（P<0.05）。3、把F3片段转染原代皮质神经元,结果显示在正常条件和OGD条件下,与NC组相比,bFGF-si组的bFGF mRNA相对表达量均降低（P<0.05）。4、OGD前后bFGF沉默均导致神经元细胞数量减少、细胞活力下降,胞体面积增大和轴突长度缩短,与NC组或Normal组相比均有显着性差异（P<0.05）。5、与OGD+NC组相比,在OGD+bFGF-si组中进一步减少了细胞数量并增加了细胞胞体大小（P<0.05）,但没有减少轴突长度。6、通过GENEMANIA预测出与bFGF密切相关的分子是神经生长因子（NGF）和白细胞介素-1β（IL-1β）。7、正常条件下NGF和IL-1β的mRNA相对表达量在bFGF-si组中较NC组均下调（P<0.05）,并在OGD组中mRNA和蛋白相对表达量较Normal组均上调（P<0.05）。然而,在OGD+bFGF-si组中,与OGD+NC组相比NGF的mRNA和蛋白相对表达量被下调而IL-1β被上调（P<0.05）。[结 论]bFGF表达水平在HI后24h右侧皮质中升高。在OGD条件下,bFGF升高对维持原代皮质神经元的正常细胞数量和形态至关重要,且可能与NGF上调和IL-1β下调有关。该研究的结果将为未来治疗HIE的疗法提供新的见解和分子基础。
任登鹏[10]（2018）在《干细胞活性因子保护大鼠损伤神经干细胞及改善神经功能的研究》文中研究表明目的:研究骨髓间充质干细胞（BMSCs）源性的干细胞活性生长因子对体外培养的神经干细胞增殖、分化及低氧耐受的影响,以及对大鼠脑创伤模型的体内损伤修复效果,为未来脑创伤神经功能恢复提供理论指导和实验依据。方法:（1）原代分离培养SD大鼠BMSCs,流式细胞术测定特异性的表面标志蛋白的表达。（2）酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测培养48 h的BMSCs条件培养液中BDNF、IGF-1、VEGF和NGF的蛋白质水平,了解BMSCs条件培养液中的主要干细胞活性因子的表达水平。（3）原代分离培养大鼠的神经干细胞（NSCs）,将其培养于含间充质干细胞活性因子的培养环境中,观察细胞克隆球的生长情况,以及其向神经元和神经胶质细胞分化潜能;建立氧糖剥夺模型,检测上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）含量,观察干细胞活性因子对低氧应激环境下的NSCs的保护作用。（4）制作冲击性脑损伤大鼠模型,给予干细胞活性因子治疗,观察脑损伤大鼠术后一般情况,水迷宫实验检测实验动物的神经功能恢复情况。（5）行HE染色进行大体病理组织学观察;干/湿重法检测脑水肿程度。（6）荧光定量PCR方法检测实验大鼠脑组织中目标基因IL-1β、Gap43、Jun、和TNF的表达;免疫组织荧光方法检测目标蛋白BrdU+NeuN、BrdU+GFAP的表达;Western Blot方法检测目的蛋白NF-κBp65在脑组织中的表达情况。结果:（1）流式细胞术检测结果显示,本实验所培养的第四代骨髓源性的细胞表达间充质干细胞的标记蛋白CD90和CD105的阳性表达率均高于95%;同时表达造血干细胞标记物CD34的阳性表达率和成熟造血细胞的标志蛋白CD45的阳性表达率均低于5%。证实所培养的细胞为高纯度的BMSCs,符合实验要求。（2）酶联免疫吸附测定实验结果显示,第4代至第14代BMSCs表达VEGF水平始终维持在400 pg/ml浓度以上,IGF-1的水平一直维持在100pg/ml-150 pg/ml浓度之间,NGF维持在380 pg/ml-430 pg/ml浓度之间,BDNF的水平维持在310 pg/ml-330 pg/ml浓度之间。（3）原代分离培养的大鼠神经干细胞（NSCs）培养于含BMSCs细胞活性因子的培养环境中,细胞克隆球较单纯NSCs培养基培养具有更快的生长速度;并且BMSCs细胞活性因子能够诱导NSCs更容易向神经元分化;氧糖剥夺模型实验结果显示,BMSCs细胞活性因子能够增强NSCs对低氧应激的耐受能力。（4）冲击性脑损伤大鼠模型结果显示,假手术组实验大鼠在麻醉清醒后精神状态迅速好转,大鼠体重较术前无明显变化;脑损伤模型（TBI）组实验动物能够出现明显偏瘫,主要表现为创伤对侧肢体不活动或活动明显减少,体重于手术初期下降明显,后稍有回升;TBI+干细胞活性因子治疗组实验动物亦出现明显偏瘫现象,体重于手术初期亦下降明显,但在5天之后回升较快,最终体重优于TBI组。水迷宫实验检测结果显示干细胞活性因子治疗组实验动物具有更佳的神经功能恢复能力。（5）HE染色实验结果显示,假手术组脑组织完整,结构正常,细胞形态符合正常大鼠脑组织组织与解剖结构特点;TBI组创伤侧大鼠脑组织可见明显创伤灶,脑组织结构紊乱;活性因子治疗组创伤侧大鼠脑组织同样可见细胞排列较TBI组相对更为规整。干/湿重法检测结果显示TBI组脑组织水肿程度最高,活性因子治疗组的脑水肿程度明显低于TBI组。（6）荧光定量PCR方法检测结果显示,TBI组实验大鼠脑组织中IL-1β、Jun和TNF的表达水平明显高于假手术组,干细胞活性因子治疗能降低TBI后上述因子的mRNA表达水平;实验大鼠脑组织中GAP43的表达水平于TBI后第3天时处于较低水平,随后逐渐升高,干细胞活性因子治疗后能增加GAP43的表达水平;免疫组织荧光方法检测结果显示,脑创伤大鼠创伤侧海马BrdU、NeuN和GFAP的表达水平均明显高于假手术组,活性因子治疗组则可进一步提高BrdU/NeuN的蛋白质表达水平;Western Blot方法检测结果显示NF-κBp65在TBI组实验大鼠脑组织中的蛋白表达水平明显高于假手术组,活性因子治疗组则可降低该蛋白的表达水平。结论:（1）培养第4代至第14代的BMSCs始终维持表达较高水平的VEGF、IGF-1、NGF和BDNF,对周围细胞具有持续的细胞营养作用。（2）BMSCs细胞活性因子能够促进NSCs克隆球的增殖,诱导NSCs更容易向神经元分化,此外BMSCs细胞营养因子能够增强NSCs对低氧应激的耐受能力。（3）BMSCs细胞活性因子能够促进内源性的NSCs动员,并诱导NSCs易于向神经元分化。（4）BMSCs细胞活性因子能够帮助脑创伤大鼠增进学习和记忆功能的恢复,改善运动能力,降低炎症水平,抑制细胞凋亡。
二、植入脑源性神经营养因子载体细胞对幼鼠缺氧缺血性脑损伤后记忆的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、植入脑源性神经营养因子载体细胞对幼鼠缺氧缺血性脑损伤后记忆的影响（论文提纲范文）
（1）hUC-MSCs对缺氧缺血脑损伤幼鼠学习记忆的影响及机制初步探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物及饲养 |
| 1.2 实验仪器及耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 实验动物分组 |
| 2.2 HIBD幼鼠模型建立 |
| 2.3 hUC-MSCs治疗 |
| 2.4 水迷宫实验 |
| 2.5 脑组织取材及石蜡切片制备 |
| 2.6 HE染色 |
| 2.7 免疫组织化学染色 |
| 2.8 TUNEL凋亡染色 |
| 2.9 组织蛋白提取及冻存 |
| 2.10 组织蛋白浓度检测 |
| 2.11 蛋白印迹法(WB) |
| 3.统计分析 |
| 结果 |
| 1.实验时间流程图 |
| 2.hUC-MSCs干预促进学习记忆功能改善 |
| 3.hUC-MSCs干预减轻脑组织损伤 |
| 4.hUC-MSCs干预促进神经元的存活 |
| 5.hUC-MSCs干预减轻神经细胞凋亡 |
| 6.hUC-MSCs干预上调BDNF、p-CREB的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 BDNF-ERK-CREB在干细胞治疗脑损伤疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）免疫与炎症反应在脑卒中动物模型中的影响与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstracts |
| 缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 PTx引发的炎性反应对脑卒中动物模型的影响与机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组小鼠神经功能损伤情况 |
| 2.2 各组小鼠中枢免疫细胞浸润分布 |
| 2.3 各组小鼠脑氧化应激对比 |
| 2.4 各组小鼠血脑屏障染色 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 2型固有淋巴细胞对缺血性脑卒中动物模型的影响与机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 缺血性脑卒中后小鼠脑与外周ILC2数量变化 |
| 2.2 ILC2对缺血性脑卒中小鼠神经功能与脑梗死体积的影响 |
| 2.3 缺血性脑卒中后第3天小鼠少突胶质细胞是IL-33的主要来源 |
| 2.4 IL-33能够扩增ILC2细胞数量,减少缺血性脑卒中小鼠神经功能缺损与脑梗死体积 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脑血管病的发病机制、诊断与治疗方面的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）基于“肾脑相关”理论六味地黄膏膏摩干预对脑瘫幼鼠皮层损伤修复及BDNF/TrkB表达的影响（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 中英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 “肾脑相关”理论的渊源及发展 |
| 2 脑瘫的病因病机 |
| 3 齐鲁小儿推拿治疗脑瘫的辨证选穴规律 |
| 4 六味地黄膏膏摩治疗脑瘫的理论基础及优势 |
| 5 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 六味地黄膏膏摩对脑瘫幼鼠皮层损伤修复的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 仪器 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 六味地黄膏的制作 |
| 1.1.5 动物分组与造模 |
| 1.1.6 干预方法 |
| 1.1.7 标本处理 |
| 1.1.8 指标检测 |
| 1.1.9 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 2 六味地黄膏膏摩对脑瘫幼鼠BDNF/TrkB表达的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 六味地黄膏的制作 |
| 2.1.5 动物分组与造模 |
| 2.1.6 干预方法 |
| 2.1.7 标本处理 |
| 2.1.8 指标检测 |
| 2.1.9 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 血清及皮层BDNF表达水平的比较 |
| 2.2.1.1 血清BDNF含量的比较 |
| 2.2.1.2 皮层BDNF荧光表达水平的比较 |
| 2.2.1.3 皮层BDNF蛋白表达水平的比较 |
| 2.2.2 血清及皮层TrkB表达水平的比较 |
| 2.2.2.1 血清TrkB含量的比较 |
| 2.2.2.2 皮层TrkB荧光表达水平的比较 |
| 2.2.2.3 皮层TrkB蛋白表达水平的比较 |
| 讨论 |
| 1 现代医学对脑瘫的认识 |
| 1.1 脑瘫的病因 |
| 1.2 脑瘫的临床表现及危害 |
| 1.3 现代医学治疗脑瘫的现状 |
| 2 中医学对脑瘫的认识 |
| 2.1 脑瘫的病因病机及治则 |
| 2.2 脑瘫的辨证分型 |
| 2.3 中医治疗脑瘫的现状 |
| 3 六味地黄膏膏摩疗法治疗脑瘫的可行性分析 |
| 4 六味地黄膏膏摩补肾益脑的作用机制分析 |
| 5 六味地黄膏膏摩促进脑瘫幼鼠脑损伤修复的作用途径分析 |
| 6 六味地黄膏膏摩对脑瘫幼鼠皮层神经元形态数量影响的分析 |
| 7 六味地黄膏膏摩对脑瘫幼鼠BDNF/TrkB表达影响的分析 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 研究的不足及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 成果及获奖 |
（4）NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要操作仪器 |
| 2.1.4 主要溶剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织来源、细胞提取和培养 |
| 2.2.2 NSCs的传代培养 |
| 2.2.3 OECs培养 |
| 2.2.4 NSCs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.5 OECs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.6 细胞活力测定 |
| 2.2.7 细胞冻存 |
| 2.2.8 细胞复苏 |
| 2.3 动物实验及样本检测 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要仪器 |
| 2.3.4 主要试剂配制 |
| 2.3.5 庆大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法 |
| 2.3.6 实验动物分组及给药 |
| 2.3.7 ABR检测大鼠听力阈值 |
| 2.3.8 听觉耳动反射检测 |
| 2.3.9 制作切片 |
| 2.3.10 切片染色 |
| 2.3.11 耳蜗免疫荧光染色 |
| 2.3.12 TUNEL法(原位切口末端标记法)检测凋亡细胞 |
| 2.3.13 免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞 |
| 2.3.14 Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达 |
| 2.4 统计方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 细胞的形态观察及鉴定 |
| 3.1.1 NSCs的培养观察及鉴定 |
| 3.1.2 OECs的培养观察和鉴定 |
| 3.2 各组大鼠体重变化结果 |
| 3.3 大鼠听觉耳动反射检测阈值结果 |
| 3.4 各组大鼠ABR阈值变化结果 |
| 3.5 HE染色结果 |
| 3.6 耳蜗免疫荧光染色观察结果 |
| 3.6.1 耳蜗荧光标记NSC结果 |
| 3.6.2 荧光标记OEC观察结果 |
| 3.7 TUNEL法检测凋亡细胞结果 |
| 3.7.1 各组TUNEL阳性细胞数比较 |
| 3.7.2 各组MOD值比较 |
| 3.8 免疫组化检测结果 |
| 3.9 Western-blot检测各组蛋白表达水平结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 实验性感音神经性耳聋动物模型的制备与机制探究 |
| 4.2 神经营养因子减轻SNHL内耳神经损伤后相关机制 |
| 4.2.1 BDNF对 SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.2.2 NT-3对SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.3 细胞移植抑制耳蜗损伤细胞凋亡机制探索 |
| 4.3.1 Caspase结构、功能与促耳蜗细胞凋亡机制探究 |
| 4.3.2 Bcl-2 结构、功能和抗耳蜗细胞凋亡机制探析 |
| 4.3.3 细胞联合移植激活Bcl-2,抑制Caspase、Bax表达路径保护损伤耳蜗细胞探究 |
| 4.4 细胞联合移植上调神经营养因子,抑制细胞凋亡 |
| 4.5 神经性耳聋常见病因概述 |
| 4.6 神经性耳聋治疗方法概述 |
| 4.7 关于NSC和 OEC的取材、培养与鉴定探究 |
| 4.7.1 NSC的组织取材和分离 |
| 4.7.2 NSC的培养和鉴定方法选择 |
| 4.7.3 OECs的组织取材和分离 |
| 4.7.4 OECs的培养与鉴定选择 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（5）化学遗传学靶向激活运动皮层谷氨酸能神经元对脑出血小鼠运动和认知功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建hM3Dq-mCherry稳定表达的小鼠运动皮层谷氨酸能神经元激活动物模型及其生物学特征验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 化学遗传学激活运动皮层谷氨酸能神经元对脑出血小鼠运动和认知功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 化学遗传学激活运动皮层谷氨酸能神经元改善脑出血小鼠运动和认知功能恢复的线粒体相关机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 化学遗传学激活运动皮层谷氨酸能神经元改善脑出血小鼠运动和认知功能恢复的海马DG区细胞增殖相关机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述 脑出血治疗策略的研究现状和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）经侧脑室和经鼻移植人少突胶质前体细胞对大鼠早产儿脑白质损伤模型神经修复作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验溶剂配制 |
| 2.1.5 实验器材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 早产儿脑白质损伤模型的制备 |
| 2.2.2 早产儿脑白质损伤模型的验证 |
| 2.2.2.1 神经反射评估 |
| 2.2.2.2 MBP免疫荧光染色 |
| 2.2.2.3 HE染色 |
| 2.2.3 人少突胶质前体细胞(hOPCs)的培养与鉴定 |
| 2.2.4 细胞荧光染料标记 |
| 2.2.5 免疫抑制剂的使用 |
| 2.2.6 经侧脑室移植细胞 |
| 2.2.7 经鼻移植细胞 |
| 2.2.8 Luxol FAST Blue髓鞘染色 |
| 2.2.9 免疫荧光染色 |
| 2.2.10 免疫组织化学染色 |
| 2.2.11 透射电镜 |
| 2.2.12 行为学测试 |
| 2.2.12.1 水迷宫实验 |
| 2.2.12.2 除粘实验 |
| 2.2.12.3 圆筒实验 |
| 2.2.12.4 步态实验 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 PWMI模型的建立 |
| 3.1.1 术后一般情况观察 |
| 3.1.2 术后神经反射评估 |
| 3.1.3 术后HE染色 |
| 3.1.4 术后MBP免疫荧光染色 |
| 3.2 人少突胶质前体细胞的培养与鉴定 |
| 3.2.1 光镜下观察细胞生长情况 |
| 3.2.2 细胞荧光染料标记 |
| 3.2.3 细胞免疫荧光染色鉴定 |
| 3.3 hOPCs经侧脑室和经鼻移植后急性期细胞示踪 |
| 3.4 hOPCs经侧脑室移植12w后 LFB髓鞘染色结果 |
| 3.5 hOPCs经侧脑室移植12w后迁移、分化和增殖结果 |
| 3.5.1 hOPCs经侧脑室移植12w后迁移示踪 |
| 3.5.2 hOPCs经侧脑室移植12w后增殖结果 |
| 3.5.3 hOPCs经侧脑室移植12w后分化鉴定 |
| 3.6 经侧脑室和经鼻移植后髓鞘修复情况 |
| 3.6.1 MBP免疫荧光染色 |
| 3.6.2 透射电镜结果 |
| 3.7 行为学测试结果 |
| 3.7.1 水迷宫实验 |
| 3.7.2 除粘实验 |
| 3.7.3 圆筒实验 |
| 3.7.4 步态实验 |
| 3.7.4.1 经侧脑室移植 12w 后步态实验结果 |
| 3.7.4.2 经鼻移植 12W 后步态实验结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 综述 经鼻移植干细胞治疗神经系统疾病的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 在攻读硕士学位期间公开发表的论文与参加的项目 |
| 致谢 |
（7）丝素蛋白水凝胶结合NSC对缺血缺氧脑损伤的修复及姜黄素的干预作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 人神经干细胞原代提取及丝素蛋白作为神经组织工程材料安全性分析 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 培养基配置 |
| 2.方法 |
| 2.1 人神经干细胞(hNSC)的原代培养、传代、冷冻、复苏 |
| 2.2 NSC分化实验 |
| 2.3 细胞增殖实验 |
| 2.4 神经干细胞免疫荧光鉴定 |
| 2.5 流式细胞仪检测NSC死亡率 |
| 2.6 统计学分析 |
| (三)结果 |
| 1.不同脑区神经干细胞原代提取形态学 |
| 2.海马区神经干细胞形态学 |
| 3.神经干细胞增殖能力 |
| 4.神经干细胞特异性标记物表达 |
| 5.分化后神经细胞形态及标记物表达 |
| 6.丝素蛋白水溶液对神经干细胞形态及生长活力的影响 |
| 7.丝素蛋白水溶液对NSC死亡率的影响 |
| 8.丝素蛋白水溶液对NSC干性的影响 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 第二部分 丝素蛋白水凝胶通过影响NSC的轴突发育治疗大鼠缺血缺氧性脑损伤 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 2.方法 |
| 2.1 丝素蛋白水凝胶制备及细胞结合培养 |
| 2.2 分化后神经细胞轴突长度及相关基因检测 |
| 2.3 NSC结合水凝胶对缺血缺氧模型的治疗 |
| (三)结果 |
| 1.不同浓度丝蛋白凝胶材料对神经干细胞悬浮生长状态的影响 |
| 2.分化NSC在丝素蛋白水凝胶上的形态学 |
| 3.分化NSC在丝素蛋白水凝胶上的神经元与神经胶质比例 |
| 4.丝素蛋白水凝胶培养后神经元轴突长度 |
| 5.丝素蛋白水凝胶培养后Bassoon蛋白表达 |
| 6.有序丝素蛋白水凝胶对NSC突触可塑性的影响 |
| 7.SD大鼠缺血缺氧模型构建及NSC治疗 |
| 8.NSC+Silk治疗对Tub-3及GFAP表达的影响 |
| 9.NSC+Silk治疗对Neu N蛋白表达的影响 |
| 10.鼠缺血缺氧模型经治疗后运动受损情况 |
| 11.鼠缺血缺氧模型治疗后学习记忆功能改善 |
| 12.海马组织内神经相关因子表达 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 第三部分 姜黄素对神经组织工程组织的作用及机制研究 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 姜黄素的配制 |
| 2.2 EdU标记率测定 |
| 2.3 细胞凋亡实验 |
| 2.4 轴突数据处理 |
| 2.5 统计学分析 |
| (三)结果 |
| 1.不同浓度Cur对 NSC细胞毒性检测 |
| 2.不同浓度Cur对 NSC增殖能力的影响 |
| 3.不同浓度Cur对 NSC凋亡的影响 |
| 4.不同浓度Cur对 NSC分化形态的影响 |
| 5.姜黄素影响分化神经元轴突长度 |
| 6.姜黄素对分化后神经元轴突相关基因表达 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 综述 神经组织工程(NTE)研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（8）HIF-1α在骨髓间充质干细胞的过表达对创伤性脑损伤的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文题目 |
| 附英文文章 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后bFGF对神经元的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 脑缺氧缺血诱导新生7天大鼠急性期、远期脑损伤及bFGF表达升高 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1 HI诱导新生7天大鼠急性期神经功能障碍、脑组织肿胀及梗死 |
| 2 HI诱导新生7天大鼠急性期梗死侧皮质神经元形态及数量的改变 |
| 3 HI诱导新生7天大鼠远期空间记忆、运动功能、自主探寻和学习记忆能力受损 |
| 4 HI后24h bFGF在梗死侧皮质中mRNA和蛋白质的相对表达量升高 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 bFGF在体外OGD条件下对原代皮质神经元有保护作用并且可能与NGF和IL-1β的表达变化有关 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1 OGD诱导原代皮质神经元中bFGF表达量增加 |
| 2 成功筛选有效的bFGF siRNA片段 |
| 3 成功在原代皮质神经元中干扰bFGF的表达 |
| 4 OGD或bFGF沉默可以诱导原代皮质神经元的细胞数量和细胞活力减少 |
| 5 在OGD条件下,bFGF干扰影响了原代皮质神经元的形态和神经元轴突的生长 |
| 6 NGF和IL-1β在正常和OGD条件下bFGF表达干扰后的神经元中表达动态 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 新生儿缺氧缺血性脑病中细胞因子治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（10）干细胞活性因子保护大鼠损伤神经干细胞及改善神经功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、干细胞活性因子改善大鼠受损神经干细胞 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.2.1 大鼠BMSCs的原代分离、培养、传代及保存 |
| 1.1.2.2 流式细胞术鉴定BMSCs细胞膜标记蛋白的表达情况 |
| 1.1.2.3 双抗体夹心法酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA）测定BMSCs培养基中BDNF、IGF-1、VEGF和NGF细胞活性因子的水平 |
| 1.1.2.4 大鼠NSCs的原代分离、培养与传代 |
| 1.1.2.5 BMSCs细胞活性因子对大鼠NSCs增殖的影响 |
| 1.1.2.6 BMSCs细胞活性因子对大鼠NSCs分化的影响 |
| 1.1.2.7 BMSCs细胞活性因子对大鼠NSCs乏氧耐受能力的影响 |
| 1.1.2.8 活性因子对细胞损伤模型中大鼠NSCs耐受能力的影响 |
| 1.1.2.9 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 大鼠BMSCs初期克隆形成、细胞形态及传代特点 |
| 1.2.2 大鼠BMSCs细胞膜表面标记蛋白的表达特点 |
| 1.2.3 大鼠BMSCs培养基中BDNF、IGF-1、VEGF和NGF细胞活性因子的表达水平 |
| 1.2.4 BMSCs细胞活性因子对大鼠NSCs增殖的影响 |
| 1.2.5 BMSCs细胞活性因子对大鼠NSCs分化的影响 |
| 1.2.6 BMSCs细胞活性因子对大鼠NSCs乏氧耐受能力及牵张损伤耐受力的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 脑创伤救治的国内外研究现状 |
| 1.3.2 脑创伤靶向治疗药物的研发现状 |
| 1.3.3 干细胞治疗脑创伤的研究进展 |
| 1.3.4 本研究的主要发现与分析 |
| 1.4 小结 |
| 二、BMSCs源性细胞活性因子改善TBI大鼠神经功能的体内实验研究 |
| 2.1 对象与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂与耗材 |
| 2.1.3 SD实验大鼠的购置与日常饲养 |
| 2.1.4 脑损伤大鼠模型的制作与实验分组 |
| 2.1.5 脑损伤大鼠模型术后观察及行为学检测 |
| 2.1.6 脑损伤大鼠模型术后解剖及组织病理学检查 |
| 2.1.6.1 组织解剖及一般组织观察 |
| 2.1.6.2 干/湿重法检测脑水肿程度 |
| 2.1.6.3 mRNA提取及荧光定量PCR检测组织中目标基因的表达 |
| 2.1.6.4 免疫组织荧光方法检测目标蛋白的表达 |
| 2.1.6.5 Western Blot方法检测目的蛋白在脑组织中的表达情况 |
| 2.1.7 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 实验动物一般状况观察 |
| 2.2.2 实验动物活体实验结果 |
| 2.2.2.1 水迷宫训练结果 |
| 2.2.2.2 Morris水迷宫定位航行实验结果 |
| 2.2.3 实验动物离体实验结果 |
| 2.2.3.1 HE染色实验结果分析 |
| 2.2.3.2 实验大鼠脑水肿检测结果 |
| 2.2.3.3 荧光定量PCR检测目标基因在脑组织中的mRNA表达结果 |
| 2.2.3.4 免疫组织荧光方法检测目标蛋白在脑组织中的表达结果 |
| 2.2.3.5 Western Blot方法检测目的蛋白在脑组织中的表达结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 细胞组织工程与TBI治疗概述 |
| 2.3.2 内源性修复对神经损伤的反应及其媒介因子 |
| 2.3.3 细胞因子通过调节损伤微环境影响神经干细胞行为 |
| 2.3.4 生物活性因子调节内源性神经干细胞活性 |
| 2.3.5 本研究的主要发现与分析 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 干细胞治疗中枢神经损伤的可行性和潜在价值 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、植入脑源性神经营养因子载体细胞对幼鼠缺氧缺血性脑损伤后记忆的影响（论文参考文献）
- [1]hUC-MSCs对缺氧缺血脑损伤幼鼠学习记忆的影响及机制初步探讨[D]. 刘璐. 湖北医药学院, 2021(01)
- [2]免疫与炎症反应在脑卒中动物模型中的影响与机制研究[D]. 赵慧. 山西医科大学, 2020(01)
- [3]基于“肾脑相关”理论六味地黄膏膏摩干预对脑瘫幼鼠皮层损伤修复及BDNF/TrkB表达的影响[D]. 张星贺. 山东中医药大学, 2020(01)
- [4]NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究[D]. 曾友根. 南昌大学, 2020(08)
- [5]化学遗传学靶向激活运动皮层谷氨酸能神经元对脑出血小鼠运动和认知功能的影响及机制研究[D]. 凌文远. 河北医科大学, 2020(01)
- [6]经侧脑室和经鼻移植人少突胶质前体细胞对大鼠早产儿脑白质损伤模型神经修复作用的研究[D]. 臧静. 南通大学, 2020(08)
- [7]丝素蛋白水凝胶结合NSC对缺血缺氧脑损伤的修复及姜黄素的干预作用研究[D]. 韩朝. 大连医科大学, 2020(03)
- [8]HIF-1α在骨髓间充质干细胞的过表达对创伤性脑损伤的影响[D]. 时晓东. 山东大学, 2019(02)
- [9]新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后bFGF对神经元的作用及其机制研究[D]. 马征. 昆明医科大学, 2019(06)
- [10]干细胞活性因子保护大鼠损伤神经干细胞及改善神经功能的研究[D]. 任登鹏. 天津医科大学, 2018(12)