一、豌豆叶绿体型谷氨酰胺合成酶cDNA的克隆（论文文献综述）
尹伊[1]（2020）在《浒苔氮胁迫下生理响应和MAPK信号通路的初步研究》文中指出浒苔（Ulva prolifera）具有复杂的生活史和多样的繁殖方式,加上漂浮浒苔利于漂浮的中空管状结构,让浒苔能更好得应对自然界的胁迫,使浒苔成为绿潮优势种之一。目前关于自然界胁迫对浒苔生长繁殖的影响,主要集中在温度、光照和盐度上。对营养元素胁迫研究的较少,氮素作为限制浒苔生长的关键营养元素,对浒苔的生长起着决定性作用,有较大的研究意义。但目前的研究中,一方面对氮元素的影响仅停留于在海水的原有基础上加硝态氮或者铵态氮,即对海水中氮浓度的控制不准确,另一方面研究仅限于对生长量等生理指标的检测,没有深入到分子层面。本实验旨在补充氮胁迫对浒苔生理代谢的影响,并从分子层面研究浒苔对氮胁迫应答的分子机制。本文以漂浮浒苔作为研究对象,首先补充了漂浮浒苔氮同化关键酶基因的扩增。氮同化过程就是指植物吸收外界环境中的硝态氮和铵态氮,转化成氨基酸和蛋白质等含氮化合物的过程。硝酸盐同化涉及到硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）这4个关键酶,其中浒苔NR已有报道全长序列。本实验根据实验室转录组数据,首次在浒苔中扩增出GS1的cDNA全长序列1143bp,GenBank登录号为:MN496139;扩增出Fd-NiR的cDNA全长1698bp,GenBank登录号为:MN496140;扩增出Fd-GOGAT的部分CDS区长度为2627bp,GenBank登录号为:MN496141;并进行蛋白质理化性质和三维结构等预测分析。补充了浒苔在氮同化关键酶基因克隆上的空缺,为后续进行氮胁迫/氮富集条件下氮同化关键酶表达调控的研究做准备。根据前期实验获得的氮同化关键酶序列设计引物进行qRT-PCR实验,同时检测浒苔生长量和叶绿体含量变化,以研究各在氮胁迫条件下浒苔生长状态和氮同化关键酶的表达情况。研究发现在氮剥夺情况下会导致浒苔的生长相对速率和叶绿素含量下降,但在短期内依旧稳定生长。其氮同化关键酶也在一定的平稳表达后出现小幅度增加,结合文献可推测浒苔在短期内利用了储藏的色素和蛋白质作为内在氮源,满足缺氮时基本的生理代谢需求,以渡过氮缺乏时期。为研究MAPK信号通路在浒苔应对氮胁迫时的作用,实验选用了 SB239063抑制剂对p38MAPKα/β进行抑制,观察浒苔原生质体在死亡率和细胞壁再生情况。通过原生质体培养液成分调整,实验发现氮富集条件下提高了浒苔原生质体的存活率和细胞壁再生速度,缺氮环境反之。又通过Western Blotting检测氮胁迫下MAPK磷酸化水平,发现氮剥夺能诱导MAPK的磷酸化,且随时间延长磷酸化水平升高。再通过Western Blotting检测SB239063抑制剂对MAPK磷酸化的抑制情况,发现在10μM抑制剂SB239063处理下,MAPK磷酸化水平下降显着确定了抑制剂作用浓度。利用SB239063对原生质体抑制后死亡率和细胞壁再生的结果,可以推测出MAPK在氮剥夺的情况下通过磷酸化响应调控下游因子,降低了原生质体的死亡率和再生率,减缓细胞的生理生化过程,减少消耗度过不利环境。解释浒苔在缺氮时的海上仍不会发生藻体死亡,并继续增殖的原因。本实验为MAPK信号通路在浒苔应对非生物胁迫的作用上进行了尝试,为后期进一步研究浒苔中信号通路响应不利环境的作用机理做了铺垫。
王荣[2]（2019）在《褪黑素对黑暗胁迫下栀子叶片衰老进程的影响》文中认为栀子（Gardenia jasminoides Ellis）为茜草科（Rubiaceae）栀子属（Gardenia）常绿灌木。栀子除被广泛应用于园林绿化外,因其叶片色泽苍绿和叶质硬挺常被作为切叶材料,用作花束的装饰。栀子切叶在运输途中或置于室内时,常常处于黑暗或弱光的逆境条件,易使叶片变黄、衰老,严重影响其观赏价值。因此,如何采取相应措施缓解栀子叶片在弱光条件下的衰老进程已成为生产上亟待解决的技术问题。目前有研究表明,褪黑素可以在极低光照条件下（黑暗）延缓叶片衰老,为此,本研究应用褪黑素处理栀子叶片,探讨褪黑素处理对黑暗胁迫引起栀子叶片衰老的缓解效应,并进一步从叶片生理指标、解剖特征和分子水平上开展了相应的基础研究,主要结果如下:（1）0.05mM、0.1mM、1.0 mM和2.0mM四种不同浓度褪黑素（MT）,均能不同程度地延缓黑暗胁迫下栀子叶片的衰老,其中1.0 mM浓度的褪黑素（MT1.0）溶液效果最佳,而较高浓度（2.0mM,MT2.0）会减弱延缓衰老的效果。经MT1.0处理的栀子叶片颜色保持翠绿,色度角H°、SPAD值、潜在最大光能效率最高,而丙二醛含量最低。（2）褪黑素处理（MT1.0）能够显着延缓黑暗胁迫下栀子叶片的黄化衰老。与对照叶片相比,MT1.0处理的叶片叶绿素含量和叶绿素荧光参数（Fv/Fm、Fv/Fo和Y（Ⅱ））提高,类胡萝卜素和类黄酮含量降低;MT1.0处理的叶片中过氧化氢含量、超氧阴离子自由基积累量、相对电导率和丙二醛含量降低,而超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等保护酶活性提高;MT1.0处理的叶片的含水量、可溶性蛋白含量和谷氨酰胺合成酶（GS）活性提高。同时,MT1.0处理增加了叶片内源褪黑素水平和色氨酸脱羧酶基因（TDC）的表达水平。MT1.0处理激活了抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环系统以清除植物叶片中过量的活性氧。（3）在黑暗胁迫下,对照栀子叶片表面较为平坦,而MT1.0处理的叶片表面的角质层具有更明显的波纹状结构,两者气孔的大小和气孔开放度方面没有明显差别。通过透射电镜观察发现,在黑暗胁迫下,对照栀子叶片中叶绿体发生降解,变成更圆的形状,同时脂质球体增加,叶绿体膜破损,而MT1.0处理的叶片叶肉细胞超微结构较为完整,叶绿体降解的较少。（4）将MT1.0处理与蒸馏水CK处理的叶片置于黑暗胁迫24 d后提取RNA进行转录组测序,总共组装成94812个高质量的unigenes,平均长度为1289 nt;对组装得到的Unigenes进行七大功能数据库注释,共有19669个Unigenes被不同数据库共同注释到。转录组测序显示外源褪黑素处理涉及植物多种生物过程,包括碳水化合物代谢,氨基酸代谢,脂质代谢,植物激素信号转导和色素生物合成途径;其中,外源褪黑素导致碳水化合物代谢和氨基酸代谢基因的上调,而脂质代谢和色素生物合成中的基因下调,植物激素信号转导中的基因部分上调和部分下调。
陈胜勇,李彩凤,侯静,马凤鸣,李观康,何霭如,余小丽,汪云[3]（2014）在《氮素诱导的甜菜gln2的克隆及序列分析》文中研究说明本文探索了在氮素诱导下,甜菜gln2序列变化情况及氮素对gln2的调控表达情况。根据已知甜菜谷氨酰胺合成酶基因（gln2,登录号为AY026353）设计特异引物,利用RT-PCR方法克隆甜菜质体型谷氨酰胺合成酶的cDNA（GS2 cDNA）片段和甜菜质体型谷氨酰胺合成酶基因组DNA（GS2 DNA）序列,并进行生物信息学分析。获得甜菜GS2 cDNA片段序列,并首次得到甜菜GS2 DNA序列,并将GS2DNA登录到了NCBI网站的GenBank（登录号为EU558132）。生物信息学分析结果表明,GS2 DNA长度为6 144bp,含有13个外显子和12个内含子;氮素诱导的GS2 cDNA序列长度为1 296bp,与gln2序列相似性达99.92%,可编码431个氨基酸残基;其氨基酸序列与其它植物的质体型谷氨酰胺合成酶（GS2）有很高的同源性,与菠菜GS2的同源性最高,属于混合型蛋白,具有Gln-synt保守功能域,N端为beta-Grasp domain,C端为catalytic domain。采用半定量PCR分析该基因在氮素处理下的诱导表达情况,结果表明,NO3-N∶NH4+-N=80∶20和NO3-N∶NH4+-N=50∶50的处理对GS2基因表达的促进效果最好,NO3-N∶NH4+-N=0∶100对GS基因诱导作用最差。研究甜菜GS基因的结构功能及表达调控对甜菜实现高同化氨及增产增糖有重要意义。
蒋丽花,傅明辉,李园枚,严国花,郑李军,陈肖丽,彭进平[4]（2014）在《水葫芦胞质型谷氨酰胺合成酶EcGS1全长cDNA的克隆及序列分析》文中进行了进一步梳理以水葫芦根部总RNA逆转录得到的cDNA为模板,参照其他植物的胞质型谷氨酰胺合成酶（GS1）氨基酸保守序列设计简并引物,进行PCR扩增,以得到的产物为基础,采用RACE技术获得水葫芦胞质型谷氨酰胺合成酶EcGS1全长cDNA。全长为1 434 bp,开放阅读框为1 071 bp,编码356个氨基酸,分子量为39.3 kD,等电点pI为5.52。序列相似性分析显示,该序列与其他植物的GS1氨基酸序列具有较高的相似性。通过亚细胞定位预测,确定EcGS1为胞质型谷氨酰胺合成酶。
徐振华[5]（2014）在《粳稻杂种后代氮代谢关键酶活性及相关基因转录表达和序列分析》文中提出蛋白质含量的高低对水稻蒸煮食味以及营养品质具有非常大的影响,是影响水稻品质的重要内在因素之一。现已明确,谷氨酰胺合成酶、铵转运蛋白酶、蛋白水解酶作为氮代谢关键酶对灌浆过程中籽粒蛋白质合成和积累起重要作用,与籽粒蛋白质含量高低有密切关系。另一方面,品种间有性杂交仍然是目前乃至将来培育水稻新品种的主要途径。因此,研究灌浆成熟过程中水稻杂种后代氮代谢关键酶活性变化及相关基因的表达特性和基因序列变异分析,对阐明水稻杂种后代籽粒蛋白质含量遗传变异的分子机理以及水稻优质育种具有重要的理论及实践指导意义。在杂交组合I东农423×藤系180以及组合II系选1号x通769中,逐代按高、低两个方向进行选择蛋白质含量有显着差异的后代,通过盆栽试验系统地比较分析了稻米蒸煮食味品质性状、灌浆过程中籽粒谷氨酰胺合成酶和蛋白水解酶活性变化、氮代谢关键酶基因家族的mRNA表达特征及谷氨酰胺合成酶基因序列变异特点、氮素营养对上述性状和基因mRNA表达量的影响,旨在为阐明水稻杂种后代籽粒蛋白质含量超亲遗传变异的分子机理以及水稻优质育种提供理论依据。研究结果表明：无论亲本间籽粒蛋白质含量有没有显着差异,其品种间杂种后代通过籽粒蛋白质含量的连续定向选择可以获得超亲变异的后代；在两个组合中,籽粒蛋白质含量高的后代直链淀粉含量都比蛋白质含量低的后代低,但食味值及RVA谱特性中的最高粘度、最低粘度和下降粘度值却都大,而粘滞峰消减值和最终粘度都小,表明籽粒直链淀粉含量对蒸煮食味品质性状的影响要大于蛋白质含量,因此降低籽粒直链淀粉含量更有利于提高稻米的蒸煮食味品质。灌浆同时期组合I和组合II籽粒蛋白质含量低的后代及亲本积累的蛋白质量始终低于蛋白质含量高的后代及亲本,籽粒蛋白质积累量的高低主要受基因型的控制；在齐穗期增施氮肥可以显着提高灌浆不同时期的籽粒蛋白质含量及稻米的蛋白质含量。在水稻灌浆过程中,组合I和组合II的亲本和杂种后代功能叶片和籽粒GS活性变化趋势基本一致,功能叶片GS酶活性逐步降低；籽粒GS酶活性逐渐增加,达到峰值后逐渐下降,呈单峰曲线变化；两个组合酶活性大小表现为,灌浆不同时期籽粒蛋白质含量高的亲本和后代功能叶片谷氨酰胺合成酶活性均比籽粒蛋白质含量的低亲本和后代酶活性高；籽粒蛋白质的合成与积累主要在灌浆前期,而且籽粒灌浆前期高蛋白质含量后代的谷氨酰胺合成酶活性明显大于低蛋白质含量后代；蛋白水解酶在水稻灌浆后期活性强,灌浆过程中高蛋白含量后代蛋白水解酶活性始终高于低蛋白含量后代；在齐穗期增施氮肥可以显着提高灌浆不同时期叶片和籽粒谷氨酰胺合成酶和蛋白水解酶活性。灌浆过程中两个组合的亲本及杂种后代叶片谷氨酰胺合成酶和蛋白水解酶基因mRNA转录表达量变化趋势基本一致,随灌浆进程GS1.3基因的mRNA转录表达量逐渐增加,到抽穗后15-20d时表达量最高,随后表达量逐渐下降,呈单峰曲线变化；GS2基因的mRNA转录表达量在抽穗后10d达到峰值后逐渐降低的线性变化趋势：OsASP基因的mRNA转录表达量峰值出现在灌浆后期,随着灌浆进程呈逐渐增加的变化趋势：AMT5基因的mRNA转录表达量呈抽穗后10d达到峰值后逐渐降低的线性变化趋势；齐穗期增施氮肥均显着提高上述氮代谢关键酶基因的mRNA转录表达量。灌浆过程中亲本及杂种亲本和后代籽粒谷氨酰胺合成酶基因GS1.3和GS2的mRNA表达量变化趋势在组合I和组合II中基本一致,呈现出GS1.3和GS2的mRNA表达量逐渐增加,峰值多数出现在抽穗后15d和20d,达到峰值后逐渐降低的单峰曲线变化；灌浆过程中在组合I中,亲本OsASP基因mRNA相对转录表达量高于后代,而亲本AMT5基因mRNA相对转录表达量低于后代：在组合II中,蛋白质含量高的后代氮代谢关键酶基因mRNA相对转录表达量始终是最高,蛋白质含量低的后代GS1.3基因mRNA相对转录表达量低于蛋白质含量低的亲本,其他氮代谢关键酶基因mRNA相对转录表达量均高于亲本。组合II齐穗期增施氮肥均显着提高上述氮代谢关键酶基因的mRNA转录表达量,趋势基本一致,持续时间较未处理组合II时间长。本试验克隆的GS1.3和GS2基因全序列长分别为1113bp和1287bp,分别编码371和429个氨基酸；与GenBank中已发表的日本晴水稻品种核苷酸序列比较,亲本及后代同源性GS1.3基因分别为99.7%、99.8%、99.6%、99.6%,GS2基因分别为99.9%、99.9%、100%、100%；蛋白质含量不同的水稻品种间谷氨酰胺合成酶基因虽然保守性非常高,但品种间仍然存在个别碱基的差异；品种间杂交后代在基因交换和分离稳定过程中依然能发生碱基的变化和三联体密码的改变,以致氨基酸序列及酶蛋白的理化性质和功能域的变化。
蒋丽花[6]（2014）在《水葫芦谷氨酰胺合成酶基因的克隆及表达》文中研究表明谷氨酰胺合成酶（GS）在高等植物氮代谢中起着重要的作用,是参与氨同化过程的关键酶。植物GS具有多种同工酶,根据亚细胞定位,分为胞液型谷氨酰胺合成酶（GS1）和质体型谷氨酰胺合成酶（GS2）。水葫芦在富营养化水体中泛滥生长,会破坏水体生态平衡。但水葫芦具有过度吸收氮磷营养元素的特点,适量的水葫芦可用来净化水质。本文基于大豆、小麦等植物GS1基因保守序列,以水葫芦根部RNA为模板经过两步法RT-PCR法扩增出水葫芦GS1的保守序列片段,再经RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）法,克隆了3个完整的GS1基因（Eichhornia crassipes glutamine synthetase,分别标号为EcGS1a, EcGS1b, EcGS1c）,3个基因全长分别为1434bp、1455bp、1508bp。 EcGS1a编码一个356个氨基酸残基的多肽,推测的多肽分子量大小为39.3kDa,PI=5.52。EcGSlb编码一个354个氨基酸残基的多肽,推测的多肽分子量大小为39.0kDa, PI=5.95。EcGSlc编码一个356个氨基酸残基的多肽,推测的多肽分子量大小为39.3kDa, PI=5.94。通过氨基酸序列和结构分析显示EcGS1a、EcGSlb和EcGS1c蛋白包都含了ATP结合区域,N-糖基化序列,GS beta-Grasp功能区和GS催化功能区,这些功能区在植物的谷氨酰胺合成酶中是保守的。通过亚细胞定位预测EcGS1a、EcGS1b和EcGS1c蛋白都为胞质型蛋白。通过BLAST分析及进化树构建可知EcGS1a、EcGS1b和EcGS1c氨基酸序列与橡胶树的相似性最高。本实验还对清水、铵态氮及硝态氮三种不同培养条件下,水葫芦根部和叶部的EcGS1a、EcGS1b和EcGS1c转录水平和GS活性进行了分析。在根部, EcGS1a和EcGS1c基因的转录主要受硝态氮影响；EcGS1b基因的转录受外界氮素形态影响不大；GS活性在氮胁迫和铵态氮处理初期受到了抑制,随着处理时间GS活性的抑制解除,GS活性在硝态氮处理2h和6h时受到了明显的抑制。在叶部,在清水,氯化铵,硝酸钾处理下,EcGS1a, EcGS1b和EcGS1c基因的转录都提高了,EcGS1a基因的转录受氮胁迫的影响最为显着,表现为氮胁迫转录增强；EcGSlb和EcGSlc基因的转录受硝酸钾的影响最显着；GS活性不受氮胁迫的影响,在氯化铵处理2h时和硝酸钾处理4h时下明显提高。
徐乾[7]（2012）在《茶树中与氨基酸合成相关的三个基因的克隆与分析》文中指出在构建茶树幼根cDNA文库获得相关EST序列的基础上，通过SMART RACEPCR技术获得了茶树中谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase, GS1-1、GS1-2）及精氨酸脱羧酶（Arginine decarboxylase, ADC）基因的cDNA全长序列。GS1-1基因的3’端序列与已知的EST序列拼接后得到大小为2906bp的cDNA序列，其开放阅读框（ORF）全长为2532bp，共编码843个氨基酸，分子量为93.553kDa，理论等电点（pI）为6.258。该蛋白质的α螺旋结构是41.52%，β螺旋结构是10.79%，无规则卷曲及其它结构为47.69%，其中无规则卷曲是整个蛋白的主要结构元件，α螺旋其次，β折叠最少。GS1-1蛋白为亲水性非分泌不稳定蛋白，跨膜方向是由内向外，无信号肽序列存在，共有31个可能的磷酸化位点，是细胞核蛋白。基因分子进化分析表明其与葡萄的亲缘关系较近。GS1-2基因的cDNA全长序列共1710bp，ORF全长为1071bp，共编码356个氨基酸，蛋白质的分子量为39.34kDa，理论等电点（pI）为5.65。GS1-2蛋白二级结构中，α螺旋结构占26.29%，β折叠结构占23.03%，无规则卷曲及其它结构为50.28%，其中无规则卷曲是GS1-2蛋白质的整体结构中的主要结构元件，α螺旋和β折叠散布于整个蛋白质中。GS1-2蛋白为亲水性非分泌不稳定蛋白，不跨膜运动，无信号肽序列存在，共有27个可能的磷酸化位点，存在于过氧化物酶体。基因分子进化分析表明其与葡萄的亲缘关系较近。ADC基因cDNA全长为2988bp，开放阅读框（ORF）全长为2163bp，共编码720个氨基酸，编码的蛋白质的分子量为77.430kDa，理论等电点（pI）为5.373，其序列中不存在卷曲螺旋结构。ADC蛋白为亲水性非分泌不稳定蛋白，不跨膜运动，无信号肽序列存在，共有41个可能的磷酸化位点，存在于叶绿体基质中，是细胞质蛋白。基因分子进化分析表明其与碧桃和苹果的ADC亲缘关系较近。成功构建了以pET32a为载体及Rosetta为宿主菌的原核表达体系，经1mM浓度的IPTG，37℃，4h诱导后得到了分子量大小为39.5kDa的蛋白，与预测的GS1-2蛋白39.34kDa大小相符。通过凝胶成像分析系统定量分析可知，重组蛋白约占菌体总蛋白的47.1%。GS1-1、GS1-2及ADC基因cDNA全长序列的获得及GS1-2基因的初步原核表达，对于进一步研究GS和ADC在茶树氮代谢及茶氨酸代谢途径中的作用提供了基础。
于瑶,张汉尧,杜建伟[8]（2012）在《高等植物谷氨酰胺合成酶基因的研究进展》文中认为氮是植物生长的一个重要营养元素,但外源无机氮必须经氮同化转化为有机氮才能为植物所利用。谷氨酰胺合成酶（GS）是参与氮同化过程的关键酶,本文从GS种类、功能、理化和分子生物学性质及基因表达调控等方面介绍了其研究进展。
陈琪[9]（2011）在《茶树体内茶氨酸合成酶的克隆与异源表达及一氧化氮信号对其调控的研究》文中研究说明茶是目前世界上饮用量最大的非酒精类饮料，L-茶氨酸是茶树体内特征性非蛋白质氨基酸，不仅决定了茶的风味还有非常广泛的药理作用。茶氨酸合成酶（Theanine synthetase，TS）不仅是茶氨酸合成的关键酶，也对茶树体内的氮代谢有重大影响。研究表明，茶氨酸合成酶基因序列与谷氨酰胺合成酶（Glutaminesynthetase, GS）基因序列有高度同源性，有可能是谷氨酰胺合成酶基因家族成员，对其进行研究，不仅有利于掌握茶氨酸代谢与调控的规律，也有助于了解茶树体内氮同化与转运的机理。本研究利用RT-PCR的方法克隆了茶树体内茶氨酸合成酶基因（DD410895）与谷氨酰胺合成酶基因（AB115184），通过原核与真核表达进行功能验证，并将原核表达的蛋白纯化以制备多抗；在此基础上，利用生物信息学的手段对TS与GS推导出的蛋白质序列进行结构与功能的分析，并利用系统进化树的方法对它们在GS基因家族中的地位进行聚类分析；利用HPLC检测与Western Blotting相结合的方法对不同NO诱导处理下茶籽苗中TS的表达与茶氨酸的积累进行分析。通过上述研究得到以下结果：通过提取茶树根部与叶部总RNA，进行RT-PCR，克隆得到茶树茶氨酸合成酶基因（DD410895）与谷氨酰胺合成酶基因（AB115184）。获得的TS基因长度为1071bp，与已知的茶树TS基因的氨基酸序列有3个氨基酸的差异，与其他植物GS基因具有较高的同源性，获得的GS基因与已知的茶树GS基因的氨基酸序列有1个氨基酸的差异。对两条基因进行原核表达后得到可溶性蛋白，进行酶活力验证，结果表明，表达的TS蛋白能够催化谷氨酰胺与盐酸乙胺合成茶氨酸，而不能催化谷氨酸与盐酸乙胺合成茶氨酸，也不具备GS的催化活力，酶促反应产生的产物用HPLC与ESI-MS进行鉴定，确定为茶氨酸；而表达的GS蛋白明显具有转氨基的催化活力，相较于细菌本身GS催化能力大大增强。构建植物双元表达载体pGREEN-35S-TS/GS，导入农杆菌，运用花序侵染法转入拟南芥，分别获得转茶TS和GS基因的转基因拟南芥，通过除草剂Basta对后代进行筛选，并利用PCR的方法对阳性植株进行鉴定。利用载体上的GFP标签对转TS基因的拟南芥根尖细胞进行激光共聚焦显微镜观察，发现融合蛋白主要存在于细胞质中。用Expasy软件包和CBS，Swiss-Model，InterProScan等网站的在线分析工具对TS与GS的理化特性，蛋白结构等进行分析与预测。结果表明TS的理论等电点PI=5.52，蛋白质相对分子质量MW=39306.3Da，GS的理论等电点PI=6.13，蛋白质相对分子质量MW=39240.3Da，二者均为易溶、亲水性强的蛋白，不存在跨膜结构。二级结构预测表明二者都是混合型蛋白结构差异不大。氨基酸序列和结构分析显示TS与GS蛋白均包含了一个GS beta-Grasp结构域和一个GS催化结构域，这些功能区在植物的谷氨酰胺合成酶中是保守的，均为Gln-synt结构域。运用软件对蛋白的细胞定位和功能分析表明，TS与GS蛋白主要定位于细胞质内，具有转录、转录调控和信号转导功能的概率较高。运用同源建模软件SWISS-PdbView对TS三维结构进行预测，并以玉米GS蛋白三维结构为模板（编号:2d3a）用metapocket软件对TS蛋白活性中心进行分析，预测出三个酶反应的结合位点，其位置与GS大致相当，但是其所能结合的氨基酸位点有着细微的差别，可能就是二者催化反应差异的原因所在。运用Mega4.1软件构建了GS的系统进化树，表明TS属于GS家族成员，并且可以将山茶属GS蛋白划分为3类。利用外源一氧化氮（NO）供体硝普钠（SNP）提供不同浓度的NO处理幼嫩茶籽苗，发现能够明显促进TS的表达和茶氨酸的积累，短期内NO浓度的提高能明显增强茶籽苗体内茶氨酸的含量，但是达到一定的临界值后这种作用不再呈正相关，而处理一段时间后，NO的刺激作用明显被茶籽苗自身生长发育过程所调节，茶氨酸的积累量逐步下降，使用NO清除剂与NOS抑制剂能明显阻断外源NO的刺激作用，但不会影响茶籽苗茶氨酸的合成与代谢的正常通路。说明适当剂量的外源NO可以直接影响TS基因的表达，但尚不明确这种作用是直接作用于蛋白结构上还是与其他信号级联系统共同作用的结果。NO的信号调节作用还对EGCG的合成有明显的关联，不过对其他游离氨基酸与儿茶素代谢的影响并不明显。
陈胜勇,李观康,汪云,何霭如,陈傲,余小丽[10]（2010）在《谷氨酰胺合成酶的研究进展》文中进行了进一步梳理作物对氮素的吸收利用能力是其生长发育及品质形成的重要限制因素之一。谷氨酰胺合成酶（GS）在高等植物氮代谢中起着重要的作用,是氮代谢的关键酶。笔者介绍了GS的结构和类型,并就作物中GS在分子生物学、生物信息学等方面的研究进行了综述。
二、豌豆叶绿体型谷氨酰胺合成酶cDNA的克隆（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、豌豆叶绿体型谷氨酰胺合成酶cDNA的克隆（论文提纲范文）
（1）浒苔氮胁迫下生理响应和MAPK信号通路的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1、浒苔研究概况 |
| 1.1 浒苔的生物学特性 |
| 1.1.1 浒苔的分类 |
| 1.1.2 浒苔生活史研究进展 |
| 1.2 南黄海绿潮介绍 |
| 1.3 环境因素对大型海藻的影响 |
| 2、植物吸收同化氮元素的机理 |
| 2.1 硝酸还原酶(NR)的研究进展 |
| 2.2 亚硝酸还原酶(NiR)的研究进展 |
| 2.3 谷氨酰胺合成酶(GS)的研究进展 |
| 2.4 谷氨酸合成酶(GOGAT)研究进展 |
| 3、植物中MAPK研究进展 |
| 3.1 植物MAPK家族简介 |
| 3.2 植物MAPK的结构特征 |
| 3.3 植物MAPK分类 |
| 3.4 植物MAPK家族的功能研究进展 |
| 3.4.1 植物中MAPK对生长发育的调节作用 |
| 3.4.2 植物中MAPK抵抗非生物逆境的功能 |
| 4、本研究的目的意义 |
| 第二章 氮同化关键酶(Fd-NiR、GS1和Fd-GOGAT)基因克隆和分析 |
| 1、实验材料、仪器及试剂 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 1.3.1 直接购买的试剂及试剂盒 |
| 1.3.2 配制的试剂 |
| 2、实验方法 |
| 2.1 浒苔培养 |
| 2.2 浒苔基因组DNA的提取 |
| 2.3 浒苔总RNA提取 |
| 2.4 第一链cDNA合成 |
| 2.5 浒苔ITS和5S序列扩增 |
| 2.5.1 引物设计 |
| 2.5.2 ITS和5S序列PCR扩增 |
| 2.5.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物 |
| 2.5.4 目的产物的切胶回收 |
| 2.5.5 目的产物的载体连接、转化和蓝白斑筛选 |
| 2.5.6 阳性克隆检测 |
| 2.5.7 目的条带基因测序 |
| 2.6 序列TIS、5S序列分析和系统发育树构建 |
| 2.7 浒苔固氮关键酶(Fd-NiR,GS1和Fd-GOGAT)基因克隆 |
| 2.7.1 引物设计 |
| 2.7.2 固氮关键酶(Fd-NiR,GS1和Fd-GOGAT)序列扩增 |
| 2.8 浒苔固氮关键酶(Fd-NiR,GS1和Fd-GOGAT)基因生物信息学分析 |
| 3、结果与分析 |
| 3.1 总RNA提取 |
| 3.2 浒苔ITS、5S序列的克隆 |
| 3.3 浒苔ITS、5S序列分析 |
| 3.3.1 浒苔ITS、5S序列测序结果 |
| 3.3.2 浒苔ITS、5S序列与库中已有序列建树分析 |
| 3.4 浒苔GS1、Fd-NiR和Fd-GOGAT基因克隆 |
| 3.4.1 浒苔GS1基因克隆 |
| 3.4.2 浒苔Fd-NiR基因克隆 |
| 3.4.3 浒苔Fd-GOGAT基因克隆 |
| 3.5 浒苔GS1、Fd-NiR和Fd-GOGAT基因的同源性分析及分子进化树的构建 |
| 3.5.1 浒苔GS1基因的同源性分析及分子进化树的构建 |
| 3.5.2 浒苔Fd-NiR基因的同源性分析及分子进化树的构建 |
| 3.5.3 浒苔Fd-GOGAT基因的同源性分析及分子进化树的构建 |
| 3.6 浒苔GS1和Fd-NiR基因编码蛋白的性质和结构分析 |
| 3.6.1 浒苔GS1基因编码蛋白的性质和结构分析 |
| 3.6.2 浒苔Fd-NiR基因编码蛋白的性质和结构分析 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 第三章 氮剥夺/氮过量对浒苔生长代谢的影响 |
| 1、实验材料、仪器及试剂 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 3.1 氮胁迫对浒苔生长量的影响 |
| 3.2 氮胁迫对浒苔叶绿素含量的影响 |
| 3.3 氮胁迫对浒苔氮同化关键酶表达量的影响 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 第四章 MAPK信号通路在浒苔应对氮胁迫中的作用 |
| 1、实验材料、仪器及试剂 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2、实验方法 |
| 2.1 原生质体的制备 |
| 2.2 原生质体细胞壁检测 |
| 2.3 原生质体存活率测定 |
| 2.4 蛋白质提取 |
| 2.5 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.6 Western blot实验 |
| 3、实验结果 |
| 3.1 氮胁迫对浒苔原生质体再生能力和死亡率的影响 |
| 3.2 氮胁迫对MAPK信号通路磷酸化的影响 |
| 3.3 抑制剂SB239063对对MAPK信号通路磷酸化的影响 |
| 3.4 抑制剂SB239063对浒苔原生质体再生能力和死亡率的影响 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 参考文献 |
| 结论和创新点 |
| 附录 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（2）褪黑素对黑暗胁迫下栀子叶片衰老进程的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 叶片衰老机理 |
| 1.1.1 叶片衰老的概述 |
| 1.1.2 叶片衰老对生理生化指标的影响 |
| 1.1.3 叶片衰老中基因的表达 |
| 1.2 叶片衰老的调控 |
| 1.2.1 叶片衰老的遗传调控 |
| 1.2.2 叶片衰老的环境调控 |
| 1.2.3 叶片衰老的激素调控 |
| 1.3 植物中褪黑素的研究进展 |
| 1.3.1 植物中褪黑素的发现和存在 |
| 1.3.2 植物中褪黑素的生物合成 |
| 1.3.3 植物中褪黑素的抗逆性功能 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 延缓黑暗胁迫下栀子叶片衰老的褪黑素适宜浓度筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 色泽指标测定 |
| 2.2.2 SPAD值测定 |
| 2.2.3 叶绿素荧光参数的测定 |
| 2.2.4 可溶性蛋白含量测定 |
| 2.2.5 丙二醛含量测定 |
| 2.2.6 数据统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同浓度褪黑素对栀子叶片色泽的影响 |
| 2.3.2 不同浓度褪黑素对栀子叶片SPAD值的影响 |
| 2.3.3 不同浓度褪黑素对栀子叶片叶绿素荧光的影响 |
| 2.3.4 不同浓度褪黑素对栀子叶片丙二醛含量的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 褪黑素对黑暗胁迫下栀子叶片衰老的生理指标的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 色泽指标测定 |
| 3.2.2 SPAD值测定 |
| 3.2.3 色素含量测定 |
| 3.2.4 叶绿素荧光参数的测定 |
| 3.2.5 褪黑素含量测定 |
| 3.2.6 TDC基因表达水平测定 |
| 3.2.7 逆境相关生理指标测定 |
| 3.2.8 保护酶活性和抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环系统酶活性测定 |
| 3.2.9 微观解剖结构观察 |
| 3.2.10 数据统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 褪黑素处理对黑暗胁迫下栀子叶片色泽的影响 |
| 3.3.2 褪黑素处理对黑暗胁迫下栀子叶片SPAD值的影响 |
| 3.3.3 褪黑素处理对黑暗胁迫下栀子叶片色素含量的影响 |
| 3.3.4 褪黑素处理对黑暗胁迫下栀子叶绿素荧光的影响 |
| 3.3.5 褪黑素处理对黑暗胁迫下栀子叶片内源褪黑素含量的影响 |
| 3.3.6 褪黑素处理对黑暗胁迫下栀子叶片TDC相对表达水平的影响 |
| 3.3.7 褪黑素处理对黑暗胁迫下栀子叶片逆境相关生理指标的影响 |
| 3.3.8 褪黑素处理对黑暗胁迫下栀子叶片保护酶活性和抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统的影响 |
| 3.3.9 褪黑素处理对黑暗胁迫下栀子叶片微观解剖结构的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 褪黑素调控黑暗胁迫下栀子叶片衰老的转录组分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 总RNA的提取 |
| 4.2.2 cDNA文库构建及测序 |
| 4.2.3 测序数据的处理、评估及表达量的计算 |
| 4.2.4 差异表达基因(DEGs)的筛选及功能分析 |
| 4.2.5 差异表达基因的表达模式分析 |
| 4.2.6 qRT-PCR验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转录组测序结果及质量评估 |
| 4.3.2 Unigenes的功能注释 |
| 4.3.3 DEGs的筛选与GO分析 |
| 4.3.4 DEGs的Pathway功能分析 |
| 4.3.5 qRT-PCR验证 |
| 4.4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（3）氮素诱导的甜菜gln2的克隆及序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 1.2.2 GS2 c DNA获取 |
| 1.2.3 总DNA的提取 |
| 1.2.4 GS2 DNA的分离 |
| 1.2.5 序列的生物信息学分析 |
| 1.2.6 半定量PCR反应 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GS2 c DNA的PCR扩增、克隆及序列分析 |
| 2.2 GS2 DNA的序列与分析 |
| 2.3 GS2氨基酸序列分析 |
| 2.4 不同氮素处理下甜菜叶片GS2mRNA的变化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（4）水葫芦胞质型谷氨酰胺合成酶EcGS1全长cDNA的克隆及序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计及合成 |
| 1.2.2 总RNA的提取及c DNA第一链的合成 |
| 1.2.3 Ec GS1基因中间片段的扩增及克隆 |
| 1.2.4 5'RACE扩增及克隆 |
| 1.2.5 3'RACE扩增及克隆 |
| 1.2.6 Ec GS1基因全长获得 |
| 1.2.7 Ec GS1基因序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 水葫芦总RNA的提取 |
| 2.2 Ec GS1基因中间片段克隆及测序 |
| 2.3 5'RACE产物克隆及测序 |
| 2.4 3'RACE产物克隆及测序 |
| 2.5 Ec GS1基因c DNA全长获得 |
| 2.6 Ec GS1基因编码蛋白的氨基酸序列、保守结构域及亚细胞定位 |
| 2.7 Ec GS1基因编码的氨基酸序列与其他植物GS1相似性比对 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（5）粳稻杂种后代氮代谢关键酶活性及相关基因转录表达和序列分析（论文提纲范文）
| CONTENTS |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 水稻蛋白质研究动态和趋势 |
| 1.1.1 水稻蛋白质含量与食味品质研究 |
| 1.1.2 水稻蛋白质形成积累动态的研究 |
| 1.2 水稻谷氨酰胺合成酶及基因表达调控研究概况 |
| 1.2.1 谷氨酰胺合成酶概况 |
| 1.2.2 谷氨酰胺合成酶作用机制 |
| 1.2.3 谷氨酰胺合成酶基因概况 |
| 1.2.4 谷氨酰胺合成酶基因表达调控 |
| 1.3 水稻铵转运蛋白酶及基因表达调控研究概况 |
| 1.3.1 铵转运蛋白酶及基因研究概况 |
| 1.3.2 铵吸收和转运蛋白基因表达调控 |
| 1.4 水稻蛋白水解酶及基因研究概况 |
| 1.5 氮肥对水稻氮代谢关键酶活性及籽粒蛋白质含量影响 |
| 1.6 本试验研究内容 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 品质性状测定方法 |
| 2.4 水稻谷氨酰胺合成酶活性测定方法 |
| 2.5 水稻蛋白水解酶活性测定 |
| 2.6 数据统计分析方法 |
| 2.7 谷氨酰胺合成酶、铵转运蛋白酶、蛋白水解酶基因mRNA表达分析 |
| 2.7.1 功能叶片和籽粒胚乳基因组RNA提取 |
| 2.7.2 RT-PCR实验程序 |
| 2.8 谷氨酰胺合成酶cDNA克隆及全序列分析 |
| 2.8.1 总RNA提取 |
| 2.8.2 质粒与细菌菌株 |
| 2.8.3 PCR扩增水稻谷氨酰胺合成酶基因全长cDNA |
| 2.8.4 PCR产物的克隆鉴定 |
| 2.8.5 cDNA序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 亲本及杂种后代蒸煮食味品质特性比较 |
| 3.2 灌浆不同时期亲本及杂种后代籽粒蛋白质积累特性比较 |
| 3.3 灌浆不同时期亲本及杂种后代功能叶片和籽粒氮代谢关键酶活性比较 |
| 3.3.1 灌浆不同时期亲本及杂种后代功能叶片蛋白水解酶活性比较 |
| 3.3.2 灌浆不同时期亲本及杂种后代功能叶片谷氨酰胺合成酶活性比较 |
| 3.3.3 灌浆不同时期亲本及杂种后代籽粒谷氨酰胺合成酶活性比较 |
| 3.4 灌浆不同时期氮代谢关键酶活性与籽粒蛋白质含量间的相关 |
| 3.5 灌浆不同时期亲本及杂种后代氮代谢关键酶基因转录表达比较 |
| 3.5.1 RNA完整性、定量检测及纯化 |
| 3.5.2 灌浆不同时期亲本及杂种后代叶片和籽粒氮代谢关键酶基因mRNA表达量变化动态 |
| 3.6 氮肥对叶片和籽粒氮代谢关键酶基因mRNA表达量的影响 |
| 3.7 灌浆不同时期亲本及杂种后代叶片和籽粒氮代谢关键酶基因相对转录表达量比较 |
| 3.7.1 灌浆不同时期亲本及杂种后代叶片氮代谢关键酶基因相对转录表达量比较 |
| 3.7.2 灌浆不同时期亲本及杂种后代籽粒氮代谢关键酶基因相对转录表达量比较 |
| 3.8 胚乳GS cDNA的克隆及全序列分析 |
| 3.8.1 胚乳cDNA库的合成 |
| 3.8.2 胚乳GS1.3和GS2基因全长cDNA序列获得 |
| 3.8.3 胚乳GS1.3和GS2基因全长cDNA序列分析 |
| 3.8.4 胚乳谷氨酰胺合成酶功能域比较分析 |
| 3.8.5 胚乳GS1.3和GS2基因编码蛋白质性质比较分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于蛋白质含量选择和食味品质关系 |
| 4.2 关于氮代谢关键酶活性与蛋白质含量关系 |
| 4.3 关于氮代谢关键酶基因mRNA表达与蛋白质含量关系 |
| 4.4 关于杂种后代GS基因结构变异与蛋白质含量的关系 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（6）水葫芦谷氨酰胺合成酶基因的克隆及表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| CONTENT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物氮素营养 |
| 1.2 谷氨酰胺合成酶的研究现状 |
| 1.2.1 植物谷氨酰胺合成酶的种类及定位 |
| 1.2.2 植物的GS表达 |
| 1.2.3 GS对植物生长和发育的影响 |
| 1.2.4 外因对GS的调节 |
| 1.2.4.1 氮营养对GS的调节 |
| 1.2.4.2 糖类与氨基酸对GS的调节 |
| 1.2.4.3 镉对植物GS的调节 |
| 1.2.4.4 有机抑制剂对植物GS的调节 |
| 1.2.4.5 干旱对GS的调节 |
| 1.2.4.6 植物激素对GS的调节 |
| 1.3 水葫芦概况 |
| 1.3.1 水葫芦概述 |
| 1.3.2 国内外关于水葫芦在水体修复中的研究进展 |
| 1.4 研究目的、意义及研究内容 |
| 1.4.1 研究目的、意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 水葫芦三种谷氨酰胺合成酶基因全长的克隆 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌种 |
| 2.2.3 酶与试剂盒 |
| 2.2.4 化学试剂 |
| 2.2.5 培养基 |
| 2.2.6 引物 |
| 2.2.7 DNA测序 |
| 2.2.8 仪器设备 |
| 2.3 主要试验方法 |
| 2.3.1 RNA的提取 |
| 2.3.1.1 准备工作 |
| 2.3.1.2 具体步骤 |
| 2.3.2 EcGS1 cDNA的克隆 |
| 2.3.2.1 用RT-PCR的方法获得EcGS1保守片段 |
| 2.3.2.2 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 2.3.2.3 连接转化、测序 |
| 2.3.2.4 EcGS1基因5’RACE |
| 2.3.2.5 EcGS1基因3’RACE |
| 2.3.2.6 EcGS1基因cDNA全长克隆 |
| 2.3.3 EcGS1基因序列分析 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 RNA电泳图 |
| 2.4.2 EcGS1保守片段扩增产物电泳图 |
| 2.4.3 EcGS1 5’RACE产物克隆及测序 |
| 2.4.4 EcGS1 3’RACE产物克隆及测序 |
| 2.4.5 EcGS1基因cDNA全长获得 |
| 2.4.6 EcGS1基因序列分析 |
| 2.4.6.1 EcGS1基因所编码蛋白的氨基酸序列、保守结构域及亚细胞定位 |
| 2.4.6.2 EcGS1基因编码的氨基酸序列与其他物种相似性比较及进化树 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 不同氮素条件下水葫芦根和叶中三种谷氨酰胺合成酶基因的转录 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 植物材料 |
| 3.2.1.2 试剂 |
| 3.2.1.3 引物 |
| 3.2.1.4 主要仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 Actin基因片段的克隆 |
| 3.2.2.2 荧光定量PCR |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 Actin基因保守片段 |
| 3.3.2 荧光定量结果分析 |
| 3.3.2.1 不同氮素条件下水葫芦根部EcGS1a、EcGS1b和EcGS1c基因的转录 |
| 3.3.2.2 不同氮素条件下水葫芦叶中EcGS1a、EcGS1b和EcGS1c基因的转录 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 不同氮素条件下水葫芦叶和根中谷氨酰胺合成酶活性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.1.1 植物材料 |
| 4.2.1.2 试剂 |
| 4.2.1.3 主要仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 GS的提取操作 |
| 4.2.2.2 GS活性的检测 |
| 4.2.2.3 数据处理 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 不同氮素条件下水葫芦根部GS活性的比较 |
| 4.3.2 不同氮素条件下水葫芦叶GS活性的比较 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1 GS1保守序列片段a BLAST比对 |
| 附录2 GS1保守序列片段b BLAST比对 |
| 附录3 GS1保守序列片段c BLAST比对 |
| 附录4 Actin保守序列片段BLAST比对 |
（7）茶树中与氨基酸合成相关的三个基因的克隆与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物氮代谢的相关研究 |
| 1.1.1 氮素在植物中的功能 |
| 1.1.2 植物对氮素的吸收和同化 |
| 1.1.3 植物氮代谢过程中的相关酶 |
| 1.1.4 茶树体内的氮代谢 |
| 1.2 茶氨酸及其代谢相关酶的研究 |
| 1.2.1 茶氨酸的理化性质 |
| 1.2.2 茶氨酸在茶树体内的分布规律 |
| 1.2.3 茶氨酸的生理功能 |
| 1.2.4 茶树体内茶氨酸的代谢 |
| 1.3. 谷氨酰胺合成酶研究现状 |
| 1.3.1 植物谷氨酰胺合成酶的种类与分布 |
| 1.3.2 植物谷氨酰胺合成酶的分子生物学研究 |
| 1.3.3 植物谷氨酰胺合成酶的表达与调控 |
| 1.4. 精氨酸脱羧酶基因研究现状 |
| 1.4.1 精氨酸脱羧酶基因所编码蛋白质的基本特性 |
| 1.4.2 精氨酸脱羧酶基因基因的表达特性 |
| 1.4.3 精氨酸脱羧酶基因基因的定位与编码蛋白的分布 |
| 2 引言 |
| 2.1 研究目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 茶叶中总RNA的提取 |
| 3.2.3 GS1-1、GS1-2 和 ADC的 3’和 5’端PCR扩增及验证 |
| 3.2.4 原核表达载体pET-32(a)-GS的构建、诱导表达及蛋白检测 |
| 4. 结果与分析 |
| 4.1 GS1-1 目的基因 3′RACE 和 5′RACE 扩增产物的电泳检测及测序 |
| 4.2 GS1-1 拼接全长序列的获得 |
| 4.3 GS1-1 的核苷酸序列分析 |
| 4.4 GS1-1 的蛋白质特征分析 |
| 4.4.1 GS1-1 的ORF及其编码的氨基酸序列预测 |
| 4.4.2 GS1-1 基因的氨基酸序列及理化性质分析 |
| 4.4.3 GS1-1 蛋白质序列的多重比较 |
| 4.4.4 GS1-1 蛋白质的亲水/疏水性分析 |
| 4.4.5 GS1-1 蛋白质的跨膜结构预测 |
| 4.4.6 GS1-1 蛋白质的信号肽预测 |
| 4.4.7 GS1-1 蛋白质的磷酸化位点预测 |
| 4.4.8 GS1-1 蛋白质二级结构预测 |
| 4.4.9 GS1-1 蛋白质亚细胞定位预测 |
| 4.4.10 茶树GS1-1 蛋白的分子进化分析 |
| 4.5 GS1-2 目的基因 3′RACE 和 5′RACE 扩增产物的电泳检测及测序 |
| 4.6 GS1-2 目的基因的PCR扩增 |
| 4.7 GS1-2 的核苷酸序列分析 |
| 4.8 GS1-2 的蛋白质特征分析 |
| 4.8.1 GS1-2 的ORF及其编码的氨基酸序列预测 |
| 4.8.2 GS1-2 基因的氨基酸序列及理化性质分析 |
| 4.8.3 GS1-2 蛋白质序列的多重比较 |
| 4.8.4 GS1-2 蛋白质的亲水/疏水性分析 |
| 4.8.5 GS1-2 蛋白质的跨膜结构预测 |
| 4.8.6 GS1-2 蛋白质的信号肽预测 |
| 4.8.7 GS1-2 蛋白质的磷酸化位点预测 |
| 4.8.8 GS1-2 蛋白质二级结构预测 |
| 4.8.9 GS1-2 蛋白质亚细胞定位预测 |
| 4.8.10 茶树GS1-2 蛋白的分子进化分析 |
| 4.9 ADC基因的 3′和 5′RACE扩增产物的电泳检测及测序 |
| 4.10 ADC基因的PCR扩增 |
| 4.11 ADC的核苷酸序列分析 |
| 4.12 ADC基因的蛋白质特征分析 |
| 4.12.1 ADC基因ORF及其编码的氨基酸序列预测 |
| 4.12.2 ADC基因的氨基酸序列及理化性质分析 |
| 4.12.3 ADC蛋白质序列的多重比较 |
| 4.12.4 ADC蛋白的亲水/疏水性分析 |
| 4.12.5 ADC蛋白的跨膜结构预测 |
| 4.12.6 ADC蛋白的信号肽预测 |
| 4.12.7 ADC蛋白磷酸化位点预测 |
| 4.12.8 ADC蛋白卷曲螺旋结构预测与分析 |
| 4.12.9 ADC蛋白亚细胞定位预测 |
| 4.12.10 茶树ADC蛋白的分子进化分析 |
| 4.13 GS1-2 基因的原核表达 |
| 4.13.1 GS1-2 基因完整阅读框扩增产物的电泳检测 |
| 4.13.2 重组子的鉴定 |
| 4.13.3 pET-32(a)-GS表达蛋白的检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 GS1-1、GS1-2 及A DC的cDNA全长克隆 |
| 5.2 原核表达载体的构建及诱导表达 |
| 5.3 GS1-1、GS1-2 与茶氨酸合成酶及茶树的氮代谢 |
| 5.4 ADC与茶氨酸的生物合成及茶树的氮代谢 |
| 6 结论 |
| 6.1 GS1-13’序列的获得及cDNA序列的生物信息学分析 |
| 6.2 GS1-2 的cDNA全长序列的获得及生物信息学分析 |
| 6.3 ADC的cDNA全长序列的获得及生物信息学分析 |
| 6.4 GS1-2 的原核表达载体的构建与诱导表达及蛋白检测 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）茶树体内茶氨酸合成酶的克隆与异源表达及一氧化氮信号对其调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 茶氨酸及其代谢相关酶的研究 |
| 1.1 茶氨酸的研究现状 |
| 1.1.1 茶氨酸的生理功能 |
| 1.1.2 茶氨酸的理化性质 |
| 1.1.3 茶氨酸在茶树体内的分布及作用 |
| 1.1.4 茶树体内茶氨酸的代谢 |
| 1.2 茶氨酸代谢与调控的研究 |
| 1.2.1 茶氨酸合成酶 |
| 1.2.2 茶氨酸水解酶 |
| 1.2.3 茶树体内茶氨酸合成与转运的位点 |
| 1.2.4 其它合成茶氨酸的酶 |
| 1.2.5 茶氨酸的调控因素 |
| 2 谷氨酰胺合成酶的研究现状 |
| 2.1 植物谷氨酰胺合成酶的种类与分布 |
| 2.2 植物谷氨酰胺合成酶的分子生物学研究 |
| 2.3 植物谷氨酰胺合成酶基因的表达与调控 |
| 2.3.1 启动子特异性 |
| 2.3.2 转录水平调控 |
| 2.3.3 翻译水平的调控 |
| 2.4 谷氨酰胺合成酶转基因植物功能性研究 |
| 2.4.1 转谷氨酰胺合成酶基因对提高植物N素利用与促进生长的影响 |
| 2.4.2 转谷氨酰胺合成酶基因改变作物耐胁迫能力 |
| 3 高等植物氮营养代谢的研究 |
| 3.1 氮素在植物中的功能 |
| 3.2 植物对氮素的吸收与同化 |
| 3.2.1 氮素的吸收 |
| 3.3 植物体内一氧化氮的信号传导作用 |
| 3.3.1 NO的产生 |
| 3.3.2 NO在植物代谢中的信号调节 |
| 3.3.3 NO对基因表达的调控 |
| 4 研究目的意义及内容 |
| 第二章 茶树TS基因的CDNA克隆及原核表达 |
| 1.引言 |
| 2.材料与试剂 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 本章主要实验试剂配方 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 茶树叶片总RNA的提取与鉴定 |
| 3.2 cDNA第一链的合成 |
| 3.3 cDNA特异片段的RT-PCR扩增 |
| 3.4 PCR产物的纯化回收 |
| 3.5 E. coli DH5α感受态的制备 |
| 3.6 PCR产物的连接转化 |
| 3.7 阳性克隆的鉴定和测序 |
| 3.8 pEASY-TS/GS原核表达载体的构建 |
| 3.9 pEASY-TS/GS的诱导表达 |
| 3.10 pMAL-TS/GS原核表达载体的构建 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 茶树叶片总RNA提取质量及cDNA一链反转结果的电泳检测 |
| 4.2 pEASY-TS/GS表达载体的构建 |
| 4.2.1 TS/GS ORF的扩增 |
| 4.2.2 pEASY-TS/GS 连接产物的PCR检测 |
| 4.2.3 pEASY-TS/GS质粒DNA的双酶切鉴定 |
| 4.3 pEASY-TS/GS的原核表达 |
| 4.5 pMAL-TS/GS的原核表达 |
| 5.讨论 |
| 第三章 茶树TS的酶活力鉴定 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 主要仪器设备 |
| 2.2 样品与试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 pMAL-TS直接进行酶促反应 |
| 2.3.2 pMAL-TS诱导蛋白上清液进行酶促反应 |
| 2.3.3 pMAL-TS诱导蛋白纯化后进行酶促反应 |
| 2.3.4 pMALGS酶活性验证 |
| 2.3.5 酶促反应测定的HPLC 分析条件 |
| 2.3.6 酶促反应结果的质谱验证 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 pMAL-TS诱导蛋白酶促反应结果检测 |
| 3.2 pMALGS诱导蛋白酶促反应结果检测 |
| 4. 讨论与小结 |
| 第四章 茶树TS基因在拟南芥中的表达 |
| 1.引言 |
| 2.材料与试剂 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种和载体 |
| 2.2 实验试剂 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 pGREEN35S-TS真核表达载体的构建 |
| 3.2 农杆菌感受态细胞的制备和转化 |
| 3.3 冻融法转化农杆菌 |
| 3.4 农杆菌介导的花序转染法转化拟南芥 |
| 3.4.1 植物的生长 |
| 3.4.2 渗透操作 |
| 3.4.3 转化子的筛选 |
| 3.5 转基因植株的检测 |
| 3.5.1 转化子的遗传分析 |
| 3.5.2 转基因植株的PCR检测 |
| 3.5.3 转基因植株的激光共聚焦显微镜观察 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 pGREEN-35S-TS载体构建 |
| 4.2 农杆菌转化检测 |
| 4.3. 转基因植株的筛选 |
| 4.4. 转基因植株的PCR检测 |
| 4.5 报告基因GFP的表达 |
| 5 讨论 |
| 第五章 茶氨酸合成酶生物信息学分析 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 TS与GS蛋白基本理化性质分析 |
| 2.3 TS与GS蛋白亚细胞定位与功能分析 |
| 2.4 TS与GS蛋白结构域分析 |
| 2.5 TS与GS蛋白序列系统进化树构建 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 TS与GS蛋白基本理化性质分析 |
| 3.2 TS与GS蛋白蛋白亚细胞定位与功能分析预测 |
| 3.3 TS与GS蛋白结构分析 |
| 3.3.1 TS与GS蛋白二级结构分析预测 |
| 3.3.2 TS与GS蛋白三级结构分析预测 |
| 3.4 GS蛋白系统进化树构建 |
| 4. 小结 |
| 第六章 茶树TS多克隆抗体制备 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 E.coli表达pEASY-TS重组蛋白包涵体的纯化 |
| 1.2.2 兔抗TS抗血清的制备及纯化 |
| 1.2.3 茶树组织总蛋白粗提液的制备 |
| 1.2.4 Western blot检测TS抗体特异性 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 pEASY-TS的纯化 |
| 2.2 TS兔多克隆抗体的特异性鉴定 |
| 3.讨论与小结 |
| 第七章 NO对茶氨酸代谢的信号调控 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.3 样品预处理 |
| 2.4 氨基酸含量测定的HPLC 分析条件 |
| 2.5 儿茶素类和嘌呤碱含量测定的HPLC 分析条件 |
| 2.6 茶籽苗各部位蛋白提取及Western Blotting检测 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 不同浓度一氧化氮处理对茶苗茶氨酸代谢的影响 |
| 3.2 不同浓度一氧化氮处理对茶苗茶氨酸和儿茶素代谢的影响 |
| 3.3 不同抑制剂处理对茶苗茶氨酸代谢的影响 |
| 4. 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 附录A 多序列比对图 |
| 附录B NO处理茶幼苗中氨基酸含量测定结果 |
| 附录C 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在学期间发表的论着及科研成果 |
（10）谷氨酰胺合成酶的研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 GS的结构和类型 |
| 2 GS的分子生物学研究 |
| 2.1 GS基因的克隆 |
| 2.2 GS的表达调控 |
| 3 GS的生物信息学研究 |
四、豌豆叶绿体型谷氨酰胺合成酶cDNA的克隆（论文参考文献）
- [1]浒苔氮胁迫下生理响应和MAPK信号通路的初步研究[D]. 尹伊. 苏州大学, 2020(02)
- [2]褪黑素对黑暗胁迫下栀子叶片衰老进程的影响[D]. 王荣. 扬州大学, 2019(02)
- [3]氮素诱导的甜菜gln2的克隆及序列分析[J]. 陈胜勇,李彩凤,侯静,马凤鸣,李观康,何霭如,余小丽,汪云. 核农学报, 2014(10)
- [4]水葫芦胞质型谷氨酰胺合成酶EcGS1全长cDNA的克隆及序列分析[J]. 蒋丽花,傅明辉,李园枚,严国花,郑李军,陈肖丽,彭进平. 生物技术通报, 2014(07)
- [5]粳稻杂种后代氮代谢关键酶活性及相关基因转录表达和序列分析[D]. 徐振华. 东北农业大学, 2014(01)
- [6]水葫芦谷氨酰胺合成酶基因的克隆及表达[D]. 蒋丽花. 广东工业大学, 2014(10)
- [7]茶树中与氨基酸合成相关的三个基因的克隆与分析[D]. 徐乾. 安徽农业大学, 2012(07)
- [8]高等植物谷氨酰胺合成酶基因的研究进展[J]. 于瑶,张汉尧,杜建伟. 山东农业科学, 2012(04)
- [9]茶树体内茶氨酸合成酶的克隆与异源表达及一氧化氮信号对其调控的研究[D]. 陈琪. 安徽农业大学, 2011(07)
- [10]谷氨酰胺合成酶的研究进展[J]. 陈胜勇,李观康,汪云,何霭如,陈傲,余小丽. 中国农学通报, 2010(22)