庚型肝炎病毒杭州株E_2/NS_1基因区的克隆及序列分析

一、庚型肝炎病毒杭州株E_2/NS_1基因区的克隆及序列分析（论文文献综述）

王军^[1]（2008）在《检测乙型肝炎病毒S区“α”决定簇145位点突变株方法的建立及应用研究》文中进行了进一步梳理病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的常见传染病,具有传染性强、传播途径复杂、流行面广泛,发病率较高等特点。临床上主要表现为乏力、食欲减退、恶心、呕吐、肝肿大及肝功能损害,部分病人可有黄疸和发热。有些患者出现荨麻疹、关节痛或上呼吸道症状。病毒性肝炎呈世界性分布,我国是病毒性肝炎的高发区域,其中全国各地人群中乙型肝炎的发病率最高约为50%—70%。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染所至。HBV属嗜肝DNA病毒科,为环状,双股DNA病毒,外层是脂蛋白包膜,含乙肝表面抗原（HBsAg）;内部是核心,含有核酸及乙肝核心抗原（HBcAg）。对人类血清中HBV的电镜检查,显示三种颗粒:即Dane颗粒、球型颗粒和丝状颗粒。HBV感染人体肝细胞后,对肝细胞并无直接致病作用,而是通过细胞免疫和体液免疫造成肝细胞的病毒性免疫损害,并从而引起各种临床表现。大部分患者呈急性发病过程,通常于6个月内痊愈;10%-20%患者可演变成慢性肝炎,继而发展成肝硬化,甚至肝细胞癌;90%以上新生儿感染者成为慢性携带者或慢性肝炎患者。但值得庆幸的是目前已有乙肝疫苗用于预防HBV感染,而且事实证明HB疫苗预防接种已降低了全球流行区人群中HBV的携带率及急性死亡率,且HB疫苗有极好的安全性。然而随着乙肝疫苗普遍推行,对可逃逸HBV中和抗体的表面抗原基因（S基因）变异株感染逐步有所认识。有研究报道,目前在接受乙肝疫苗免疫和肝移植后接受HB免疫球蛋白治疗的患者中,不断发现HBsAg“α”决定簇突变的病毒,同时研究表明常规预防接种所产生的中和抗体对这些病毒无效。对该变异株进行进一步的测序发现,编码“α”决定簇的核苷酸有点突变（587位G→A）,导致HBV S基因区145位氨基酸由甘氨酸（GLy）→精氨酸（Arg）;突变发生的区域是能与疫苗诱导的抗体相结合的重要的抗原决定簇区,因此突变株不能被中和抗体识别,且五年后机体内依旧可以检测到此突变株,提示这种突变是有复制能力且遗传稳定的。HBsAg“α”决定簇145位变异株不仅流行广泛,而且同野生病毒株一样,具有致病性和传播能力,而且与肝炎的不良预后有关。研究表明,145位点的突变会导致HBsAg抗原性改变,致使临床上广泛使用的HBsAg诊断试剂对其无法检出,造成漏检。更为严重的是,用现行乙肝疫苗接种产生的抗体不能中和该变异株。在大范围人群接种乙肝疫苗后,由HBsAg“α”决定簇145位变异株引起的感染,很可能会成为新的公共卫生问题。因此,及时快速准确地检测出“α”决定簇突变变异株的感染很有意义。目前,HBV的变异可通过PCR和DNA测序等技术来检测,但这些方法费用较高、技术难度大,尚不适于大量临床标本的分析。HBV S区145位点变异为HBsAg“α”决定基发生率较高的变异,因此研究该位点变异的快速检测方法具有非常重要的意义。在本文中,克隆145位点变异的HBV S基因,制备HBV变异株的诊断抗原,以此制备单克隆抗体,利用单克隆抗体及其多克隆抗体建立了145位突变HBsAg的快速检测方法,该方法具有较高的检测特异性及敏感性,有望解决隐性HBV持续性感染的漏检问题,从而使更多的人免受HBV的侵袭。建立乙肝变异株的快速诊断方法,为开展流行病学调查和相关的遗传进化关系分析奠定基础。

翟友刚^[2]（2008）在《我国甘肃和陕西省虫媒病毒调查与病毒分子生物学特征研究》文中进行了进一步梳理甘肃省和陕西省位于我国西北部,是通往大西北内陆的门户,也是我国南北气候分界线所在。这两省长期以来是我国虫媒传染病——乙型脑炎的流行疫区,特别是陕西省近年来的乙型脑炎发病率一直较高。甘肃省天水、陇南和平凉市位于甘肃东南部,紧邻乙脑高发区陕西省和四川省,存在着多种虫媒病毒的传播媒介。对陕西省和甘肃省的病毒性脑炎流行病学监测结果显示,在蚊虫活动高峰的夏秋季节,当地存在病因不明的发热和病毒性脑炎患者,提示当地存在其它虫媒病毒性疾病的可能性。目前我国正进行西部大开发,将有大量人员和物资的来往和流动,可能会造成虫媒病毒病的传入、甚至爆发流行。因此,对甘肃省和陕西省进行虫媒病毒病原学的调查,全面了解当地存在和循环的虫媒病毒种类与分布情况,对于研究我国西北的虫媒病毒生物学及分子生物学特征、预防和控制当地虫媒病毒病等均具有重要意义。本课题对甘肃和陕西省部分地区进行虫媒病毒调查,以明确当地存在的虫媒病毒种类与分布,并对近年在虫媒病毒调查中分离到的部分病毒进行详细鉴定和序列分析,以了解我国新分离株的系统分类地位、分子生物学特征及其与国外分离株之间的分子生物学差异。1.甘肃省虫媒病毒调查2006年和2007年7～8月在甘肃省天水、陇南和平凉市的11个县区采集蚊虫标本13872只,分206批进行研磨和病毒分离。结果分离到30个阳性分离物,来自5个蚊种——三带喙库蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、淡色库蚊和伊蚊。经过系统鉴定,共得到4株乙脑病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）、2株盖塔病毒（Getah virus,GETV）、10株版纳病毒（Banna vires,BAV）和17株骚扰阿蚊单组分RNA病毒（Armigeres subalbatus Totivirus,AsTV）,共计33株。从三带喙库蚊和淡色库蚊中分离到的病毒最多,分别是22株和4株;4种病毒均能从三带喙库蚊中均分离到。对新分离病毒分子生物学特征分析显示,4株JEV均为基因Ⅰ型病毒,分离株之间E基因核苷酸和氨基酸序列同源性为98.3%～100%和99.8%～100%。新分离JEV与疫苗株SA14-14-2在E基因区段存在11处共同的氨基酸差异,但差异位点均不处于决定抗原性的关键氨基酸位点3’非编码区中均有典型的基因Ⅰ型序列缺失特征。2株新分离的GETV与我国其它省份和其它国家分离株的遗传关系很相近,Capsid基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性在97%以上。发现分离株GS07-KD22在Capsid基因中紧邻第76位后出现1个氨基酸的插入。2株GETV在3’UTR区第45nt～54nt间都存在与我国其它省分离株及蒙古和俄罗斯分离株相同的10个核苷酸缺失。对10株新分离BAV的核酸带型分析发现新分离株与北京分离株（BJ95-75）在第6和第9条带稍有差异,第6条带稍小,而第9条带稍大。甘肃省分离株第12片段核苷酸和VP12蛋白序列中存在多个不同于其它地域分离株的共同差异位点,10株病毒在第689位核苷酸发生缺失,并且VP12基因有两个连续的起始密码子,终止密码子与印度尼西亚分离株相同（TGA）,而不同于云南和北京分离株（TAA）。10株BAV与基因A型分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为91.4%～93.3%和91.8%～93.7%,与基因B型分离株的同源性分别为88.6%～89.9%和85.5%～87.9%。系统发生分析结果显示甘肃省分布的BAV具有明显的地域特征,属于基因A型内的一个新亚型。2.陕西省虫媒病毒调查2006年9月在陕西省安康市和宝鸡巿共4县区采集蚊虫标本2765只,分离到1株昆虫浓核病毒（Densovirus,DNV）和1株AsTV。对AsTV分离株SaX06-AK20进行了全基因组特征研究,AsTV全长7510 bp,有两个开放读码框（ORF）,ORF1长4443nt,编码病毒衣壳蛋白CP,ORF2长2286 nt,编码聚合酶RdRp。AsTV与单分体病毒科成员的核苷酸同源性为17.5%～41.4%,氨基酸同源性为5.3%～43.1%,系统发生分析表明AsTV是该科内的一种新病毒,或者可能是一种新的感染节肢动物的dsRNA病毒科的代表。3.病毒分子生物学特征研究对我国分离到的10株GETV进行序列测定和分子特征分析,测定了其中3株（M1、HB0234、YN0540）的全基因组序列,和另7株的E2基因和3’UTR。3株病毒与其它国家分离株的全基因组序列同源性分别是97.4%～98.8%（核苷酸）和98.7%～99.6%（氨基酸）。10株病毒之间E2基因核苷酸序列同源性在97.7%～99.9%,发现所有分离株在3’UTR第45-54位均出现10个核苷酸的缺失（YN0540有9个缺失）,这同我国台湾、蒙古和俄罗斯分离株的一致。系统发生分析显示我国分离的GETV之间均有很近的亲缘关系。对16株分离自辽宁、云南、新疆和贵州省的淡色库蚊浓核病毒（CppDNV）进行鉴定和分子特征分析,结果显示CppDNV的完整编码区长3,335nt,有3个开放读码框,ORF1,2,3分别为2,376 nt、1,092 nt和1,071 nt,分别编码非结构蛋白1（NS1）、非结构蛋白2（NS2）和衣壳蛋白（VP）。CppDNV（JZ-16）全编码区序列同AalDNV-1、AalDNV-2、AaeDNV、AalDNV-3和HeDNV的同源性在81.6%～93.0%（核苷酸）之间,而且16株CppDNV分离株之间的同源性在98%以上,序列差异和系统发生分析显示CppDNV是一类新的DNV变异株。4.其它工作此外,对7株河南省2006年病毒分离物、1株新疆病毒分离物,1株蝙蝠病毒分离物和6株贵州省2006年病毒分离物进行了鉴定和/或分子生物学特征分析。河南省7株病毒均为基因Ⅰ型JEV,贵州省鉴定出3株基因Ⅰ型JEV,而新疆的病毒分离物M0507JS9可能为芜箐黄花叶病毒科（Tymoviridae）内的新成员。本课题的意义本课题对甘肃省和陕西省部分地区进行了虫媒病毒调查,在甘肃省分离到4种病毒,在陕西省分离到2种病毒。在甘肃省首次分离到基因Ⅰ型JEV,同时发现甘肃省分布的BAV具有明显的地域特征,并且还分离到一种新病毒（AsTV）。这些数据不但丰富了我国和甘肃省、陕西省虫媒病毒的种类,而且为了解当地传染病病因以及积极预防和控制相关虫媒病毒疾病提供了重要的信息。对我国分离到的GETV、CppDNV以及河南、新疆、贵州等省的病毒分离物的鉴定和/或基因分子生物学特征分析,明确了这些病毒的分类地位及与国内外分离株之间的分子生物学差异,丰富了我国虫媒病毒分子生物学研究内容,为深入研究我国存在和流行的虫媒病毒积累了知识。

任林柱^[3]（2007）在《口蹄疫病毒反向遗传技术体系及分子标记疫苗株的构建》文中认为构建口蹄疫病毒（FMDV）的反向遗传技术体系,对分子标记疫苗的研究具有重要的理论意义和广阔的应用前景。本研究用RT-PCR法及RACE法构建了口蹄疫病毒WFL株全长cDNA克隆,经体外转录后进行细胞转染,结果证明可以拯救出口蹄疫病毒;为了提高拯救病毒的数量,又分别构建了口蹄疫病毒全基因组真核表达质粒和口蹄疫病毒ORF真核表达质粒,并将两种真核表达质粒与体外转录RNA共转染细胞,结果揭示,两种真核表达质粒与体外转录本共转染后均可拯救出口蹄疫病毒;在全长cDNA克隆的基础上,又将GFP基因插入到口蹄疫病毒P3基因内,构建了口蹄疫病毒P3基因插入突变的分子标记毒株。本研究成功地建立了口蹄疫病毒反向遗传技术体系,并获得了口蹄疫病毒分子标记疫苗株,从而为分子标记疫苗的开发应用奠定了基础。

徐高原^[4]（2005）在《猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究》文中进行了进一步梳理乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）和伪狂犬病（Pseudorabies）均是危害养猪业的重大疫病,主要引起种猪繁殖障碍,给养猪业造成了巨大的经济损失。同时乙型脑炎还是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一,对人类危害巨大。猪是乙型脑炎病毒的主要扩增宿主和传染源,因此控制猪的乙型脑炎不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。目前免疫接种仍是预防和控制这两种传染病最有效的措施,而现有乙型脑炎疫苗,无论是灭活疫苗还是弱毒活疫苗都存在一定的缺陷。鉴于此,本研究从乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株中扩增了其主要免疫原性基因E和E-NS1;实现了E基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的高效表达;构建了表达乙型脑炎病毒主要免疫原性基因E或NS1的重组伪狂犬病病毒,并对所构建的重组伪狂犬病病毒的生物学特性、安全性及免疫原进行了研究。其具体研究内容包括: 1.乙型脑炎病毒E和E-NS1基因的克隆与序列分析 根据已报道的乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列,设计了2对引物,采用一步法RT-PCR扩增了其主要免疫原性基因E和E-NS1,并进行了克隆与序列测定。结果发现,与已报道的SA14-14-2疫苗株核苷酸序列比较,E基因的同源性为100%,E-NS1基因片段发生了3个核苷酸的改变,即1596 g-a、2639 t-c、2817 g-a,并导致了2个氨基酸的改变,即E207 G-R,NS114 G-S,而2639 t-c为无义突变。 2.E基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的高效表达 将E基因RT-PCR产物克隆到pBlusecriptⅡSK（+）载体中,然后分别亚克隆到原核表达载体PGEX-KG和真核表达载体pcDNA3.1+中,筛选重组质粒,分别命名为pKG-E和pcDNA3.1E。pKG-E转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导后获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为83KD,主要以包涵体形式存在,Western blot分析证实表达产物具有良好的生物学活性。pcDNA3.1E采用脂质体法转染BHK-21细胞,48小时后收集转染的细胞处理后,进行SDS-PAGE电泳,经Western blot分析,在53KD处出现特异性反应带,而对照未出现特异性反应带,证实E基因在哺乳动物细胞中获得表达。 3.表达乙型脑炎病毒E或NSl蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建 设计1对引物从质粒pTNSl上扩增NSl基因,双酶切后将NSl基因定向插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体pgG-Uni中,得到重组转移载体pgG-NSl:用BamHl和EcoRI酶切pSK-E,回收E基因后与经相同酶切的载体pgG-Uni相连,得到重组转移载体pgG-E。将重组转移载体用KpnI线性化后分别与经EcoRI酶切消化的PRV Ea TK-/gG-/LacZ+突变株基因组DNA共转染PK-15细胞,经空斑筛选纯化、PCR、Southern印迹、Western blot等鉴定,获得了2株纯化的重组病毒,分别命名为TK-/gG-/NS1+和TK-/gG-/E+。重组病毒部分生物学特性研究表明:本研究构建的2株重组病毒遗传稳定性良好:外源基因的插入不影响伪狂犬病病毒在细胞

陈勇,洪艳,杨连华,凌志强,俞为群^[5]（2001）在《庚型肝炎病毒杭州株E2/NS1基因区的克隆及序列分析》文中研究指明目的 获得散发性庚型肝炎病毒杭州株E2 /NS1区部分核酸序列。方法 选择 1例浙江杭州散发性庚型肝炎患者 ,从其血清中分离HGVRNA ,通过逆转录套式聚合酶链反应（RT nPCR）法 ,扩增该散发性HGV（HZ 2株 ）E2 /NS1区部分cDNA片段 ,然后克隆到质粒 pGEX 4T 3中 ,并进行核苷酸序列分析。结果 HGV杭州株与河北株 （HGVC96 4、美国株 ）（HGU44 40 2 ）的核苷酸同源性为 92 5 %和 89 8% ,氨基酸同源性为 98 0 %和 93 9%。结论 该项研究将为HGV诊断试剂盒的研制及基因工程疫苗的研制提供资料

二、庚型肝炎病毒杭州株E_2/NS_1基因区的克隆及序列分析（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、庚型肝炎病毒杭州株E_2/NS_1基因区的克隆及序列分析（论文提纲范文）

（1）检测乙型肝炎病毒S区“α”决定簇145位点突变株方法的建立及应用研究（论文提纲范文）

（2）我国甘肃和陕西省虫媒病毒调查与病毒分子生物学特征研究（论文提纲范文）

（3）口蹄疫病毒反向遗传技术体系及分子标记疫苗株的构建（论文提纲范文）

（4）猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究（论文提纲范文）

四、庚型肝炎病毒杭州株E_2/NS_1基因区的克隆及序列分析（论文参考文献）

• [1]检测乙型肝炎病毒S区“α”决定簇145位点突变株方法的建立及应用研究[D]. 王军. 东北师范大学, 2008(05)
• [2]我国甘肃和陕西省虫媒病毒调查与病毒分子生物学特征研究[D]. 翟友刚. 中国疾病预防控制中心, 2008(10)
• [3]口蹄疫病毒反向遗传技术体系及分子标记疫苗株的构建[D]. 任林柱. 吉林大学, 2007(03)
• [4]猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D]. 徐高原. 华中农业大学, 2005(03)
• [5]庚型肝炎病毒杭州株E2/NS1基因区的克隆及序列分析[J]. 陈勇,洪艳,杨连华,凌志强,俞为群. 中国公共卫生, 2001(01)

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