一、吡喹酮治疗对日本血吸虫31/32kDa抗体的影响（论文文献综述）
王丽萍[1]（2021）在《基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价》文中指出当前我国正处于消除血吸虫病的攻坚阶段,日本血吸虫病疫情整体处于极低水平,但境外输入性病例时有报道,迫切需要更加快捷、敏感的检测方法,用于病例诊断或风险识别。目的:结合侧流层析试纸条（Lateral flow dipstick,LFD）和重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification,RPA）方法,建立能简单、快速识别日本血吸虫、曼氏血吸虫核酸的可视化检测技术,初步评价其对血吸虫中间宿主或终宿主感染早期的检测价值,并通过试剂、时间的折算,分析成本投入情况。方法:以日本血吸虫SjR2和SjG55A作为靶基因,结合Primer Premier 5软件及手工辅助设计引物,通过简易检出限、特异性确定引物序列,初步建立RPA检测方法。以RPA检测为基础,设计探针,确定最佳反应条件,初步建立LFD-RPA检测方法。以PCR方法为平行对照,评价建立检测方法的最低检出限、敏感性、特异性及不同终止方式检测结果。制备不同比例混合的阳性钉螺和阴性钉螺基因组,评价LFD-RPA方法的最低检出混合度。分别取毛蚴感染后不同时期钉螺样本,用解剖镜检法判断钉螺感染情况,提取钉螺样本DNA,评价LFD-RPA方法对钉螺不同感染阶段的血吸虫核酸检测能力,进行RPA、PCR的平行检测。LFD-RPA方法检测现场采集的钉螺样本,RPA、PCR为平行对照,评价LFD-RPA方法的检测效果。以曼氏血吸虫SmCOX1为靶基因,结合Primer Premier 5软件、手工辅助设计筛选引物,确定最终引物序列,初步建立RPA检测方法。以RPA检测为基础,设计探针,确定最佳反应条件,初步建立LFD-RPA检测方法。以文献中针对曼氏血吸虫Sm1-7基因设计的引物为基础,设计特异性探针,探索最佳反应温度及时间,建立LFD-RPA检测方法。以PCR为平行对照,评价建立方法的最低检出限及与特异性。建立40尾、80尾曼氏血吸虫尾蚴梯度感染小鼠的动物模型（简称“40尾组”、“80尾组”）,并于感染后不同时间收集小鼠粪便及血清,提取DNA,用PCR、RPA、LFD-RPA方法进行平行检测,全面评价LFD-RPA方法检测曼氏血吸虫早期感染的效能。随后,收集本实验室常用的血吸虫核酸检测生物学技术的基础数据,包括需要的试剂盒或主要试剂的具体名称、单盒价格、单盒反应次数以及来源。计算不同检测方法的每个样本投入成本,包括每个样本检测所需的试剂成本、劳动力成本。以每个样本投入试剂成本、劳动力成本为基础,在设置阴参、阳参的单个样本检测情况下,计算每次检测投入试剂成本、劳动力成本。同时,将96个反应作为不同检测方法批量检测总量。计算批量检测情况下,每个样本检测投入试剂成本、劳动力成本。并按照实验所需仪器数量将每种方法的技术要求划分为简单、一般、复杂、极复杂四个等级,对LFD-RPA和其他核酸检测方法的成本和技术要求进行比较分析。结果:成功建立了以日本血吸虫SjR2、SjG55A为靶基因的LFD-RPA检测方法以及以曼氏血吸虫SmCOX1、Sm1-7为靶基因的LFD-RPA检测方法,各方法的最优反应参数均为39℃、20min。冰上静置、滴加DNA提取液或酚氯仿三种终止LFD-RPA反应的方式对检测结果无影响。以SjR2、SjG55A为靶基因建立的LFD-RPA方法对含有日本血吸虫靶基因的质粒和成虫基因组最低检出限分别为1copies/μl、102copies/μl和1fg/μl、10fg/μl,SjR2-LFD-RPA更佳,优于对应RPA、PCR方法。SjG55A-LFD-RPA方法与曼氏血吸虫、阳性双脐螺、埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA均无交叉反应。SjR2-LFD-RPA方法和埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA无交叉反应,但可检出曼氏血吸虫、阳性双脐螺,提示与曼氏血吸虫有交叉反应。SjR2-LFD-RPA、SjG55A-LFD-RPA分别能最低检出2000只、1500只阴性钉螺中的1只阳性钉螺,最低检出混合度均高于对应RPA、PCR。SjR2-LFD-RPA、SjR2-RPA、PCR方法均可检出20组1:50的混合阳性钉螺,3中方法的敏感性均为100%。检测日本血吸虫实验室感染钉螺发现,血吸虫感染前6w的钉螺均镜检阴性,自7w出现镜检阳性钉螺,7～11w钉螺镜检阳性率分别为10%、30%、20%、40%、30%;SjR2-RPA在钉螺感染后的1d、3d、5d、1～11w 的检测阳性率分别为 90%、70%、50%、70%、60%、70%、60%、50%、20%、30%、70%、50%、50%、50%。SjR2-LFD-RPA 在钉螺感染后的1d、3d、5d、1～11w 的检测阳性率分别为 90%、80%、70%、70%、60%、60%、70%、70%、30%、30%、70%、50%、50%、50%。经统计学分析发现,SjR2-LFD-RPA、PCR、RPA的总检出率高于解剖镜检法。对现场采集共1550只钉螺的31管钉螺混合DNA的检测结果显示,SjR2-LFD-RPA的检出率为12.90%,其他方法均为阴性。建立的SmCOX1-LFD-RPA对质粒、曼氏血吸虫成虫基因组DNA检出限达到 10copies/μl、1fg/μl,均高于对应 RPA 及 PCR。建立的 Sm1-7-LFD-RPA 对质粒、成虫基因组DNA的检出限更高,达到1copies/μl、1fg/μlSmCOX1-LFD-RPA、Sm1-7-LFD-RPA对曼氏血吸虫、阳性双脐螺特异,与埃及血吸虫、日本血吸虫、阳性钉螺、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫无交叉反应。检测曼氏血吸虫尾蚴感染小鼠模型的样本发现,不管是40尾组还是80尾组,SmCOX1-RPA和PCR对感染后1～8w的混合血样、混合粪样均无阳性结果出现。SmCOX1-LFD-RPA、Sm1-7-LFD-RPA检测40尾组混合血样和混合粪样时,均是自感染后3w开始出现较浅条带,随着感染时间的增加检测条带越来越明显,分别在感染后第8w和第6～8w时条带颜色达到最深;检测80尾组混合血样和混合粪样时,SmCOX1-LFD-RPA、Sm1-7-LFD-RPA均是自1w开始出现较浅条带,1～8w期间条带颜色逐渐变深,感染后第6～8w的条带颜色达到最深。总体上,Sm1-7-LFD-RPA的条带颜色要比SmCOX1-LFD-RPA的明显清晰一些。不同检测方法的成本比较及分析中,计算每次检测总成本后发现,PCR（453 RMB/次检测）>LFD-RPA（400RMB/次检测）>冻干粉态RPA（330RMB/次检测）>LAMP（300RMB/次检测）、液态RPA（300RMB/次检测）。每次检测时间排序为:PCR（2～2.5 h/次检测）>RPA（0.8～1 h/次检测）>LAMP（0.5～1 h/次检测）>LFD-RPA（0.4～0.6h/次检测）。以96个反应为一批量检测,计算不同检测方法的每批检测时间为:PCR（2～2.5 h/批检测）>RPA（3.2～4 h/批检测）>LAMP（2～4h/批检测）>LFD-RPA（1.6～2.4h/批检测）。批量检测情况下,每个样本检测投入总成本情况:LFD-RPA（112.77 RMB/批量每个样本）>冻干粉态RPA（61.92 RMB/批量每个样本）>LAMP（60.64 RMB/批量每个样本）>液态RPA（51.06 RMB/批量每个样本）>PCR（5.81 RMB/批量每个样本）。按是否需要特殊仪器设备分析实验操作人员技术要求,PCR检测方法和RPA归为“复杂”,而LAMP检测方法和LFD-RPA检测方法“简单”。结论:本研究建立了日本血吸虫、曼氏血吸虫核酸检测LFD-RPA技术,具有较低检出限,该方法操作简单,结果获取方式直接。SjG55A-LFD-RPA可用于日本血吸虫感染混合钉螺的检测,SjR2-LFD-RPA对曼氏血吸虫有交叉反应。基于SmCOX1、Sm1-7靶基因建立的LFD-RPA检测方法具有较低检出限,和其他虫种无交叉反应,有望用于曼氏血吸虫早期感染宿主识别。LFD-RPA作为较新的核酸检测技术,目前检测成本较高,但由于操作简便、敏感性高、特异性强,今后用于血吸虫病现场检测及风险监测有广阔的应用前景。
任雨琪[2]（2021）在《日本血吸虫病免疫保护候选抗原的筛选》文中认为血吸虫病是分布最为广泛的人类寄生虫病之一。对血吸虫病的治疗,目前仍主要依靠吡喹酮,其未来耐药性问题值得担忧,开发新药和研制安全高效的疫苗,是持续控制血吸虫病的方向之一。实验室前期利用i TRAQ蛋白组学技术对单性感染雌虫（SF）和两性感染雌虫（MF）的差异表达蛋白进行分析,对其中部分差异表达蛋白的RNA干扰研究发现这些蛋白具有影响血吸虫生长发育和生殖能力的生物学功能,本研究从中选取了SjTCTP、SjUL30、CAX72463、SjAnnexinA13,4个在MF中高表达的蛋白,以及1个在SF中高表达的SjLWR蛋白进行了免疫保护相关研究。1.日本血吸虫病免疫保护候选抗原的筛选扩增SjTCTP、SjUL30、CAX72463及SjLWR的编码区,构建重组表达质粒,利用亲和层析法对蛋白进行纯化,其中,SjTCTP与SjLWR以可溶性蛋白形式表达,SjUL30与CAX72463以包涵体蛋白形式表达。在动物免疫保护实验中,四个蛋白里SjTCTP诱导免疫保护效果最好,与ISA206佐剂组相比,SjTCTP诱导产生了38.76%（P<0.01）的减虫率,57.26%（P<0.01）的减卵率,32.41%（P<0.01）的每条雌虫减卵率。我们对筛选出的SjTCTP进行了免疫保护重复试验,与ISA206佐剂组相比,r SjTCTP本次诱导产生了44.7%（P<0.01）的减虫率、57.94%（P<0.01）的减卵率以及47.57%（P<0.01）的减孵化率,单个雌虫产卵率下降了43.16%。ELISA检测显示,r SjTCTP能诱导小鼠产生较高水平的特异性Ig G抗体,其特异性抗体在首免后相当高。Ig G1和Ig G2a抗体亚型分析显示,Ig G1/Ig G2a的比值在免疫后第14d达到最高,然后缓慢下降,在攻击感染日本血吸虫后,又出现轻微上升趋势。2.日本血吸虫TCTP表达受抑制及其免疫引起宿主免疫反应的初步分析实验室前期通过体内RNAi发现SjTCTP基因表达受抑制显着影响血吸虫的生长,生殖和发育能力,我们的r SjTCTP免疫保护试验也发现该蛋白免疫对宿主有较好的免疫保护功能,且免疫造成攻击感染的血吸虫繁殖能力和卵胚孵化能力的下降。本研究利用CBA法对SjTCTP表达干扰及免疫后小鼠脾细胞产生的细胞因子进行测定,发现SjTCTP干扰刺激组与NC干扰刺激组相比,细胞因子IFN-γ与IL-10显着升高。免疫组实验小鼠脾细胞分泌的细胞因子IL-2、IL-10水平升高。另外,激光共聚焦发现,日本血吸虫TCTP表达受抑制对雌虫卵巢的发育和成熟有明显抑制作用。3.日本血吸虫Annexin A13的克隆、表达及免疫保护效果评估扩增日本血吸虫Annexin A13基因的开放阅读框,序列分析预测其分子量大小为39.60KDa,等电点5.11,SjAnnexinA13不含有信号肽结构,也没有N-糖基化位点及O-糖基化位点。构建重组表达质粒p ET-28a-SjAnnexinA13,然后纯化获得其可溶性重组蛋白。动物免疫保护实验中,该重组蛋白与PBS组比较诱导了65.35%（P<0.01）的减虫率,与206组比,诱导产生48.24%（P<0.05）的减虫率,ELISA检测发现,随着免疫次数的增加,其特异性Ig G抗体水平逐渐升高。4.SjTCTP和SjAnnexinA13的联合RNA干扰研究使用RNAi技术同时干扰宿主小鼠体内血吸虫SjTCTP和SjAnnexinA13基因的表达,与NC组比较来说,SjAnnexinA13和SjTCTP联合干扰组减虫率46.67%（P<0.01）,SjAnnexinA13组减虫率26.67%（P<0.01）。综上所述,我们从4个蛋白中,筛选出了效果较好的免疫保护候选抗原r SjTCTP,在两次免疫保护实验中,r SjTCTP均诱导BALB/c小鼠产生了较显着的免疫保护效果。对SjTCTP表达干扰及免疫后的宿主小鼠体内免疫反应分析发现,血吸虫SjTCTP表达受抑制引起宿主体内细胞因子IFN-γ与IL-10显着升高;r SjTCTP免疫则使宿主体内细胞因子IL-2、IL-10水平升高。
邵兵[3]（2021）在《吡喹酮调节小鼠免疫预防日本血吸虫感染的研究》文中提出日本血吸虫病严重威胁人类和家畜健康,目前仍流行于中国和菲律宾等东南亚国家,是我国公共卫生问题之一。已知接触含有血吸虫尾蚴的疫水是人和家畜感染血吸虫的必要条件。吡喹酮（PZQ）是治疗人和家畜血吸虫病的临床首选化学药品。近年来,一系列研究证实PZQ可以调节宿主免疫。本实验室前期研究发现水牛在感染前17天和18天服用PZQ可以使得体内虫体发育率（虫体数/感染尾蚴数）减少80%以上。本文以小鼠为动物模型研究了PZQ预防日本血吸虫感染的量效关系、保护期和起效时间,为如何应用PZQ预防人和家畜感染日本血吸虫提供参考。比较感染前预服PZQ的BALB/c小鼠与对照组小鼠的虫荷数、雌虫数和平均每克肝脏虫卵数（EPG）,根据预防效果明确PZQ预防感染的有效剂量、保护期和起效时间。在测定有效剂量的两个独立试验中,感染前15天注射或口服不同剂量PZQ均可使小鼠虫荷数、雌虫数和肝脏EPG显着降低。有效剂量为2次口服（间隔24 h）或1次注射300 mg/kg,可使虫荷数、雌虫数和肝脏EPG减少稳定在50%以上。在服用有效剂量PZQ后的前两天预防效果最好,减虫率超过92%,然后维持显着减虫率直至21天。对来源于PZQ预处理组小鼠和空白对照组的小鼠虫体进行了形态学观察,发现在PZQ预处理组中存活的虫体长度较短,口吸盘和腹吸盘等器官变小,雌虫子宫内虫卵数减少。细胞因子、NO、5-HT和血液学指标的检测表明,预服PZQ可引起宿主的生理变化,调节天然免疫。提高外周血血清中NO、IFN-γ和IL-2的水平,降低TGF-β的水平,这可能是PZQ预处理小鼠虫体数量减少和残存虫体发育不良的原因。抗血吸虫特异性抗体检测表明,感染前预服PZQ对获得性免疫无影响。采用高效液相色谱法（HPLC）监测给药后24-96 h小鼠血浆PZQ浓度,给药后72 h后血浆PZQ浓度低于检出限,说明PZQ对血吸虫的预防作用不是由于PZQ直接作用的结果。结论:预服PZQ可诱导宿主在服药后21天内对日本血吸虫感染产生部分预防作用。这种预防作用不是PZQ对血吸虫的直接作用,而是PZQ调节宿主生理变化特别是调节天然免疫的结果。这些发现可能为血吸虫病流行区接触疫水的人群（如渔民）和牲畜（牛、羊等）提供一种有效的预防技术,并为阐明PZQ治疗血吸虫病的机制和PZQ作为免疫调节剂以防止其他病原体感染提供新的见解。
王丽萍,邓王平,贾铁武,秦志强,许静[4]（2021）在《免疫学技术检测吡喹酮治疗后血清抗日本血吸虫抗体转归的meta分析》文中研究指明目的评价免疫学技术检测日本血吸虫感染病人和病畜经吡喹酮治疗后血清抗血吸虫抗体转归情况。方法检索中国知网、万方数据、PubMed、ScienceDirect等数据库,筛选1991—2020年公开发表的关于日本血吸虫病免疫学检测的文献,提取纳入研究文献相关数据,使用Rev Man 5.3统计软件绘制漏斗图分析发表偏倚,采用meta分析进行综合评价。结果最终纳入40篇文献,其中中文文献33篇、英文文献7篇,均为采用间接血凝试验（IHA）或酶联免疫吸附试验（ELISA）开展的研究。效应量合并分析结果显示,吡喹酮治疗后6个月内,ELISA和IHA法检测血清抗日本血吸虫抗体阴性率分别为45.36%[95%可信区间（CI）:（43.96%,46.76%）]和20.83%[95%CI:（19.69%,21.97%）];治疗后6～12个月,ELISA和IHA法检测抗体阴性率分别为62.95%[95%CI:（61.59%,64.31%）]和55.61%[95%CI:（54.21%,57.01%）];治疗12个月后,ELISA和IHA法检测抗体阴性率分别为85.92%[95%CI:（84.94%,86.90%）]和86.90%[95%CI（85.95%,87.85%）]。结论随着吡喹酮治疗后时间推移,IHA、ELISA法检测血清抗日本血吸虫抗体阴性率升高。在治疗后12个月内,2种方法检测血清抗日本血吸虫抗体阴性率总体较低,但在治疗12个月后如无新的疫水接触史,抗体阴性率较高。
王伟,赵成思,缪婷婷,周春雷,张成诚,秦敏,邵天业,王勇[5]（2020）在《吡喹酮治疗对日本血吸虫感染小鼠脾巨噬细胞增殖和炎症反应的抑制作用》文中研究指明目的探讨吡喹酮治疗对日本血吸虫感染小鼠脾巨噬细胞数量和功能的影响。方法取35只雌性C57BL/6J小鼠随机分为健康对照组、未感染吡喹酮组、感染组、感染吡喹酮治疗组、溶剂对照组、过继转移组和过继转移治疗组等7组,每组5只,后5组每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴（14±2）条。感染后10周,溶剂对照组小鼠尾静脉注射无菌生理盐水,过继转移组和过继转移治疗组小鼠尾静脉注射（1～2）×106个GFP+Ly-6C+单核细胞。未感染吡喹酮组、感染吡喹酮治疗组和过继转移治疗组小鼠给予吡喹酮治疗,每隔12 h灌胃300 mg/kg;健康对照组、感染组、溶剂对照组和过继转移组小鼠每隔12 h灌胃1%羧甲基纤维素溶液。连续28 d后,取健康对照组、未感染吡喹酮组、感染组和感染吡喹酮治疗组小鼠脾组织,采用HE染色评价吡喹酮治疗对小鼠脾组织损伤的影响;流式细胞术检测小鼠脾组织Ly-6C+巨噬细胞的数量和Ly-6C+巨噬细胞胞内Ki-67的表达,评价吡喹酮对其增殖的影响;实时荧光定量PCR （qRT-PCR）检测小鼠脾巨噬细胞炎症因子TNF-α、 IL-1β的表达。流式细胞术检测溶剂对照组、过继转移组和过继转移治疗组小鼠脾中GFP+Ly-6C+巨噬细胞百分率,评价吡喹酮对其募集的影响。另取感染后10周小鼠脾贴壁巨噬细胞进行体外实验,吡喹酮处理组用20μg/ml吡喹酮处理24 h,溶剂对照组用二甲基亚砜处理,流式细胞术检测两组贴壁细胞中Ly-6C+巨噬细胞的百分率。结果外观及HE染色结果显示,健康对照组和未感染吡喹酮组小鼠脾脏实质内结构分明,蓝色白髓、红色红髓结构清楚,脾细胞排列规则,未出现脾脏病理损伤;感染组小鼠脾脏肿大,组织学结构紊乱,红髓、白髓分布不清,脾窦可见部分充血,细胞排列不规则;感染吡喹酮治疗组小鼠脾肿大的表现有所缓解,实质结构得以修复,红髓和白髓重新形成,脾细胞分布较规则。流式细胞术检测结果显示,溶剂对照组、过继转移组和过继转移治疗组小鼠脾中均未发现GFP阳性的巨噬细胞。健康对照组、未感染吡喹酮组、感染组、感染吡喹酮治疗组小鼠脾脏总巨噬细胞的百分率分别为（6.1±1.4）%、（6.0±0.6）%、（21.3±2.3）%和（7.8±1.6）%, Ly-6C+巨噬细胞的相对百分率分别为（27.3±2.4）%、（26.6±1.5）%、（57.3±5.2）%和（25.7±2.8）%, Ly-6C+巨噬细胞的绝对数量分别为（0.3±0.1）×106、（0.3±0.1）×106、（23.7±4.8）×106和（0.4±0.1）×106,胞内Ki-67阳性的Ly-6C+巨噬细胞百分率分别为（39.8±7.6）%、（51.3±2.3）%、（64.3±11.5）%和（40.4±2.9）%;以上指标感染组均高于健康对照组（P <0.05或0.01）;感染吡喹酮治疗组均低于感染组（P <0.01）。qRT-PCR结果显示,健康对照组、未感染吡喹酮组、感染组和感染吡喹酮治疗组小鼠脾脏巨噬细胞TNF-αmRNA相对转录水平分别为0.9±0.1、 1.2±0.01、 6.3±0.7和0.9±0.1, IL-1βmRNA相对转录水平分别为1.0±0、 1.7±0.7、 9.4±0.9和1.4±0.1。感染组均高于健康对照组（P <0.05或0.01）;感染吡喹酮治疗组均低于感染组（P <0.01）。体外实验的流式细胞术检测结果显示,溶剂对照组和吡喹酮处理组Ly-6C+巨噬细胞百分率分别为（85.4±0.6）%、（82.1±0.6）%,二者差异有统计学意义（P <0.05）。结论吡喹酮通过抑制日本血吸虫感染小鼠脾组织中Ly-6C+巨噬细胞的增殖,减少其炎症因子的表达,从而缓解小鼠脾肿大和炎症反应。
杨珊珊[6]（2020）在《日本血吸虫3天童虫蛋白质组学分析及SjPHB的生物学特性研究》文中研究说明日本血吸虫病是流行广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。肺期童虫体小且结构简单,是血吸虫在终末宿主体内发育的早期阶段,和在移行过程中虫体数量减少的最主要阶段。因此,肺期童虫被视作宿主免疫系统攻击的重要靶标。1.日本血吸虫3d肺期童虫蛋白质组分析利用非标记定量蛋白质组学比较分析了日本血吸虫3 d童虫与42 d成虫的蛋白组成和表达差异,结果显示3d虫体上调差异表达蛋白194个、下调差异435个。选取C1LVH1、Q86E32等19个差异表达蛋白进行PRM验证,结果与非标记定量蛋白质组学结果一致。GO分析显示,差异表达蛋白主要参与大分子复合物组装、ATP依赖性微管马达的调节、ATP活性的正调节及ATP依赖性微管正调控等生物学过程。2.日本血吸虫Prohibitin 1（SjPHB1）和Prohibitin 2（SjPHB2）的克隆表达及动物免疫保护效果评估利用PCR和RACE分别扩增获得SjPHB1和SjPHB2的基因片段。序列分析表明,SjPHB1含825bp的ORF,编码274个氨基酸,无信号肽和跨膜区;SjPHB2含900bp的ORF,编码299个氨基酸,无信号肽,具有1个跨膜结构区。成功构建和表达了pET-32a（+）-SjPHB1和pGEX-4T-1-SjPHB2重组表达质粒,诱导表达的融合蛋白均以包涵体的形式存在。在变性条件下,纯化获得rSjPHB1和rSjPHB2融合蛋白,分子量分别为47kDa和59kDa。Western blotting结果显示rSjPHB1和rSjPHB2免疫血清能识别特异性条带,表明rSjPHB1和rSjPHB2具有较好的免疫原性。将rSjPHB1和rSjPHB2分别结合ISA206佐剂免疫小鼠,结果重组蛋白未能诱导显着的免疫保护效果。3.SjPHB1和SjPHB2的表达、定位及RNA干扰研究利用qPCR分析SjPHB1和SjPHB2在虫体不同时期的表达情况,结果表明SjPHB1和SjPHB2在检测的日本血吸虫虫体发育的各个阶段均有表达,在童虫、成虫、虫卵、毛蚴和尾蚴等各个时期SjPHB1和SjPHB2的转录水平差异较大。SjPHB2在3d和7d童虫及虫卵中的表达明显高于SjPHB1及其它各个时期,但在毛蚴中SjPHB1的表达水平较SjPHB2高。SjPHB1和SjPHB2在雌虫中的转录水平均高于雄虫,但两者在雌雄虫的表达水平是相反的。免疫荧光结果显示SjPHB1和SjPHB2均在细胞膜和细胞质中表达,它们在膜部分也有重合。在体外培养中siRNA727可干扰SjPHB1转录水平降低4.6%22.67%,siRNA796和siRNA325可干扰SjPHB2转录水平降低5.8%19.7%,siRNA727和siRNA796组合干扰效果较好,可诱导SjPHB1和SjPHB2基因转录分别下降37.39%68.58%和34%68.31%,观察可见虫体发黑变粗,体表有破裂现象。在体内干扰时siRNA727/796组合干扰SjPHB1和SjPHB2转录水平降低31.20%和17.33%。与对照组相比,siRNA727/796组合诱导了BALB/c获得31.35%的减虫率。扫描电镜观察显示,siRNA727/796干扰组可致雌雄虫体表结构破坏。
王小莉[7]（2019）在《吡喹酮衍生物DW-3-15抗日本血吸虫的生物学效应及作用机制研究》文中研究指明日本血吸虫病（Schistosomiasisjaponica）是一种由日本血吸虫感染而引起的危害严重的人畜共患寄生虫病,主要流行于亚洲地区。该病的传播需要借助于中间宿主钉螺,其逸出的感染期尾蚴经皮肤侵入人体。成虫寄生于肝门肠系膜静脉系统,产出虫卵,最终可致慢性肝纤维化。全球范围内控制血吸虫病的流行仍是以降低发病率为主的策略,经济条件或地理环境限制了大规模灭螺的开展,因而药物化疗是目前控制血吸虫病主要手段。吡喹酮（Praziquantel,PZQ）自问世以来,因其出色的疗效和广谱的适用性被WHO指定为抗血吸虫病的首选药物。在PZQ长期大范围给药过程中,血吸虫耐药性问题也越来越引起人们的重视。目前在实验室条件下可诱导出对PZQ抗性虫体、临床上PZQ治疗不敏感案例均已有报道。因此,寻找能够替代或补充PZQ的备选新药势在必行。DW-3-15是本实验室拥有知识产权的一种PZQ新衍生物（专利号:ZL201110142538.2）,在PZQ药效基团联合青蒿琥酯活性基团的设计策略上,引入过氧桥键。在前期研究中,实验室合成的DW-3-15已显示出抗日本血吸虫活性。在本课题中,借助药物公司进行商品化大量合成DW-3-15,进一步完善对DW-3-15抗日本血吸虫生物学效应的评价。同时利用蛋白组学、抗体制备等技术,对药物作用后虫体进行蛋白、转录水平检测,为深入阐明DW-3-15抗日本血吸虫作用机制及寻找潜在药物靶点提供科学依据。第一部分吡喹酮衍生物DW-3-15体外对日本血吸虫的杀伤作用目的探讨DW-3-15体外对日本血吸虫不同发育阶段的杀伤效应。方法1.日本血吸虫双性尾拗经皮肤感染小鼠,感染后14d、21d及35d经肝门静脉灌注法收集童虫、（雌、雄）成虫。挑取5条成虫/孔和8条童虫/孔于6孔板,加入3 ml/孔DMEM培养基,加入终浓度50～100μmol/L DW-3-15。培养24 h后换液,加入不含药物DMEM培养基继续孵育至96 h。在培养期间,每天观察虫体活力情况及统计存活率。培养结束后,采集虫体图像,收集（雌、雄）成虫,扫描电镜观察体表超微结构变化。2.挑取1对合抱成虫/孔于6孔板,向3 ml/孔DMEM培养基中加入50～100μmol/LDW-3-15共培养24h,1、6、12和24h观察合抱虫体分离情况。24h换液,加入不含药物DMEM培养基继续培养至96h,培养结束收集虫卵,统计雌虫产卵量。结果1.体外实验显示:在24～96h,随着DW-3-15浓度升高日本血吸虫（雌、雄）成虫、童虫的活力度、存活率逐渐下降;与对照组比较,50～100 μmol/LDW-3-15作用下（雌、雄）成虫和童虫活力值均明显降低,差异均有统计学意义（均P<0.001）;100 μmol/L PZQ组雌、雄虫活力降低率为89.6%～98.5%、91.9%～97.8%,100 μmol/L DW-3-15作用下雌、雄虫活力降低率分别为91.1%～97.8%、93.3%～96.3%,两者之间差异均无统计学意义;100μmol/LDW-3-15作用下21d、14d童虫的活力值均明显低于100μmol/L PZQ组（P<0.05）,降低率分别为91.7%～94.4%、95.4%～99.1%;在24～96h,50～100μmol/LDW-3-15可致合抱成虫全部分离,显着降低雌虫体外产卵量（均P<0.001）。2.形态观察显示:在96h,100 μmol/LDW-3-15作用下雌、雄虫呈极度收缩、不透明,似杆状或棒状;21d童虫皱缩而短小,虫体不透明;14d童虫收缩变短,虫体内部出现空泡状改变。在100μmol/LPZQ作用下,（雌、雄）成虫体态僵硬,呈螺旋状卷曲;21d、14d童虫体态柔和,活力正常。3.电镜结果显示:与对照组比较,DW-3-15、PZQ作用下雌、雄虫体表皮层呈多样化损伤改变,如褶嵴融合、渗出、表面剥脱、坑状或腐蚀状或泡状改变,暴露皮下肌层组织,甚至造成肌层组织损伤。结论PZQ衍生物DW-3-15体外对日本血吸虫成虫、童虫均具有显着的杀伤作用,其抗成虫效果与PZQ相仿,对童虫杀伤作用优于PZQ。第二部分吡喹酮衍生物DW-3-15体内抗日本血吸虫的生物学效应目的探讨DW-3-15体内对日本血吸虫的杀伤效应及对虫卵肉芽肿形成的影响。方法1.感染了日本血吸虫双性尾蚴的小鼠被随机分7组。在感染后35d,实验组分别灌胃100～400 mg/kg DW-3-15、PZQ,对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。感染后42d解剖小鼠,统计减虫率、肝/体重、脾/体重;收集动物肝脏,一部分肝脏消化后统计减卵率,余下肝脏HE染色观察虫卵肉芽肿直径变化。2.感染了双性尾蚴的小鼠被随机分3组。在感染后14d,实验组分别灌胃400 mg/kg DW-3-15、PZQ,对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。停药后21d解剖小鼠,统计减虫率、肝/体重、脾/体重;收集动物肝脏,一部分消化后统计减卵率,余下肝脏HE染色观察虫卵肉芽肿直径变化。结果1.成虫阶段治疗:随着DW-3-15用药剂量升高,小鼠体内检获虫体数、虫卵数、肉芽肿平均直径逐渐降低;与未治疗组比较,100～400mg/kg DW-3-15治疗后检获虫体数、虫卵数均显着减少（均P<0.05）;400mg/kg DW-3-15治疗组减虫率、减卵率分别达64.2%、86.2%,低于400mg/kg PZQ治疗组减虫率（98.8%）、减卵率（93.5%）;200～400mg/kg DW-3-15用药可使小鼠肝/体重、脾/体重显着降低（均P<0.05）;400mg/kg DW-3-15治疗可减轻肝脏中虫卵肉芽肿病变,降低肉芽肿平均直径（P<0.01）。2.童虫阶段治疗:与未治疗组相比,DW-3-15治疗组小鼠体内检获虫体数、虫卵数均显着降低（均P<0.05）,减虫率、减卵率分别为77.0%、95.4%,高于PZQ治疗组减虫率（17.4%）、减卵率（14.9%）;DW-3-15治疗组小鼠脾脏变小,肝脏表面可见少量肉芽肿结节,质地变软,肉芽肿平均直径、肝/体重、脾/体重均显着降低（均P<0.001）。结论DW-3-15体内对14d童虫、35d成虫均具有显着的杀伤作用,可缓解肝脾病变,减轻肝纤维化,具有发展成为抗日本血吸虫新药的应用前景。第三部分吡喹酮衍生物DW-3-1 5体内作用后日本血吸虫成虫的TMT蛋白质组分析目的分析DW-3-15治疗前后日本血吸虫成虫表达的差异蛋白质谱,探讨DW-3-15抗日本血吸虫分子作用机制。方法日本血吸虫双性尾蚴感染小鼠35d后,实验组灌胃400 mg/kg DW-3-15,对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。感染后42d经肝门静脉灌注法收集成虫,提取虫体总蛋白。应用TMT结合液相色谱-质谱联用技术,鉴定DW-3-15治疗前后日本血吸虫成虫表达的蛋白谱,通过数据库比对,利用生物信息学对虫体表达的差异蛋白进行分析。结果在DW-3-15治疗后,雌虫表达差异蛋白407个,其中上调蛋白187个,有钙结合蛋白、myoferlin蛋白等;下调蛋白220个,有转录相关蛋白、核糖体蛋白、组蛋白乙酰转移酶等;差异蛋白主要参与核糖体代谢、内质网蛋白合成、转录等过程。雄虫表达差异蛋白41个,其中上调蛋白30个,有钙结合蛋白、跨膜蛋白等;下调蛋白11个,有肌动蛋白、鞘脂激活蛋白B等;差异蛋白主要参与钙离子结合、溶酶体代谢等。结论在DW-3-15治疗后日本血吸虫雌、雄虫中分别鉴定到与虫体生长、发育、代谢等相关差异蛋白,为DW-3-15抗日本血吸虫分子作用机制研究提供基础数据。第四部分日本血吸虫组蛋白乙酰转移酶（SjHAT）多克隆抗体的制备及DW-3-15体内对成虫SjHAT的影响目的表达重组SjHAT蛋白,制备抗SjHAT多克隆抗体,分析DW-3-15治疗前后对日本血吸虫成虫SjHAT表达水平影响,探讨DW-3-15抗日本血吸虫作用机制。方法1.采用密码子优化SjHAT表达序列,应用基因化学合成法、同源重组构建表达质粒,通过原核体系大量表达重组蛋白;重组SjHAT蛋白免疫兔4次,制备抗SjHAT多克隆抗体,ELISA检测效价及特异性IgG抗体水平。2.日本血吸虫双性尾蚴感染小鼠35d后,随机分2组。实验组灌胃400 mg/kg DW-3-15,对照组小鼠灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。感染后42d收集雌、雄虫,提取虫体总蛋白;以抗SjHAT多克隆抗体为一抗,western blotting检测DW-3-15治疗前后雌、雄虫SjHAT表达水平;实时定量PCR分析DW-3-15治疗前后雌、雄虫SjHAT基因转录水平变化。结果1.成功构建了重组表达质粒petB2M-SjHAT,并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中获得大量表达;4次免疫可产生较高水平特异性IgG抗体,得到纯化的抗SjHAT多克隆抗体（约50kDa,效价>105）。2.Western blotting分析显示正常雌虫SjHAT表达水平高于正常雄虫（P<0.05）;DW-3-15治疗后雌虫SjHAT表达水平明显降低（P<0.05）。QPCR分析显示正常雌虫SjHAT基因转录水平高于雄虫SjHAT转录水平;DW-3-15可降低雌虫SjHAT基因转录水平（均P<0.05）。结论SjHAT在正常雌、雄虫中均有一定表达,DW-3-15可抑制雌虫SjHAT表达,为阐明SjHAT可能是DW-3-15抗日本血吸虫作用靶点提供依据。综上,PZQ衍生物DW-3-15在体外、内兼有抗日本血吸虫童虫、成虫生物学活性,并可缓解肝脾病变,减轻肝纤维化;TMT定量蛋白质组学鉴定到DW-3-15治疗前后日本血吸虫雌、雄虫表达的差异蛋白质谱;成功制备抗SjHAT多克隆抗体;从转录、蛋白水平分析DW-3-15作用雌、雄虫SjHAT变化。本研究系统地评价了 DW-3-15抗日本血吸虫的生物学效应,初步探讨了 DW-3-15抗日本血吸虫的分子机制,揭示了 SjHAT可能是DW-3-15抗血吸虫作用靶点,为进一步筛选抗血吸虫新药和新靶点提供参考依据。
余丹[8]（2019）在《吡喹酮（PZQ）诱导日本血吸虫耐受虫体及其TMT/LC-MS蛋白组学分析差异表达蛋白的研究》文中进行了进一步梳理血吸虫抗药性是血防工作关注的焦点之一,已有曼氏血吸虫产生吡喹酮（PZQ）抗性的报道。迄今,吡喹酮仍是治疗日本血吸虫病的唯一特效药,显然亦存在产生抗性的潜在危险。因此,研究能替代吡喹酮的抗血吸虫新药十分必要。然而,吡喹酮应用于治疗血吸虫病已有30多年,但其药物靶点及作用机制仍未阐明。课题组前期研究已建立了应用PZQ亚治疗剂量对小鼠体内日本血吸虫成虫进行抗性诱导的方法,并成功诱导出PZQ耐受日本血吸虫虫体。本研究拟在前期工作基础上诱导并收集PZQ耐受虫体并应用蛋白质组学方法对其进行差异表达蛋白检测分析,为深入阐明PZQ抗日本血吸虫机制及明确潜在靶点提供科学依据亦为研制抗血吸虫新药提供新的策略。第一部分 日本血吸虫PZQ耐受虫体的诱导目的:诱导日本血吸虫PZQ耐受虫体,为研究分析PZQ耐受虫体和未诱导虫体的差异表达蛋白奠定基础。方法:采用课题组前期研究的日本血吸虫PZQ耐受虫体诱导方法进行诱导,日本血吸虫单雄尾蚴（60～80（?））感染小鼠,感染3 w后,用PZQ亚治疗剂量（ED50,25.98 mg/kg）连续灌胃给药30 d,停药3 w,再用PZQ治疗剂量（200 mg/kg）连续灌胃给药5 d,停药2 w后,颈椎脱臼法处死并解剖小鼠,采用肝门静脉灌注法冲虫,挑选100%活力状态的虫体置于提前预热的DMEM低糖培养液中培养,加入不同浓度的PZQ,16 h后用生理盐水洗涤虫体三次后换上新的培养液,继续培养72 h,每24 h在体视显微镜下观察记录虫体活力分值,评价PZQ耐受虫体对药物的敏感性。结果:PZQ体外抗未诱导日本血吸虫成虫的临界致死浓度（虫体经药物作用后72 h后活力降低率达到90%的最低浓度）为1000 μmol/L,该浓度作用于PZQ耐受虫体72 h后活力降低率为66.7%,与未诱导虫体的活力降低率（92.2%）相比具有明显差异（P<0.0001）,PZQ体外抗日本血吸虫PZQ耐受虫体的临界致死浓度为抗日本血吸虫成虫的4倍（4000 μmol/L）。结论:经PZQ诱导的日本血吸虫对PZQ的敏感性显着下降3倍,表现出明显的耐受性,表明PZQ耐受虫体诱导成功可用于后续实验研究。第二部分 WESTERN BLOTTING识别日本血吸虫PZQ耐受虫体功能性蛋白及质谱分析鉴定目的:应用日本血吸虫感染兔血清经蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）对日本血吸虫PZQ耐受虫体与未诱导虫体差异表达蛋白进行免疫识别并分析鉴定,为阐明PZQ的作用机制及其潜在靶点提供新的实验依据。方法:应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（SDS-PAGE）分离两种虫体的总蛋白,应用Western Blotting识别出日本血吸虫PZQ耐受虫体与未诱导虫体的功能性蛋白差异表达位点,并切取凝胶中可被感染兔血清识别出的功能性差异蛋白表达位点的条带,应用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术筛选鉴定出PZQ耐受虫体与未诱导虫体差异表达蛋白分子,在线Uniprot检索差异蛋白分子的功能特性。结果:Western Blotting识别出日本血吸虫PZQ耐受虫体中有3个差异表达的功能性蛋白位点,灰度分析结果显示其中有2个上调位点分别为a（2.5±0.06 vs 1.00±0.00,P<0.0001）和 b（1.60±0.03 vs 1.00±0.00,P<0.0001）,有 1 个下调位点为c（0.70±0.00 vs 1.00±0.00,P<0.0001）。应用LC-MS质谱技术筛选及鉴定PZQ耐受虫体功能性蛋白位点,结果表明,其中有5个蛋白分子差异表达,PZQ耐药性虫体差异表达的蛋白分子主要为1个膜相关蛋白和3个钙离子（Ca2+）结合相关蛋白（钙蛋白酶B、钙蛋白酶和亮氨酸拉链包含EF手型的跨膜蛋白1）。结论:PZQ持续压力下能够促进或抑制某些日本血吸虫特定蛋白质分子的表达,并发现本研究中的钙蛋白酶B、钙蛋白酶和亮氨酸拉链包含EF手型的跨膜蛋白1均是Ca2+结合相关蛋白,参与细胞信号传导过程,提示PZQ的抗虫靶点可能与钙离子结合相关蛋白有关。第三部分 日本血吸虫PZQ耐受虫体TMT差异性蛋白分析及鉴定目的:日本血吸虫PZQ耐受虫体与未诱导虫体两者的差异性表达蛋白分析及鉴定,同时与第二部分结果相比较筛选出功能相似或类似蛋白分子,应用TMT蛋白组学技术进一步阐明PZQ的作用机制及其潜在靶点。方法:应用定量蛋白质组学串联质量标签（TMT）标记技术对日本血吸虫PZQ耐受虫体与未诱导虫体总蛋白进行检测,并进行蛋白质定量分析,筛选PZQ耐受虫体中发生显着变化的差异蛋白（差异倍数超过1.3倍作为显着上调,差异倍数小于1/1.3作为显着下调）,并将筛选到的差异蛋白进行生物信息学分析。结果:应用TMT标记定量蛋白组学组学分析得出总共有31个蛋白分子在日本血吸虫PZQ耐受虫体中差异表达,其中6个蛋白分子表达上调,25个蛋白分子表达下调,其中四跨膜蛋白表达差异倍数（ratio）为2.031,差异最显着。差异表达蛋白富集的生物通路主要为核糖体和溶酶体,核糖体途径中有2个核糖体蛋白分子表达上调和9个核糖体蛋白分子表达下调,溶酶体途径中有3个蛋白分子（四跨膜蛋白、V型质子ATP酶蛋白脂质亚单位、参与神经醇磷脂过程SJCHGC01869蛋白）表达上调和4个蛋白分子（羧肽酶、具有半胱氨酸型肽酶活性的假想蛋白、具有脱氧核糖核酸酶Ⅱ活性的未知蛋白和参与蛋白质去甲酰化过程的SJCHGC04223蛋白）表达下调。结论:本研究应用TMT蛋白组学技术检测（定量检测）结果显示PZQ耐受虫体中的四跨膜蛋白差异表达下调最为显着,而LC-MS技术（定性检测）则发现呈差异表达的有1个膜相关蛋白（FAM62B蛋白）,1个跨膜蛋白（亮氨酸拉链包含EF手型的跨膜蛋白1）,两种检测技术结果均提示PZQ抗日本血吸虫的潜在作用靶蛋白可与日本血吸虫膜相关蛋白/跨膜蛋白及Ca2+结合相关蛋白分子（钙蛋白酶B、钙蛋白酶）密切相关,其确切靶点蛋白分子有待进一步生物学研究。此外,这两种不同的方法均检测到与血吸虫体生命进程中蛋白质的翻译过程相关的差异表达蛋白分子如TMT检测到的核糖体蛋白与LC-MS技术检测到的翻译起始因子IF-2非分类亚单位蛋白,结果提示在PZQ持续压力下可能影响蛋白质的翻译过程进而导致虫体死亡,这也可能是PZQ的抗虫作用机制之一。
王伟[9]（2015）在《吡喹酮对日本血吸虫感染鼠脾脏巨噬细胞功能的影响》文中研究说明血吸虫病（schistosomiasis）是血吸虫寄生人体引起的寄生虫病,血吸虫病危害严重,是全球重要的公共卫生问题之一。我国主要流行的是日本血吸虫病,至2012年底,大约还有20万的血吸虫病患者。日本血吸虫病造成的病理损伤主要是由于虫卵沉积在肝脏形成肉芽肿,导致门静脉阻塞,继而发生肝脏纤维化和脾脏肿大并伴脾脏功能亢进的临床现象。目前针对血吸虫病患者脾脏肿大及脾脏功能亢进,并无有效的内科治疗方法,通常选择脾脏全切或部分切除的姑息治疗方式。血吸虫病造成的门静脉持续高压致脾脏淤血和脾脏自身的免疫细胞功能改变是导致脾脏肿大的两个关键因素。日本血吸虫感染至慢性期,可见小鼠脾脏异常肿大。吡喹酮作为一种传统的抗血吸虫药物,过去人们主要关注其杀虫作用。本实验室前期研究中发现,慢性血吸虫病小鼠经吡喹酮治疗后,门静脉高压得到明显缓解,且脾脏及巨噬细胞系的炎性因子基因表达和细胞因子表达均受到明显抑制,但巨噬细胞作为介导脾脏炎症和脾功能亢进病理过程的重要细胞亚群,吡喹酮是否能影响其数量和功能尚未见详细研究报道。本研究从脾脏巨噬细胞入手,研究感染及吡喹酮治疗前后脾脏巨噬细胞数量及功能变化情况,进一步揭示吡喹酮治疗血吸虫感染后脾脏肿大及脾功能亢进的机制。已知巨噬细胞受不同诱导因素作用分别可通过经典途径和替代途径活化并分化为M1和M2两型细胞。相关文献报道,M1和M2型分别与机体Th1型和Th2型免疫应答相关,且在不同临床疾病中,M1和M2型巨噬细胞分化趋势不同。M1型巨噬细胞活化呈现出炎性免疫应答,常与糖尿病,关节炎,动脉硬化等疾病发生相关。M2型巨噬细胞活化呈现抑制炎性应答,常参与纤维化发生,伤口愈合,肿瘤转移等病理生理现象。在血吸虫感染中,已知肝脏及腹腔巨噬细胞存在极性转化的现象,证明其在感染早期以表达M1型巨噬细胞为主,而感染慢性期主要表达M2型巨噬细胞。但在日本血吸虫感染慢性期脾脏组织中,巨噬细胞的极化方向尚不明确。为此,我们通过观察感染慢性期脾脏巨噬细胞极化情况,分析巨噬细胞不同亚群在脾脏肿大中可能发挥的调控作用,及吡喹酮对脾脏巨噬细胞极化的影响。本课题主要研究吡喹酮对日本血吸虫感染慢性期脾脏巨噬细胞数量和功能的影响。首先,我们建立日本血吸虫感染12周模型及吡喹酮化疗模型,观察吡喹酮对脾脏肿大的治疗效果;接着,我们研究吡喹酮化疗后脾脏巨噬细胞的数量及功能变化情况;最后,进一步研究吡喹酮化疗后,脾脏巨噬细胞的极化情况。本研究获得如下主要结果:1.日本血吸虫感染鼠经吡喹酮治疗后脾脏病理状况明显改善我们采用日本血吸虫感染12周小鼠模型,用300mg/kg剂量吡喹酮100μl体积给药治疗。结果显示,杀虫3天后小鼠脾脏大小,脾脏重量和脾重指数有一定恢复,治疗4周后小鼠脾脏大小基本恢复正常,脾脏重量和体重指数均恢复正常水平,与同期感染血吸虫16周组小鼠相比有明显差异。脾脏组织病理切片H.E染色结果显示,感染血吸虫16周小鼠脾脏组织结构遭到明显破坏,红髓、白髓分布不明显,可见部分脾窦充血,脾细胞排列不规则,且有坏死的组织。经吡喹酮3天杀虫后,脾脏组织结构有一定程度恢复,但尚没形成清楚红、白髓结构。经吡喹酮4周治疗后对脾脏实质内结构有修复作用,形成清晰白髓、红髓结构,脾细胞分布较规则。以上结果提示:吡喹酮持续4周化疗对感染血吸虫16周小鼠脾脏肿大效果明显且对病理损伤的脾脏组织结构有显着改善作用。2.日本血吸虫感染鼠经吡喹酮治疗后脾脏巨噬细胞数量比例明显减少,分泌炎性细胞因子功能有下降趋势为了观察吡喹酮对脾脏中巨噬细胞的影响,对脾脏组织进行免疫组化分析,我们采用标记巨噬细胞表面分子CD68为一抗,HRP标记山羊抗鼠兔通用二抗,DAB显色来区分巨噬细胞,阳性巨噬细胞显棕黄色。通过照片观察及数据统计分析,结果显示:感染16周后脾脏巨噬细胞显色面积和数量比例明显上调,经吡喹酮3天杀虫后巨噬细胞显色密度和数量有一定降低。经吡喹酮4周治疗后巨噬细胞显色密度和数量比例显着下降,趋于正常对照组。进一步地,我们采用流式分析脾脏中巨噬细胞的比例变化,标记F4/80+CD11b+为阳性巨噬细胞,结果显示:感染16周鼠脾脏中巨噬细胞比例明显上升,而经过吡喹酮治疗后脾脏巨噬细胞比例明显下降。且持续吡喹酮治疗4周,巨噬细胞比例进一步下降,较吡喹酮3天杀虫有明显差异。同时取脾脏单个核细胞培养,贴壁分离巨噬细胞并培养24小时,取上清检测细胞因子,显示吡喹酮4周治疗后炎性因子IL-6的水平有所下降。这些结果提示:吡喹酮持续4周治疗对感染血吸虫16周鼠脾脏的巨噬细胞数量比例有显着下调作用,对其分泌炎性因子有一定抑制作用。3.日本血吸虫感染鼠经吡喹酮治疗后脾脏巨噬细胞极化方向发生变化,M1型巨噬细胞数量比例下调为了进一步评价吡喹酮对巨噬细胞两群细胞的极化的影响,我们用流式分析两群细胞的变化,标记F4/80+CD11b+CD16/32+为阳性M1型巨噬细胞,标记F4/80+CD11b+CD206+为M2型巨噬细胞,结果显示:感染血吸虫16周后脾脏巨噬细胞以M1型巨噬细胞为主,经吡喹酮治疗后M1型巨噬细胞比例下调,吡喹酮4周治疗后较吡喹酮3天杀虫后M1型巨噬细胞比例下降更明显,而M2型巨噬细胞变化均不明显。这些结果提示:吡喹酮持续4周治疗使感染血吸虫16周鼠脾脏的M1型巨噬细胞比例下调。4.日本血吸虫感染鼠经甲氟喹治疗后脾脏病理状况,及巨噬细胞数量比例和M1型巨噬细胞比例变化为了进一步确认吡喹酮对巨噬细胞数量功能及极化方向产生的影响,我们采用另一种杀虫效果显着的药物甲氟喹,观察其对血吸虫感染12周小鼠脾脏肿大治疗及对脾脏巨噬细胞的作用。结果显示:甲氟喹治疗后,脾脏依然呈现肿大状态且脾脏组织病理损伤没有得到改善,脾脏巨噬细胞所占比例与感染组比例相近,且仍表达与感染组相似的M1型巨噬细胞为主的分型极化趋势。这些结果提示:从另一角度证明,吡喹酮不仅是通过杀虫缓解门静脉持续高压,从而使肿大的脾脏恢复正常,而且吡喹酮对脾脏肿大作用中关键的巨噬细胞群可能发挥作用,对巨噬细胞数量比例、功能和极化方向有调节作用。
杨振坤[10]（2014）在《日本血吸虫吡喹酮抗性虫株免疫学特性研究》文中研究指明血吸虫又称裂体吸虫（Schistosoma）是一类寄生于人体及哺乳动物静脉血管内的寄生虫，引起以免疫病理损伤为主、严重危害流行区社会经济发展和人民身体健康的人畜共患病-血吸虫病（Schistosomiasis）。该疾病在世界范围内广泛分布，有78个国家和地区流行血吸虫病，其中有52个国家属于高危流行区。据WHO报告，2012年全球有约7亿人受血吸虫病威胁，约2.5亿血吸虫病病人，每年至少还有20万人死于血吸虫病。我国流行日本血吸虫病，目前主要流行于长江中下游地区，是我国主要寄生虫病之一。经过50多年血吸虫病防治工作，我国的血吸虫病流行得到有效的控制，目前，上海、浙江、福建、广东和广西5省市区已达到传播阻断标准，四川、云南和江苏3省达到传播控制水平。但截至2012年底，全国仍有病人约24万，有螺面积36.9万公顷，且每年都有新发钉螺地区，严重危害流行区居民健康和经济发展。因此，现阶段血吸虫病仍是我国重要的公共卫生问题。吡喹酮是20世纪70年代研制的抗绦虫药，随后发现其对人体5种主要血吸虫均有杀灭作用，同时由于吡喹酮在治疗血吸虫病中具备高效低毒，服用方便等特点，使其随即取代其他抗虫药物，被WHO推荐为治疗血吸虫的首选口服药物。吡喹酮口服后在消化道内吸收良好，吸收部位主要在小肠，给药5min即可测得原药，1-1.5h血药浓度达峰值，原药半衰期为1-1.5h，大部分由肾脏排泄。虽然对吡喹酮杀灭血吸虫作用机制已有大量研究，但至今仍没有完全阐明，目前对其认知大致可概括为方面，一是对虫体的直接作用，包括对虫体活动的影响、皮层的损害和代谢的影响；二是对宿主免疫效应的依赖性及其协同作用。全世界每年约有2.5亿血吸虫病人需要吡喹酮的治疗，在高危流行区采用吡喹酮周期的、大范围人群化疗是目前全球血吸虫病控制的主要策略，但已有研究报道对同一人群采用吡喹酮反复进行抗虫治疗，有导致血吸虫对吡喹酮产生抗药性风险。1994年，Doenhoff等首次在实验室内采用亚治疗剂量吡喹酮诱导筛选出曼氏血吸虫吡喹酮抗性株，同时，在曼氏血吸虫病流行的非洲和南美洲现场，也发现曼氏血吸虫对吡喹酮的敏感性下降；埃及血吸虫也出现对吡喹酮治疗不敏感的病例报告。2011年，梁幼生等在实验室采用亚治疗剂量吡喹酮同样地诱导出2株日本血吸虫吡喹酮抗性株。迄今为止吡喹酮是目前现场大规模使用的唯一抗血吸虫的治疗药物，由于还没有可完全替代吡喹酮药物及有效的疫苗出现，因此开展对吡喹酮抗性株的相关研究，了解掌握吡喹酮抗性株生物学、免疫学特性，及产生抗性的分子机制等，可对控制吡喹酮抗性的扩散提供资料，同时也为发现和分析药物作用靶点提供新的途径。已有研究证实，曼氏血吸虫吡喹酮抗性株和敏感株各发育阶段的对吡喹体外反应性均存在显着差异，体内成虫和虫卵阶段对吡喹酮的反应也存在差异；在基因表达水平上，抗性株某些蛋白表达水平要高于敏感株，如ABC转运蛋白和细胞色素-C氧化酶。但目前关于日本血吸虫吡喹酮抗性株的研究资料很少，对日本血吸虫吡喹酮抗性株的免疫学特性研究尚未见专门研究，本研究试图通过对抗性株和敏感株成虫和虫卵的抗原组分，及抗性株和敏感株感染宿主后宿主反应性等进行研究，旨在了解吡喹酮抗性株免疫学特性变化及为抗性机制研究提供实验依据，内容主要分以下3方面：第一部分：日本血吸虫吡喹酮抗性株及敏感株成虫和虫卵抗原组分分析以定量的日本血吸虫尾蚴感染小鼠，感染42天后剖杀，抗凝生理盐水灌注法收集成虫，并取肝脏组织。肝脏组织用组织匀浆机打碎，分别通过120目/25.4mm2和160目/25.4mm2不锈钢网筛分离浓集虫卵。在玻璃匀浆器中加入适量细胞裂解液和成虫或虫卵研磨裂解，超声离心后吸取上清，获相应可溶性蛋白。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，凝胶经考马斯亮蓝染色后用Image Lab凝胶图像分析软件进行比较，分析抗性株和敏感株抗原组分及分子量；同时用quantityone分析泳道光密度，比较条带蛋白浓度。结果显示：经电泳分离，雌虫AWA组分可分成21-23条带，雄虫AWA组分可分成26-36条带，SEA组分可分成22-31条带。雌虫与雄虫AWA两者间有较大的差异，其中在40-50kDa和80kDa两区间差别最大；而SEA与AWA亦有较大的差异，尤其是40-50kDa区间，此外，SEA与雄虫AWA在80kDa差异较大，但与雌虫AWA差异不明显。研究提示：吡喹酮抗性株和敏感株各抗原组分间差异不明显，但泳道光密度分析显示，在相同蛋白浓度下，泳道光密度强度存在差异，提示与敏感株相比抗性株存在部分蛋白表达水平的上调和下调，其中以SEA和雌虫AWA较为明显。第二部分吡喹酮对日本血吸虫吡喹酮抗性株及敏感株皮层的损伤小鼠分别感染抗性株和敏感株尾蚴后分为用药组和不用药对照组，用药组于感染后第35-37天分别灌服75mg/kg、300mg/kg吡喹酮，灌服吡喹酮10min和12h后分别解剖小鼠，采用灌注法收集成虫，置预冷4%戊二醛溶液中固定，经梯度浓度丙酮脱水、喷金，用扫描电子显微镜观察虫体皮层超微结构的改变，比较抗性株和敏感株皮层损伤的差异。结果显示：对照雌虫体表光滑，体表无圆凸，部分体壁可见有呈锥状的小棘；对照雄虫体表体棘呈海绵状排列，具有明显而复杂的褶嵴和凹窝，排列成网格状，全身布满隆起的圆凸，其中分布有蒂乳突状感觉器。75mg/kg PZQ处理后，敏感株雌虫虫体体表褶嵴出现局限性水肿，而抗性株则没有明显改变；12h后，敏感株体表可见较多完整或破损的泡状物，而抗性株褶嵴则开始出现少量水肿；300mg/kg PZQ给药10min后，抗性株和敏感株虫体肌肉严重收缩，体表纹理开始紊乱不平滑，对比两者，敏感株体表收缩程度大于抗性株，同时抗性株和敏感株体表均出现因小棘凹陷而致的陷窝，给药12h后，敏感株出现完整或破损的泡状物，而抗性株仅出现完整的泡状物。雄虫在75mg/kg PZQ处理10min后，敏感株虫体皮层出现空泡和完整或破损的泡状物，而抗性株虫体皮层仅出现空泡和少量泡状物；给药12h后，敏感株虫体皮层有广泛的泡状物，并伴有破溃、糜烂和剥落，而抗性株虫体皮层仅在局部出现完整或破损的泡状物；在300mg/kg PZQ处理10min后，敏感株和抗性株虫体因收缩致皮层褶皱纹理紊乱，并有陷窝出现，给药12h后，敏感株虫体皮层褶皱肿胀、融合，并广泛糜烂、剥落，已看不清体表褶皱结构；抗性株虫体虽亦有大量糜烂、剥落，但仍能看清体表褶皱结构。研究提示：吡喹酮对抗性株和敏感株皮层的损伤不相同，敏感株的损伤比抗性株更严重，提示日本血吸虫吡喹酮抗性株对吡喹酮的作用敏感性降低。第三部分吡喹酮抗性株及敏感株感染及经吡喹酮治疗后宿主辅助性T细胞反应性1吡喹酮抗性株及敏感株感染及经吡喹酮治疗后对小鼠辅助性T细胞亚群的影响以定量日本血吸虫尾蚴感染小鼠，用药组小鼠于感染第5周灌服300mg/kg吡喹酮，分别于感染后第2周、第5周、第7周和第9周处死小鼠，无菌取脾脏，制备脾单个核淋巴细胞。脾单个核淋巴细胞用PMA和离子菌素在37℃下刺激培养6h，采用流式细胞分析仪分别检测Th1细胞和Th2细胞占CD3+CD8-细胞的比例，本实验以胞内细胞因子染色来区分Th1细胞和Th2细胞，其中以胞内染色IFN-γ阳性的细胞定义为Th1细胞，以胞内染色IL-4阳性的细胞定义为Th2细胞。结果显示：抗性株和敏感株感染后，Th1细胞比例在第2周时所占比例最高，此后降低；Th2细胞比例在感染后前3阶段较低，且变化不明显，在第9周显着升高，抗性株和敏感株在感染后各阶段Th细胞占CD4+细胞比例没有差异（P>0.05）。经吡喹酮治疗后，江苏抗性株在第7周用药组小鼠脾脏Th2细胞比例高于未用药组（P<0.05）；敏感株在第9周用药组小鼠脾脏Th2细胞比例高于未用药组（P<0.05）；而湖南株两者没有差异（P>0.05）。抗性株和敏感株比较，在治疗后均无明显差异（P>0.05）。研究提示：吡喹酮抗性株和敏感株对终宿主T细胞亚群的分化作用无差异；但经吡喹酮治疗后江苏株感染终宿主Th2细胞亚群的分化作用有显着影响，吡喹酮治疗后，Th2细胞亚群所占百分比明显下降。2吡喹酮抗性株及敏感株感染及经吡喹酮治疗后对小鼠辅助性T细胞因子的影响以定量日本血吸虫尾蚴感染小鼠，在感染第5周后300mg/kg吡喹酮灌服用药组，分别于感染后第2周、第5周、第7周和第9周眼眶采血，制备血清。采用BD Cytometric Bead Array Mouse Th1/Th2cytokine kit和流式细胞分析仪测定Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF和Th2类细胞因子IL-4、IL-5的水平。结果显示：江苏抗性株和敏感株感染后，小鼠血清IL-2变化不明显，于第5、7周达最高值；血清IFN-γ于感染后在第5周达高峰，从第7周开始迅速下降；血清TNF持续升高，在感染后第9周达到高峰；IL-4和IL-5都是在第5周达最高峰，其他时间段没有明显变化。抗性株和敏感株比较，实验各阶段敏感株感染小鼠血清IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5都高于抗性株，而TNF在感染2周后抗性株高于敏感株。经分析，江苏抗性株和敏感株感染小鼠后第5周血清IL-4水平差异具有统计学意义（P<0.05）。湖南抗性株和敏感株感染后，小鼠血清IL-2变化不是很明显，于第5、7周达最高值；血清IFN-γ于感染后在第5周达高峰；从第7周开始迅速下降；血清TNF持续升高，在感染后第9周达到高峰；IL-4和IL-5都是在第5周达最高峰，其他时间段没有明显变化。抗性株和敏感株比较，经分析，第5周血清IFN-γ水平不相同（P<0.05），抗性株高于敏感株；第7周血清TNF水平存在差异（P<0.05），抗性株高于敏感株；第2周IL-5存在差异（P<0.05），敏感株要高于抗性株；第5周血清IL-4、IL-5水平存在差异（P<0.05），抗性株要高于敏感株。吡喹酮治疗后，江苏抗性株用药组IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5水平在第7、9周均高于未用药组，TNF水平低于未用药组；而敏感株用药组IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5水平在第7周低于未用药组，于第9周达相同水平，TNF水平则始终低于未用药组。经分析，江苏抗性株用药组和未用药组小鼠血清IL-5在第7周、TNF在第9周差异具有统计学意义（P<0.05）；江苏敏感株用药组和未用药组小鼠血清TNF在第7周和第9周差异均有统计学意义（P<0.05）。湖南株抗性株用药组IL-2、IL-4、IL-5水平在第7、9周均高于未用药组， IFN-γ、TNF水平低于未用药组；而敏感株用药组IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-5水平在第7、9周均低于未用药组。经分析，湖南抗性株用药组和未用药组小鼠血清TNF、IL-5在第7周，IFN-γ、TNF在第9周差异有统计学意义（P<0.05）；湖南敏感株用药组和未用药组小鼠血清IFN-γ、TNF在第7周，IL-2、IFN-γ在第9周差异均有统计学意义（P<0.05）。抗性株和敏感株相比，抗性株感染小鼠血清细胞因子均低于敏感株，其中于用药后第2周，江苏株感染小鼠血清IFN-γ差异具有统计学意义（P<0.05），湖南株感染小鼠血清IL-4、IL-5差异具有统计学意义（P<0.05）。研究显示：吡喹酮抗性株和敏感株感染终宿主后，宿主免疫应答强度不相同，对江苏敏感株的应答强于抗性株；吡喹酮治疗后，机体对抗性株的应答反应则要强于敏感株。结论本研究试图通过比较日本血吸虫吡喹酮抗性株和敏感株成虫和虫卵的抗原组分差异；观察吡喹酮对于抗性株和敏感株成虫损伤的差异；以及抗性株和敏感株感染后及经吡喹酮治疗后感染终宿主体内免疫反应变化，以探讨日本血吸虫吡喹酮抗性株的免疫学特征，研究显示：两者抗原条带组分无明显差异，但泳道光密度分析显示部分条带光密度值间存在差异，相关抗原蛋白表达量存在上调或下调；吡喹酮对表层损伤程度存在差异，敏感株损伤程度重于抗性株；抗性株和敏感株感染及吡喹酮治疗对辅助性T细胞亚群无明显影响，但感染后宿主免疫应答强度不相同，经吡喹酮治疗后，机体对抗性株的应答反应强于敏感株。
二、吡喹酮治疗对日本血吸虫31/32kDa抗体的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、吡喹酮治疗对日本血吸虫31/32kDa抗体的影响（论文提纲范文）
（1）基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 血吸虫病流行概况 |
| 1.2 血吸虫病的实验检测技术 |
| 1.3 LFD-RPA检测技术 |
| 2 研究目的 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 快速检测日本血吸虫核酸的LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 3.2 快速检测曼氏血吸虫核酸的LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 3.3 LFD-RPA检测方法的成本分析 |
| 4 技术路线图 |
| 第一部分 FD-RPA检测日本血吸虫核酸方法的建立及初步评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 主要实验试剂与仪器 |
| 1.3 基因组DNA的提取 |
| 1.4 重组质粒的构建及提取 |
| 1.5 RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.6 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.7 LFD-RPA方法的检测效能评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.2 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.3 LFD-RPA方法的检测效能评价 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 LFD-RPA检测曼氏血吸虫核酸方法的建立及初步评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 曼氏血吸虫感染小鼠实验模型构建及样本采集 |
| 1.3 主要实验试剂与仪器 |
| 1.4 基因组DNA的提取 |
| 1.5 重组质粒构建及平行PCR对照的建立 |
| 1.6 RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.7 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.8 LFD-RPA对曼氏血吸虫感染小鼠模型样本的检测评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.2 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.3 感染小鼠样本的检测评价 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 LFD-RPA反应的成本比较及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 基础数据 |
| 2.2 仪器方面 |
| 2.3 技术要求方面 |
| 2.4 成本方面 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 主要创新点 |
| 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 附表1 主要肠道血吸虫检测方法、特点及成本整理表 |
| 个人简历 |
| 硕士期间申请专利与发表文章 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）日本血吸虫病免疫保护候选抗原的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血吸虫研究概述 |
| 1.1.1 血吸虫的分类及生活史 |
| 1.1.2 血吸虫病的流行现状及防治 |
| 1.1.3 血吸虫疫苗的研究进展 |
| 1.1.4 激光共聚焦显微镜观察血吸虫 |
| 1.2 RNA干扰技术 |
| 1.2.1 RNA干扰技术概述 |
| 1.2.2 RNA干扰技术的发展与应用 |
| 1.3 血吸虫生殖发育相关蛋白 |
| 1.3.1 TCTP |
| 1.3.2 AnnexinA13 |
| 1.3.3 LWR |
| 1.3.4 UL30 |
| 1.3.5 CAX72463 |
| 1.4 实验目的及其意义 |
| 第二章 日本血吸虫病免疫保护候选抗原的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 主要试验器材 |
| 2.2.3 主要试验试剂 |
| 2.2.4 基础试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 日本血吸虫虫体的收集 |
| 2.3.2 日本血吸虫SjTCTP、SjUL30、CAX72463、SjLWR的克隆 |
| 2.3.3 重组质粒的原核表达与纯化 |
| 2.3.4 融合表达蛋白的纯化 |
| 2.3.5 融合表达蛋白的动物免疫保护实验 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 日本血吸虫SjTCTP、SjUL30、CAX72463、SjLWR基因克隆 |
| 2.4.2 日本血吸虫SjTCTP、SjUL30、CAX72463、SjLWR蛋白的表达与纯化 |
| 2.4.3 免疫诱导产生的特异性抗体水平 |
| 2.4.4 融合表达蛋白的动物免疫保护效果评估 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫TCTP表达受抑制及其免疫引起宿主免疫反应的初步分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 生物材料 |
| 3.2.2 主要试验器材 |
| 3.2.3 主要试验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 SjTCTP基因的分子特征分析 |
| 3.3.2 SjTCTP基因的RNA干扰试验 |
| 3.3.3 小鼠脾脏淋巴细胞的分离培养 |
| 3.3.4 激光共聚焦显微镜观察SjTCTP表达受抑制虫体 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 SjTCTP蛋白的生物信息学分析 |
| 3.4.2 长期干扰对虫体SjTCTP转录水平的影响 |
| 3.4.3 rSjTCTP免疫和SjTCTP表达受抑制后宿主细胞因子水平 |
| 3.4.4 SjTCTP基因表达受抑制对虫体生殖系统结构的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 日本血吸虫AnnexinA13 的克隆、表达及免疫保护效果评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 生物材料 |
| 4.2.2 主要试验器材 |
| 4.2.3 主要试验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 SjAnnexinA13 基因的分子特征分析 |
| 4.3.2 SjAnnexinA13 基因的克隆 |
| 4.3.3 重组质粒pET-28a-SjAnnexinA13 的原核表达与纯化 |
| 4.3.4 rSjAnnexinA13 融合表达蛋白的动物保护实验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 SjAnnexinA13 基因的克隆 |
| 4.4.2 SjAnnexinA13 基因的生物信息学分析 |
| 4.4.3 SjAnnexinA13 蛋白的表达与纯化 |
| 4.4.4 rSjAnnexinA13 免疫小鼠后特异性抗体水平变化 |
| 4.4.5 融合表达蛋白rSjAnnexinA13 的动物免疫保护效果评估 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 SjTCTP和 SjAnnexinA13 的联合RNA干扰研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 生物材料 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 SjTCTP和 SjAnnexinA13 基因的联合RNA干扰研究 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 联合干扰对虫体、虫卵及虫卵孵化的影响 |
| 5.4.2 激光共聚焦观察联合基因RNA干扰后的效果 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）吡喹酮调节小鼠免疫预防日本血吸虫感染的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 日本血吸虫概述 |
| 1.1.1 日本血吸虫 |
| 1.1.2 日本血吸虫生活史 |
| 1.2 日本血吸虫病及其流行情况 |
| 1.3 吡喹酮概述 |
| 1.3.1 吡喹酮 |
| 1.3.2 吡喹酮作用机制 |
| 1.3.3 吡喹酮免疫调节作用 |
| 1.3.4 血吸虫病的药物预防 |
| 1.3.5 天然免疫与病原感染研究 |
| 1.3.6 本研究的目的 |
| 第二章 PZQ预防小鼠感染日本血吸虫的量效关系研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 主要仪器及设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 药物准备 |
| 2.3.2 试验安排 |
| 2.3.3 虫体收集及长度测量 |
| 2.3.4 肝脏虫卵计数 |
| 2.3.5 血清中5-HT、IL-2、TGF-β、TNF-β和 IFN-γ含量差异分析 |
| 2.3.6 血清中NO含量分析 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 试验结果 |
| 2.4.1 虫体数情况 |
| 2.4.2 虫体形态学观察 |
| 2.4.3 血清中5-HT、NO及细胞因子测定结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 PZQ预防小鼠感染日本血吸虫的有效保护期研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 生物材料 |
| 3.2.2 主要仪器及设备 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 试验安排 |
| 3.3.2 可溶性成虫抗原(SWA)的制备 |
| 3.3.3 ELISA法测水牛血清中各抗体水平 |
| 3.3.4 血常规测定 |
| 3.3.5 其他试验方法 |
| 3.4 试验结果 |
| 3.4.1 虫体数情况 |
| 3.4.2 血清中5-HT、NO及细胞因子测定结果 |
| 3.4.3 血清中抗体水平测定结果 |
| 3.4.4 血常规结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 PZQ预防小鼠感染日本血吸虫的起效时间研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 生物材料 |
| 4.2.2 主要仪器、试剂及试剂配制 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 试验安排 |
| 4.3.2 试验方法 |
| 4.3.3 其他试验方法 |
| 4.4 试验结果 |
| 4.4.1 虫体数情况 |
| 4.4.2 血药浓度测定结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）吡喹酮治疗对日本血吸虫感染小鼠脾巨噬细胞增殖和炎症反应的抑制作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和阳性钉螺来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 日本血吸虫感染小鼠模型的建立及分组 |
| 1.4 日本血吸虫感染小鼠给予吡喹酮治疗 |
| 1.4.1 HE染色观察小鼠脾组织病理学变化 |
| 1.4.2 分离小鼠脾单个核细胞 |
| 1.4.3 流式细胞术检测脾组织中Ly-6C+巨噬细胞亚群的百分率和Ki-67的表达情况 |
| 1.4.4 q RT-PCR检测TNF-α和IL-1β表达情况 |
| 1.5 建立过继转移GFP+Ly-6C+单核细胞小鼠模型 |
| 1.6 流式细胞术检测脾贴壁细胞中Ly-6C+巨噬细胞的百分率 |
| 1.7 统计学分析 |
| 1.8 伦理批准和患者知情同意 |
| 2 结果 |
| 2.1 日本血吸虫感染及吡喹酮治疗小鼠脾脏外观和组织病理学变化 |
| 2.2 吡喹酮治疗对日本血吸虫感染小鼠脾Ly-6C+巨噬细胞百分率和数量的影响 |
| 2.3 吡喹酮治疗对日本血吸虫感染小鼠脾Ly-6C+巨噬细胞募集和增殖的影响 |
| 2.4 吡喹酮治疗对日本血吸虫感染小鼠脾脏Ly-6C+巨噬细胞相关炎症因子表达的影响 |
| 3 讨论 |
（6）日本血吸虫3天童虫蛋白质组学分析及SjPHB的生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血吸虫病的防治 |
| 1.1.1 血吸虫病流行现状 |
| 1.1.2 日本血吸虫病防治技术 |
| 1.2 血吸虫肺期童虫 |
| 1.3 血吸虫蛋白质组学研究进展 |
| 1.3.1 蛋白质组学背景介绍 |
| 1.3.2 日本血吸虫相关蛋白质组研究 |
| 1.4 抗增殖蛋白的研究进展 |
| 1.4.1 布氏锥虫中Prohibitin的研究 |
| 1.4.2 秀丽隐杆线虫中Prohibitin的研究 |
| 1.4.3 利什曼原虫中Prohibitin的研究 |
| 第二章 日本血吸虫3d肺期童虫蛋白质组学分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 主要仪器及设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 日本血吸虫3d童虫的收集 |
| 2.3.2 日本血吸虫42d成虫的收集 |
| 2.3.3 蛋白质提取和肽段酶解 |
| 2.3.4 LC-MS/MS |
| 2.3.5 蛋白质鉴定和定量分析 |
| 2.3.6 生物信息学分析 |
| 2.3.7 LC-PRM/MS检测分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 日本血吸虫3d童虫的收集观察 |
| 2.4.2 3d童虫和42d成虫蛋白PAGE比较和质谱分析 |
| 2.4.3 筛选3d童虫和42d成虫差异表达蛋白 |
| 2.4.4 3d童虫和42d成虫差异表达蛋白聚类分析 |
| 2.4.5 3d童虫和42d成虫差异表达蛋白质GO功能富集分析 |
| 2.4.6 3d童虫和42d成虫差异表达蛋白质KEGG通路分析 |
| 2.4.7 3d童虫和42d成虫差异表达蛋白质互作网络分析(PPI) |
| 2.4.8 日本血吸虫3d童虫和42d成虫差异表达蛋白质的PRM验证 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 SjPHB1与SjPHB2 的克隆、表达、及重组蛋白动物免疫保护效果评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 生物材料 |
| 3.2.2 菌株与载体 |
| 3.2.3 主要试剂及酶 |
| 3.2.4 主要实验试剂配制 |
| 3.2.5 主要实验器材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 SjPHB1与SjPHB2 基因克隆 |
| 3.3.2 SjPHB1及SjPHB2 基因编码蛋白的生物信息学分析 |
| 3.3.3 pET-32a(+)-SjPHB1及pGEX-4T-1-SjPHB2 重组表达质粒的构建 |
| 3.3.4 pET-32a(+)-SjPHB1及pGEX-4T-1-SjPHB2 重组表达质粒的原核表达 |
| 3.3.5 rSjPHB1及rSjPHB2 重组蛋白的Western blotting和 ELISA分析 |
| 3.3.6 重组蛋白rSjPHB1和rSjPHB2 的动物保护实验 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 SjPHB1和SjPHB2 基因的克隆 |
| 3.4.2 SjPHB1和SjPHB2 基因分析 |
| 3.4.3 pET-32a(+)-SjPHB1及pGEX-4T-1-SjPHB2 重组表达质粒的构建 |
| 3.4.4 pET-32a(+)-SjPHB1及pGEX-4T-1-SjPHB2 重组表达质粒的原核表达 |
| 3.4.5 重组蛋白rSjPHB1及rSjPHB2的WB分析 |
| 3.4.6 rSjPHB1 重组蛋白特异性抗体ELISA检测 |
| 3.4.7 重组蛋白rSjPHB1及rSjPHB2 的动物免疫保护效果评估 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 SjPHB1与SjPHB2 表达、定位及RNA干扰研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 生物材料 |
| 4.2.2 主要仪器及设备 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 免疫荧光组化 |
| 4.3.2 日本血吸虫不同时期虫体cDNA模板合成 |
| 4.3.3 日本血吸虫PHB1和PHB2特异siRNA分子的筛选 |
| 4.3.4 siRNAs干扰试验 |
| 4.3.5 数据统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 免疫荧光定位分析 |
| 4.4.2 qPCR分析SjPHB1和SjPHB2在日本血吸虫各时期虫体中表达水平 |
| 4.4.3 体外筛选干扰实验 |
| 4.4.4 体内干扰实验 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）吡喹酮衍生物DW-3-15抗日本血吸虫的生物学效应及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 吡喹酮衍生物DW-3-15体外对日本血吸虫的杀伤作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.3 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 日本血吸虫尾蚴性别鉴定 |
| 1.3.2 DW-3-15体外对日本血吸虫成虫的杀伤作用 |
| 1.3.3 DW-3-15体外对日本血吸虫童虫的杀伤作用 |
| 1.3.4 DW-3-15对日本血吸虫成虫、童虫杀伤效果的比较 |
| 1.3.5 DW-3-15作用日本血吸虫的形态变化 |
| 1.3.6 DW-3-15对日本血吸虫成虫体表超微结构影响的扫描电镜观察 |
| 1.3.7 DW-3-15体外对合抱成虫产卵的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 吡喹酮衍生物DW-3-15体内抗日本血吸虫的生物学效应 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 DW-3-15体内抗日本血吸虫成虫的生物学效应 |
| 2.3.2 DW-3-15体内抗日本血吸虫童虫的生物学效应 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 吡喹酮衍生物DW-3-15体内作用后日本血吸虫成虫的TMT蛋白质组学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SDS-PAGE电泳 |
| 3.3.2 日本血吸虫成虫蛋白总体分析 |
| 3.3.3 DW-3-15作用日本血吸虫成虫表达的差异蛋白分析 |
| 3.3.4 差异蛋白的GO注释 |
| 3.3.5 差异蛋白的KEGG分析 |
| 3.3.6 差异蛋白的聚类分析 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 日本血吸虫组蛋白乙酰转移酶(SjHAT)多克隆抗体制备及DW-3-15体内对成虫SjHAT的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 SjHAT生物信息学分析 |
| 4.3.2 重组质粒petB2M-SjHAT的原核表达 |
| 4.3.3 抗SjHAT多克隆抗体效价及rSjHAT诱导的特异性IgG抗体检测 |
| 4.3.4 DW-3-15治疗前后雌、雄虫SjHAT蛋白表达水平分析 |
| 4.3.5 DW-3-15治疗前后雌、雄虫SjHAT转录水平分析 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录一 缩写词表 |
| 附录二 常用试剂的配制 |
| 综述 抗血吸虫新药研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士学习期间已发表和待发表的论文 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（8）吡喹酮（PZQ）诱导日本血吸虫耐受虫体及其TMT/LC-MS蛋白组学分析差异表达蛋白的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 日本血吸虫PZQ耐受虫体的诱导 |
| 1 主要试剂和材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 日本血吸虫尾蚴性别鉴定 |
| 3.2 PZQ体外抗日本血吸虫成虫的临界致死浓度 |
| 3.3 未诱导虫体和PZQ耐受虫体的形态和活力观察 |
| 3.4 PZQ耐受虫体对PZQ的敏感性观察 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 WESTERN BLOTTING识别日本血吸虫PZQ耐受虫体功能性蛋白及质谱分析鉴定 |
| 1 主要试剂与材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 Western Blotting识别日本血吸虫PZQ耐受虫体功能性蛋白 |
| 3.2 日本血吸虫PZQ耐受虫体与未诱导虫体差异蛋白点的LC-MS结果分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 PZQ耐受虫体TMT差异性蛋白分析及鉴定 |
| 1 主要试剂与材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 PZQ耐受虫体与未诱导虫体差异蛋白的差异位点 |
| 3.2 基因本体论(GO)注释分析结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 英文缩写词表 |
| 综述:血吸虫抗药性与新药研制 |
| 参考文献 |
| 硕士期间已发表的文章 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（9）吡喹酮对日本血吸虫感染鼠脾脏巨噬细胞功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 研究内容 |
| 1.材料和试剂 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 实验动物及钉螺 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 日本血吸虫感染小鼠模型的建立 |
| 2.2 日本血吸虫感染小鼠慢性期经吡喹酮及甲氟喹治疗 |
| 2.3 脾脏重量及脾重指数的测定 |
| 2.4 小鼠脾脏组织病理学检测及观察 |
| 2.5 细胞悬液的制备 |
| 2.6 荧光抗体标记F4/80+CD11b+巨噬细胞及CD16/32+CD206+不同分型 |
| 2.7 流式检测F4/80+CD11b+CD16/32+M1 型巨噬细胞的凋亡 |
| 2.8 Qantitive Real-time RT-PCR检测 |
| 2.9 ELISA法检测细胞因子 |
| 2.10 统计分析 |
| 实验结果 |
| 1.脾脏重量及脾重指数的测定 |
| 2.感染及经吡喹酮治疗后小鼠脾脏组织病理变化观察 |
| 3.小鼠脾脏巨噬细胞免疫组化观察 |
| 4.吡喹酮治疗后小鼠脾脏巨噬细胞比例变化 |
| 5.小鼠脾脏巨噬细胞分泌细胞因子水平 |
| 6.吡喹酮治疗后脾脏巨噬细胞分型比例的变化 |
| 7.甲氟喹对脾脏巨噬细胞的影响 |
| 8.吡喹酮对脾脏M1型巨噬细胞凋亡的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 硕士期间参与的课题及发表的文章 |
| 致谢 |
（10）日本血吸虫吡喹酮抗性虫株免疫学特性研究（论文提纲范文）
| 常用缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 日本血吸虫吡喹酮抗性株及敏感株成虫和虫卵抗原组分分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 吡喹酮对日本血吸虫吡喹酮抗性株及敏感株成虫皮层的损伤 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 吡喹酮抗性株及敏感株感染及经吡喹酮治疗后宿主辅助性 T 细胞反应性 |
| 一 吡喹酮抗性株及敏感株感染及经吡喹酮治疗后对小鼠辅助性T细胞亚群的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 二 吡喹酮抗性株及敏感株感染及经吡喹酮治疗后对小鼠辅助性T细胞因子的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 硕士在读期间发表论文及参与课题 |
| 致谢 |
四、吡喹酮治疗对日本血吸虫31/32kDa抗体的影响（论文参考文献）
- [1]基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价[D]. 王丽萍. 中国疾病预防控制中心, 2021
- [2]日本血吸虫病免疫保护候选抗原的筛选[D]. 任雨琪. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]吡喹酮调节小鼠免疫预防日本血吸虫感染的研究[D]. 邵兵. 中国农业科学院, 2021(09)
- [4]免疫学技术检测吡喹酮治疗后血清抗日本血吸虫抗体转归的meta分析[J]. 王丽萍,邓王平,贾铁武,秦志强,许静. 中国血吸虫病防治杂志, 2021(02)
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- [6]日本血吸虫3天童虫蛋白质组学分析及SjPHB的生物学特性研究[D]. 杨珊珊. 中国农业科学院, 2020
- [7]吡喹酮衍生物DW-3-15抗日本血吸虫的生物学效应及作用机制研究[D]. 王小莉. 苏州大学, 2019(06)
- [8]吡喹酮（PZQ）诱导日本血吸虫耐受虫体及其TMT/LC-MS蛋白组学分析差异表达蛋白的研究[D]. 余丹. 苏州大学, 2019(06)
- [9]吡喹酮对日本血吸虫感染鼠脾脏巨噬细胞功能的影响[D]. 王伟. 南京医科大学, 2015(01)
- [10]日本血吸虫吡喹酮抗性虫株免疫学特性研究[D]. 杨振坤. 江苏省血吸虫病防治研究所, 2014(03)