一、基因芯片技术在脓毒症中的应用（论文文献综述）
陈昌勤,李莉,赵昌云,甄军海,严静[1]（2021）在《通过加权基因共表达网络分析脓毒症相关基因》文中认为目的通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别脓毒症发生发展过程中的关键基因。方法从基因表达数据库（GEO）中下载基因表达数据集GSE154918,其中包含对照40例、无症状感染12例、脓毒症39例、脓毒症随访14例,共105例芯片数据。采用R软件筛选出脓毒症差异表达基因（DEG）,用分布式访问视图集成数据库（DAVID）、检索交互基因的搜索工具（STRING）和可视化软件Cytoscape进行基因功能和通路富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析及关键基因分析,筛选出脓毒症发生发展过程中的关键基因。结果通过WGCNA并结合DEG表达分析得到46个候选基因,对这46个基因进行基因本体（GO）、京都市基因与基因组百科全书（KEGG）途径富集分析得到基因功能和参与的信号通路。进一步使用STRING数据库构建PPI网络,通过PPI网络可视化软件Cytoscape选出5个关键基因,包括肥大细胞表达膜蛋白1基因（MCEMP1）、S100钙结合蛋白A12基因（S100A12）、脂肪因子抵抗素基因（RETN）、c型凝集素结构域家族4成员基因（CLEC4D）、过氧化酶增殖因子活化受体基因（PPARG）,对这5个基因分别进行表达差异分析,结果显示,在脓毒症患者中上述5个基因的表达水平较健康对照者显着性上调。结论本研究通过构建WGCNA方法筛选出有关脓毒症的5个关键基因,可能成为潜在的脓毒症诊疗相关候选靶点。
张书礼[2]（2021）在《基于基因芯片数据挖掘探讨microRNA 15a在脓毒症骨骼肌功能障碍中的作用及分子机制》文中研究表明研究目的脓毒症是一种由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍,具有较高的发病率和致死率。脓毒症及脓毒性休克等脓毒症并发症会导致肌肉力量生成能力降低,肌膜不兴奋,肌肉质量丧失,以及随后由于蛋白水解增加而导致的肌肉萎缩,然而目前尚未完全阐明其中机制。microRNAs（miRNAs）是一种新型的小调节分子,通过结合3’端非翻译区上的特定序列参与基因表达的转录后调控,在多种生物过程中起着重要作用。研究表明,mi RNAs已经成为骨骼肌发育和功能的关键调节因子,在维持生理内稳态以及参与骨骼肌相关疾病中起着关键作用。一些mi RNAs在脓毒症中被发现异常表达,也表明其可作为脓毒症早期诊断和预后潜在的有效生物标志物。近年来,基因芯片技术被广泛地应用于生命科学领域,其为分析大型基因表达数据集提供了理想的工具并借以全面了解各种疾病的潜在机制。本研究基于含有脓毒症骨骼肌样本的基因芯片GSE13205,通过进一步的生物信息学分析,筛选出差异表达的miRNAs,以探讨其参与脓毒症骨骼肌功能障碍的可能分子机制。研究方法在基因表达综合数据库GEO筛选出含有脓毒症骨骼肌样本的基因芯片GSE13205,应用在线工具GEO2R分析并筛选差异表达的mi RNAs。构建LPS诱导的脓毒症模型,包括腹腔内注射LPS诱导的小鼠脓毒症模型和在体外用LPS处理C2C12成肌细胞构建的细胞模型,采用RT-PCR检测差异表达的mi RNAs,验证其和芯片GSE13205中数据趋势是否一致,从中筛选出趋势一致的mi RNA,并进一步深入研究。文献表明,LPS可以通过促进自噬来导致骨骼肌萎缩。我们首先观察了LPS的作用,探究其是否与自噬通路有关。采用Western Blot检测ULK1、P62和LC3Ⅱ的表达;免疫荧光的方法观察C2C12成肌细胞内源性LC3表达情况。接着验证所研究mi RNA是否参与LPS诱导骨骼肌自噬,在体外用LPS处理C2C12成肌细胞,同时转染所选mi RNA模拟物和抑制物,采用Western Blot检测ULK1、P62和LC3Ⅱ的表达;免疫荧光的方法观察C2C12成肌细胞内源性LC3表达情况。应用Target Scan数据库预测所研究miRNA的潜在靶基因,在体外C2C12成肌细胞中转染所选miRNA模拟物和抑制物,采用RT-PCR检测预测的靶基因。在离体实验验证所研究miRNA是否通过抑制其靶基因参与LPS诱导骨骼肌自噬通路。采用Western Blot检测ULK1、P62和LC3Ⅱ的表达;免疫荧光的方法观察C2C12成肌细胞内源性LC3表达情况。研究结果1)miR-15a-3p在LPS诱导的在体和离体模型中表达增多,与基因芯片GSE13205中数据趋势一致;2)LPS在整体和细胞水平均可以促进骨骼肌自噬相关蛋白的表达;3)miR-15a-3p模拟物可促进C2C12成肌细胞自噬;4)miR-15a-3p抑制物可阻断LPS介导的C2C12成肌细胞自噬;5)PGC1α是miR-15a-3p在C2C12成肌细胞中的靶基因;6)LPS在整体和细胞水平均可抑制PGC1α蛋白的表达;7)miR-15a-3p抑制物促进C2C12成肌细胞PGC1α的表达。研究结论miR-15a-3p上调参与了LPS诱导的小鼠脓毒症模型引起的肌肉损伤;LPS促进骨骼肌自噬,miR-15a-3p可通过抑制PGC1α参与介导LPS诱导的骨骼肌自噬。
谢可心[3]（2021）在《miRNA在革兰阴性菌相关脓毒症中的诊断价值研究》文中提出目的:探究miRNA在革兰阴性菌（Gram Negative,G-）相关脓毒症中的诊断价值,为临床预防和治疗脓毒症提供新思路。方法:（1）选取2018年9月至2020年9月就诊于大理大学第一附属医院的7名G-脓毒症患者及7名健康体检者作为筛选队列,提取血清中的miRNA进行测序,筛选出差异表达的miRNA,并进行生物信息学分析。（2）选取2018年9月至2020年9月就诊于大理大学第一附属医院的34名G-脓毒症患者及16名健康体检者作为验证队列,对表达上调的miRNA进行q RT-PCR验证,初步探讨差异表达miRNA对G-脓毒症的诊断价值。（3）根据患者预后,将G-脓毒症患者分成生存组（n=18）和死亡组（n=16）,绘制受试者工作曲线（Receiver Operating Characteristic curve,ROC）,并探讨差异miRNA及相关实验室指标对G-脓毒症患者的预后诊断价值,同时与PCT、CRP、SOFA评分等经典感染指标做相关性分析。结果:（1）筛选队列中G-脓毒症组的实验室指标（WBC、N、TBI、Crea）、hsa-miR-1202、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-1299、hsa-miR-486-5p和hsa-miR-451a的表达水平均显着高于对照组,且差异均有统计学意义（P<0.05）,而淋巴细胞显着低于对照组（P<0.05）。在G-脓毒症的诊断效能方面,通过分析ROC曲线下面积（Area Under Curve,AUC）,hsa-miR-16-5p和hsa-miR-451a的AUC最大,达到0.9796,其次为hsa-miR-1202,AUC为0.9388。（2）验证队列中G-脓毒症患者组实验室指标（WBC、N、TBI、Crea、BUN）、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-451a水平均显着高于对照组,且差异均有统计学意义（P<0.05）,而淋巴细胞显着低于对照组（P<0.05）。ROC结果表明hsa-miR-16-5p的AUC最大,为0.74,95%的置信区间（95%Confidence Interval,95%CI）为（0.59-0.85）,诊断G-脓毒症的灵敏度为70.6%,特异度为100.0%,其次为miR-1202,AUC和95%的置信区间为0.70（0.56-0.83）,诊断G-脓毒症的灵敏度为50.0%,特异度为87.5%。（3）对G-脓毒症患者预后的判断,死亡组实验室指标（PCT、CRP）、SOFA评分、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-451a水平显着高于生存组（P<0.05）,ROC数据表明两组的差异指标中hsa-miR-16-5p的AUC最大,miR-16-5p作为G-脓毒症预后标志物的AUC和95%CI为0.89（0.73-0.97）,判断G-脓毒症预后的灵敏度为68.7%,特异度为94.4%。（4）相关性分析表明,miR-451a和SOFA评分呈正相关,有统计学意义（P<0.05）,miR-16-5p、miR-486-5p和CRP、PCT、SOFA评分未见明显相关性。结论:血清hsa-miR-16-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-451a可能是G-脓毒症早期诊断的生物标志物,其中miR-16-5p的诊断性能最佳,灵敏度和特异度均高,更有助于脓毒症的诊断。hsa-miR-16-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-451a与G-脓毒症患者的预后有关,并有可能是G-脓毒症治疗的潜在靶点。
段淑芳[4]（2021）在《基于生物信息分析筛选参与脓毒症的关键基因及其作用机制的研究》文中研究指明研究背景脓毒症是患者对严重感染的反应失调导致的多器官功能障碍,严重者可发展为脓毒性休克,其病死率极高,脓毒症高死亡率一直是医学界研究的重点。在过去的20年里,大量的研究数据提高了人们对脓毒症病理生理学的认识,逐步厘清炎症通路的调节和免疫抑制在脓毒症中发挥的作用,但是脓毒症导致的血管内皮细胞损伤的发病机制和分子机制仍不是十分清楚。最近,生物信息学技术的出现,可以帮助我们获得脓毒症和正常人之间的差异表达基因谱（DEGs）,并通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析,同时进行机制的验证,有助于深入探索脓毒症新的分子机制,为脓毒症的防治提供新的思路和方法。研究目的通过对基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）中脓毒症相关的数据集进行生物信息学分析筛选出参与脓毒症发病的关键基因,并研究其在脓毒症血管内皮细胞中的表达和调控情况,探索出其在脓毒症发病过程中潜在的作用机制。研究方法1.采用生信分析的方法,从GEO数据库中获取脓毒症的基因芯片表达谱,下载15例感染性休克和8名健康志愿者的中性粒细胞样本数据的微阵列数据集GSE64457,利用R-studioru软件统计分析出感染性休克和健康志愿者的中性粒细胞的差异表达基因（DEGs）,利用互作基因检索（STRING）数据库搜索工具构建差异基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络,并在一款图形化显示网络并进行分析和编辑的软件（Cytoscape）中可视化,通过将所筛选出的关键基因在已知的作用途径和机制与脓毒症血管损伤的病理生理变化进行关联分析,找出预期研究的关键基因;2.利用荧光定量PCR检测所筛选出的关键基因MMP8在脓毒症患者中性粒细胞中的表达水平,以验证生信分析的结果;3.使用脓毒症患者血清和正常志愿者血清刺激人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,并使用关键基因MMP8的抑制剂M8I进行干预,利用荧光定量PCR检测HUVEC的血管内皮细胞粘附分子-1（VCAM-1）基因的表达变化,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测上清液VCAM-1蛋白的变化,并检测外周血单核细胞（PBMC）与HUVEC黏附率,同时采用Western blot法检测细胞内p38 MAPK和ERK1/2的变化情况。研究结果1.本研究共鉴定出7个HUB基因（MMP8、HP、ARG1、FOLR3、QSOX1、PGLYRP1、OSCAR）,生物学过程分析表明,这些基因主要富集在炎症反应、免疫反应中。再通过将所筛选出的关键基因在已知的作用途径和机制与脓毒症血管损伤的病理生理变化进行关联分析,发现MMP8可能与内皮细胞损伤有关;2.荧光定量PCR显示:脓毒症患者血液中中性粒细胞的MMP8基因的表达量显着高于正常志愿者组（22.9±16.77 vs 2.36±2.16,p<0.05）。3.用脓毒症患者血清和正常志愿者血清刺激HUVEC 6小时后发现,脓毒症血清刺激6小时后VCAM-1基因表达量显着高于正常血清刺激组（4.51±1.45 vs1.00±0.11,p<0.05）,和蛋白表达量显着升高（2360±34.15 vs 576.3±19.58,p<0.05）,通过外周血单核细胞黏附实验检测发现脓毒症血清相对于正常血清刺激后外周血单核细胞的黏附率显着增高（479.3±47.96%vs 100%,p<0.05）,WB检测发现脓毒症血清刺激后p38 MAPK（0.69±0.04 vs 0.30±0.02,p<0.05）和ERK1/2（0.68±0.05vs 0.35±0.02,p<0.05）蛋白的相对表达量显着增高。使用MMP8抑制剂进行预处理1h再使用脓毒症患者血清刺激,发现内皮细胞中VCAM-1基因表达（1.01±0.05vs 0.36±0.15,p<0.05）,上清液中VCAM-1蛋白含量（2381±50.76 vs 1941±6.23,p<0.05）,外周血单核细胞黏附率（479.3±47.96%vs 210.7±13.65%,p<0.05）均显着下降,同时细胞内的p38 MAPK（0.83±0.03 vs 0.32±0.04,p<0.05）和ERK1/2（0.55±0.02 vs 0.24±0.07,p<0.05）蛋白含量也明显降低。研究结论通过生物信息分析筛选的关键基因MMP8,参与了脓毒症血管内皮细胞粘附分子1（VCAM-1）的产生和释放,并引起外周血单核细胞黏附数增加,这一作用可能与MMP8活化p38 MAPK和ERK1/2信号通路有关。
詹震[5]（2021）在《脂多糖诱导BV2小胶质细胞中的竞争性内源RNA表达谱研究》文中认为脓毒症相关性脑病是脓毒症的最常见并发症之一,它严重增加了医疗费用,损害了患者的生活质量。小胶质细胞活化在脓毒症相关性脑病的神经炎症进展中起关键作用,对调节小胶质细胞活化的新型分子及其潜在功能的更好的了解将极大地促进对新疗法的探索。最近的研究表明,lncRNA与脓毒症相关性脑病有关,然而另一种热门非编码RNA即circRNA是否与脓毒症相关性脑病有关尚不清楚,它们在小胶质细胞活化中的潜在功能及机制亦不明确。同时研究指出,lncRNA、circRNA、mRNA可通过ceRNA机制来影响疾病的发生发展,故我们扩大脓毒症相关性脑病的非编码RNA表达谱研究,以期更深入了解脓毒症相关性脑病的病理生理机制。目的:鉴定脂多糖诱导BV2小胶质细胞早期活化差异表达的lncRNA、circRNA、mRNA,了解其作为ceRNA在脓毒症相关性脑病中的诊断和治疗价值以及潜在功能和机制。方法:体外培养BV2小胶质细胞,用LPS刺激BV2小胶质细胞,建立脓毒症相关性脑病暴露早期细胞模型。将培养的小胶质细胞分为对照组和实验组,即CN组和LPS组。CN组细胞予常规体外培养作为对照组,LPS组细胞予LPS 1μg/ml刺激作为实验组。运用TRIzol法提取各组细胞中的总RNA。将提取的每组3个,共6个总RNA样品送于相关公司进行ceRNA芯片检测和生物信息学分析。包括:（1）运用超微分光光度计按照Agilent Bioanalyzer质检标准对总RNA样品进行质控;（2）相对于CN组,运用ceRNA芯片扫描对LPS组进行lncRNA、circRNA、mRNA的差异表达鉴定;（2）相对于CN组,运用DAVID生物信息数据库对LPS组差异表达的mRNA进行GO富集分析和KEGG通路富集分析;（3）基于差异表达RNA之间的相关性分析,构建ceRNA网络。结果:（1）所有RNA样品质量满足芯片制造商实验要求,可进行后续实验;（2）相对于CN组,LPS组差异表达的lncRNA、circRNA、mRNA的层次聚类图、散点图、火山图提示:差异表达了2488个lncRNA,263个circRNA和2765个mRNA,其中,分别上调和下调了1744个和744个lncRNA,140个和123个circRNA,1135个和630个mRNA。（3）相对于CN组,LPS组差异表达的mRNA GO富集分析条形图提示:排名前3的分子功能GO条目分别为“蛋白结合”、“细胞因子活化”、“RNA聚合酶Ⅱ启动子序列特异DNA结合”;排名前3的细胞组分GO条目分别是“细胞膜”、“质膜外侧”、“细胞质”;排名前3的生物学过程GO条目是“炎症反应”、“免疫系统过程”、“免疫反应”。GO气泡图提示“蛋白质结合”是差异基因最多、显着程度最高的分子功能GO条目;“细胞膜”是差异基因最多、显着程度最高的细胞组分GO条目;“炎症反应”是差异基因较多、显着程度较高的生物学过程GO条目。（4）相对于CN组,LPS组差异表达的mRNA KEGG通路富集分析提示:显着性最高的前3条通路分别是“TNF信号通路”、“NOD样受体信号通路”、“IL-17信号通路”。KEGG气泡图提示:“TNF信号通路”是落入基因较多、显着程度较高的通路。（5）lncRNA-miRNA-mRNA排名前100ceRNA网络中,相互作用能力较强的lncRNA有NONMMUT144861.1、NONMMUT043540.2、ENSMUST00000203956.1;相互作用能力较强的miRNA有mmu-mi R-762、mmu-mi R-149-3p、mmu-mi R-709;相互作用能力较强的mRNA有Rab11fip1、Birc3、Abhd15。circRNA-miRNA-mRNA排名前100ceRNA网络中,相互作用能力较强的circRNA有MMU＿CIRCpedia＿27949、mmu＿circ＿0008161、MMU＿CIRCpedia＿509;相互作用能力较强的miRNA有mmu-mi R-7069-5p、mmu-mi R-7081-5p、mmu-miR-7686-5p;相互作用能力较强的mRNA有Helz2、Dcbld2、Fam129a。结论:（1）lncRNA、circRNA、mRNA以及ceRNA机制可能参与了脓毒症相关性脑病的发生及进展。（2）揭示了参与脂多糖诱导小胶质细胞早期活化的大量新型候选lncRNA、circRNA和mRNA。（3）研究可能为将来在体内发展脓毒症相关性脑病的有希望的生物标志物和治疗靶标提供相关信息。
闫玉荣[6]（2020）在《MicroRNA-223抑制NLRP3炎症小体和TLR4/NF-κB信号通路减轻急性肺损伤炎症反应》文中指出[研究背景]急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征（Acute Lung Injury/Acute Respiratory Distress Syndrome,ALI/ARDS）是指由于肺内外的各种致伤因素导致肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤,出现进行性呼吸困难和顽固性低氧血症为特征的机体过度炎症反应综合征。其中ARDS是ALI的一种严重形式,在世界范围内发病率及死亡率均较高,是ICU患者死亡的主要原因之一。ALI/ARDS的特征是严重肺部炎症,引起肺泡-血管内皮屏障的破坏,导致大量中性粒细胞和其他炎性细胞涌入,炎性细胞因子和炎性介质释放,富含蛋白质的液体引起肺泡充血、表面活性物质合成和代谢障碍以及局部高凝状态。这些病理因素共同损害了肺的气体交换和肺泡表面功能,患者出现严重的低氧血症和肺动脉楔压升高。ALI病因复杂,经过半个世纪,有关ALI/ARDS的发病机制的研究已取得长足进展,但对于ALI的确切发病机制尚未完全阐明。目前的研究普遍认识到,肺内炎性细胞过度活化、募集,大量的炎性因子和效应细胞相互激活,相互作用,引起的失控性炎症反应是ALI的主要病理生理变化。因此,抑制失控性炎症反应可能是治疗ALI的关键途径。过去几十年有关ALI/ARDS的研究多集中在探讨细胞因子网络失衡,观察各种细胞因子拮抗剂在ALI/ARDS中的临床疗效,但始终没有取得重大突破和进展。近几年,细胞信号传导的分子机制及基因调控逐渐成为研究热点,大量实验表明,炎症细胞内各促炎信号通路紊乱在ALI/ARDS发病机制中具有重要作用。因此探索调控急性肺损伤中各种促炎信号通路的机制,对疾病进行早期诊断和治疗,及时逆转不良的预后具有非常重要的临床意义。近期的研究发现,Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）是革兰阴性菌中脂多糖（LPS）感染细胞的信号转导模式识别受体,介导了核转录因子κB（NF-κB）的活化和炎性介质的生成,是细胞信号转导中最早的信号分子之一。众多研究认为,TLR4/NF-κB通路在LPS所致的急性肺损伤中能够快速启动细胞内炎性信号传导通路。在TLR4与LPS结合后,经过激活多种信号途径,其中主要为髓样分化因子 88（myeloid differentiation factor88,MyD88）途径,经过逐级传递信号,激活IκB激酶（IKK）,随后NF-κB抑制因子（inhibitor of NF-κB,IκB）磷酸化,IκB从NF-κB上脱落并被泛素化,NF-κB由抑制状态被激活。激活后的NF-κB迅速移位至细胞核内,与目的mMRA结合后,迅速上调IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等促炎细胞因子的表达。Rho激酶能够加强炎性细胞的运动、黏附能力以及迁移出内皮细胞的能力,对炎症反应具有调控作用。而Rho激酶抑制剂可以抑制NF-κB的激活。由此可见,Rho激酶可能在脓毒症的炎症级联反应中发挥重要作用。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体是目前研究最为广泛的炎症小体,它是细胞内的一类多蛋白复合物,主要分布于胞间质及胞膜中,可参与多种宿主免疫和炎性反应,由感受蛋白-NLRP3、连接蛋白-凋亡相关点样蛋白（ASC）和效应蛋白-半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）的前体组成。NLRP3炎症小体可识别一系列外源及内源性刺激,使caspase-1向活化形式转化,活化的caspase-1进一步促使细胞因子IL-1β和IL-18的前体切割成熟并活化,而IL-1β和IL-18是引起炎症启动的最强有力的细胞因子,能够逐级放大炎症反应的发生,加重组织损害。而Toll样受体（TLRs）是一类胞浆模式识别受体,能首先快速识别各种病原相关分子模式（PAMPs）以及各种危险相关分子模式（DAMPs）,从而激活相应的炎症信号通路,引起机体非特异性免疫应答。但并不是所有的PAMP或DAMP均能够被细胞膜表面的模式识别受体所识别,NLRP3炎症小体在细胞质内能够识别这些进入细胞内的PAMPs或DAMPs,构成机体另一道防御屏障。TLRs和NLRP3炎症小体介导的信号通路合作,能够促进大量活化的细胞因子如IL-1β和IL-18的释放,进而促进炎症的发生和疾病的发展。所以在LPS介导的ALI中,可能是多种途径包括TLR4/NF-κB信号通路、NLRP3炎症小体等共同调控炎症反应的发生发展。目前认为急性肺损伤的发病机制与机体发生过度炎症反应有关,因此防止急性肺损伤的发生,降低病死率,我们应从如何调控炎症反应的发生与反应强度入手。急性肺损伤生物学标志物的探索,对疾病的早期诊断、治疗,降低死亡率等都具有非常重要的意义。微小RNA（MicroRNAs,miRNAs）是一类长度约为21-25个碱基的小分子非编码RNA,通过与靶基因的mRNA特异性结合,在转录后水平调控靶基因的表达。研究表明,多种miRNAs在脓毒症急性肺损伤的炎症反应中发挥重要作用。有学者发现在LPS诱导的ALI小鼠血清及肺组织中miR-125b表达明显降低,上调ALI小鼠肺组织中miR-125b的表达能够明显抑制LPS诱导的ALI。敲低miR-7或者过表达miR-155均能减弱LPS导致的小鼠急性肺损伤炎症反应。而有的学者则发现在LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺组织中出现miR-214的高表达,提示miR-214可能在LPS诱导的ALI中起到了促炎因子的作用。miR-223最初被发现在肿瘤组织中表达失调,在某些实体瘤患者外周血中的表达也存在异常。miR-223在血小板内表达丰度很高,冠心病患者血小板miR-223表达水平能够反映其血小板活化程度和并与冠状动脉严重程度呈显着正相关。最近的动物研究发现,miRNA-223在机体感染时可能具有调节抗炎和细胞修复的作用,观察到miR-223缺失的小鼠会自发出现肺部炎症的病理变化,并在内毒素作用时发生大量组织的破坏。Neudecker等人也认为miRNA-223缺陷与严重的肺部炎症有关,提示miRNA-223可能参与了肺部炎症免疫功能的调节,但是具体的作用机制尚不明确。TLR4/NF-κB、NLRP3炎症小体两种信号通路可能共同参与ALI调控炎症反应的发生发展。miR-223对LPS诱导的急性肺损伤的发生、发展是否具有调控作用,作用机制是否与TLR4/NF-κB或NLRP3炎性小体信号通路有关,有待我们进行探讨。LPS是细菌内毒素的活性成分,细菌感染尤其是革兰氏阴性菌是引起急性肺损伤的主要致病因素之一。近几年,已建立了一系列动物模型来模拟不同发病机制引起的急性肺损伤,其中LPS诱导的急性肺损伤动物模型最为常用。[研究目的]本研究旨在通过检测在LPS诱导的小鼠和体外急性肺损伤细胞模型中miR-223的表达以及与炎性细胞因子表达的关系;并检测上调或下调miR-223对LPS诱导的细胞急性肺损伤模型中炎症反应的影响,探讨miR-223对LPS诱导的急性肺损伤炎症反应的作用及可能机制,寻找一种新的潜在的治疗ALI的靶点和判断ALI预后的生物学指标。[研究方法]1.急性肺损伤小鼠模型的建立选择C57BL/6品系小鼠16只,随机分为LPS组和对照组,每组8只,LPS组小鼠腹腔内注射LPS建立脓毒症急性肺损伤模型,首先观察两组小鼠的一般状况,24小时后提取两组小鼠肺组织标本,观察肺组织色泽、体积、有无充血渗出等。分析肺组织病理结构的变化,ELISA法检测小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18的表达,判断ALI小鼠模型是否构建成功。2.miR-223在LPS诱导的ALI炎症反应中的作用应用基因芯片技术分析ALI小鼠中miRNAs表达水平,筛选异常表达miRNA;用RT-qPCR方法分别检测LPS组与正常对照组小鼠肺组织中miR-223表达,以观察miR-223在LPS组小鼠中是否有异常表达;与LPS共培养构建A549细胞（腺癌人类肺泡基底上皮细胞）的ALI模型,用RT-qPCR方法分别检测LPS组与正常对照组A549细胞中miR-223表达,ELISA法检测A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平,并进行比较,以观察miR-223在ALI细胞模型中是否异常表达;通过转染miR-223的模拟物上调或anti-miR-223的模拟物下调A549细胞中miR-223的表达,检测A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平的变化,并进行比较,探讨miR-223对LPS诱导的ALI炎症反应是否有调控作用。3.miR-223调控ALI的靶基因及验证3.1在LPS处理的A549细胞中,通过RNA干扰技术敲低miR-223的表达水平,应用基因芯片技术分析miR-223调控的下游靶点,通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验分别检测靶基因mRNA和蛋白表达水平变化;过表达miR-223,通过RT-qPCR、Western blot实验分别检测靶基因mRNA和蛋白表达水平变化。用Targetscan数据库分析miR-223与NLPR3和小G蛋白RHOB靶蛋白结合位点,并结合双荧光素酶报告实验进行验证,分析miR-223调控NLPR3和RHOB表达的分子机制。3.2在LPS处理的A549细胞中,转染miR-223 mimics/inhibitor后,通过RT-qPCR法检测炎症因子mRNA的表达,通过ELISA法检测炎症因子蛋白的表达;为验证miR-223调控的各靶蛋白之间的上下游关系,在LPS诱导的细胞损伤模型中,依次分别将细胞分为阴性对照（Control）组、miR-223抑制剂（Anti-223）组和miR-223抑制剂联合其中一种靶蛋白过表达组,首先通过Western blot实验分析不同处理组中所有靶蛋白表达水平的变化,以探讨各靶蛋白之间的上下游关系。进一步通过ELISA实验检测上述不同处理组细胞中IL-1β和IL-18表达水平,探讨各靶蛋白在miR-223调控ALI中的作用。[研究结果]1.急性肺损伤小鼠模型的建立及小鼠肺组织的病理改变。正常对照组小鼠进食饮水正常,活动自如;LPS组小鼠在LPS注射后6小时出现精神反应差、不思饮食、少动、体温上升及扎堆现象,随时间延长上述症状逐渐加重,并出现呼吸急促、腹泻等症状。小鼠肺组织石蜡切片HE染色显示,正常对照组小鼠肺组织肺泡结构完整,肺泡间隔厚度正常,肺泡腔内及肺间质均未见明显炎症细胞浸润及红细胞充填;LPS组小鼠肺组织可见部分结构破坏,肺泡结构紊乱,肺泡壁水肿,肺泡腔内有渗出液,肺泡及间质可见大量炎性细胞浸润;毛细血管内充满红细胞。ELISA法检测小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18的表达均明显升高,提示急性肺损伤小鼠模型建立成功。2.miR-223在LPS诱导的急性肺损伤中的作用应用基因芯片技术分析了 LPS组小鼠中miRNAs表达水平,发现LPS组小鼠肺组织miR-223表达较对照组明显下降（P<0.01）,用RT-qPCR方法检测两组小鼠肺组织中miR-223表达,ALI组明显低于对照组（P<0.01）。与LPS共培养构建A549细胞的ALI模型,RT-qPCR方法检测A549细胞中miR-223表达与对照组相比显着下降（P<0.01）,ELISA法检测A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平显着升高（P<0.01）。与对照组作相比,过表达miR-223使A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平显着下降（P<0.01）,下调miR-223的表达,A549细胞中IL-1β和IL-18的表达显着上升（P<0.01）。3.miR-223调控ALI的靶基因及验证3.1 LPS诱导的细胞损伤中,miR-223抑制NLRP3、TLR4和NF-κB信号通路为了分析miR-223调控肺损伤中的作用机制,我们在LPS处理的A549细胞中,通过RNA干扰技术敲低miR-223的表达水平,应用基因芯片检测候选基因的表达水平,与对照组相比,抑制miR-223的表达水平后,能够显着上调TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。为进一步验证该结果,进行RT-qPCR检测,与对照组相比,抑制miR-223的表达后能显着上调NLPR3、TLR4和NF-κB mRNA的表达水平（P<0.01）。我们通过Western blot实验检测抑制miR-223的表达水平后,能显着促进NLPR3、caspase-1、TLR4和NF-κB蛋白水平的表达（P<0.01）。而过表达miR-223后,能显着抑制上述蛋白的表达（P<0.01）。以上结果表明,在体外急性肺损伤模型中,miR-223能够调控NLRP3、caspase-1、TLR4和NF-κB的表达水平。3.2 miR-223抑制TLR4信号通路减轻LPS诱导的细胞损伤为验证miR-223调控NLRP3、TLR4和NF-κB表达中三者的上下游关系,我们在LPS诱导的细胞损伤模型中,将细胞分为阴性对照（Control）组、miR-223抑制剂（Anti-223）组和miR-223抑制剂联合siTLR4（TLR4i）组,首先通过Western Blot实验分析不同处理组中TLR4、NLRP3、NF-KB和Caspase-1表达水平的变化,与Anti-223组相比,TLR4i组中TLR4和NF-κB表达水平均显着下调（P<0.01）,表明siTLR4能够有效抑制TLR4的表达水平,并能够封阻miR-223抑制剂诱导的NF-KB的表达。而TLR4i组中NLRP3、Caspase-1的表达水平与对照组相比无明显差异（P>0.05）,表明miR-223调控NLRP3和Caspase-1的表达是不依赖于TLR4的。通过ELISA实验检测上述不同处理组细胞中IL-1β和IL-18表达水平,与Control组相比,转染miR-223抑制剂的A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平显着增加（P<0.01）,而TLR4i组与Control组无明显差异（P>0.05）,结果表明miR-223通过抑制TLR4的表达减轻LPS诱导的细胞损伤。3.3 miR-223抑制NLRP3减轻LPS诱导的细胞损伤3.3.1 miR-223调控NLRP3表达的机制为了明确miR-223调控NLRP3表达的分子机制,我们应用TargetScan数据库分析了 miR-223与NLRP3 3’-UTR区域的结合位点,显示miR-223与NLRP33’-UTR区域具有潜在结合的能力。通过双荧光素酶报告实验对该结合位点进行验证,结果提示miR-223通过与NLRP33’-UTR区域结合,靶向调控NLRP3的表达。为进一步明确miR-223对A549细胞中NLRP3的调控作用,将阴性对照（Control）、miR-223抑制剂（Anti-223）分别转染A549细胞,48 h后通过免疫荧光检测对NLRP3表达的影响。与Control组相比,转染miR-223抑制剂的A549细胞中NLRP3的表达水平显着升高,说明下调miR-223水平能促进A549细胞中NLRP3的表达。3.3.2 LPS诱导的细胞损伤模型中miR-223抑制剂通过上调NLRP3诱导炎性因子的表达。为了验证NLRP3在miR-223调控的急性肺损伤模型中的作用,我们在LPS诱导的细胞损伤模型中,将细胞分为阴性对照（Control）组、miR-223抑制剂（Anti-223）组或 miR-223 抑制剂联合 siNLRP3（NLRP3i）组,首先通过 Western Blot实验分析不同处理组中NLRP3和Caspase-1表达水平的变化。与Anti-223组相比,NLRP3i组中NLRP3和Caspase-1表达水平均显着下调（P<0.01）,表明siNLRP3能够有效抑制NLRP3的表达水平,并能够封阻miR-223抑制剂诱导的Caspase-1的表达。通过ELISA实验检测上述不同处理组细胞中IL-1β和IL-18表达水平,与Control组相比,转染miR-223抑制剂的A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平显着增加（P<0.01）,而NLRP3i组与Control组无明显差异（P>0.05）,结果提示miR-223通过抑制NLRP3的表达减轻LPS诱导的细胞损伤。3.4miR-223通过调控RHOB抑制NF-KB信号通路减轻LPS诱导的细胞损伤3.4.1 miR-223调控RHOB表达的机制为了验证miR-223在RHOB激活的炎症反应中的作用,我们应用TargetScan数据库分析了 miR-223与RHOB 3’-UTR区域的结合位点,显示miR-223与RHOB 3’-UTR区域具有潜在结合的能力。通过双荧光素酶报告实验对该结合位点进行验证,结果提示miR-223通过与RHOB 3’-UTR区域结合,靶向调控RHOB的表达。为进一步明确miR-223对A549细胞中RHOB的调控作用,我们通过Western blot实验分析了过表达miR-223对RHOB表达水平的影响,与Negative组相比,过表达miR-223后的A549细胞中RHOB的表达水平显着下调（P<0.01）。并通过Western Blot实验分析了 miR-223抑制剂对RHOB表达水平的影响,与Negative组相比,Anti-223组中RHOB的表达水平显着升高（P<0.01）。以上结果表明,miR-223通过靶向结合RHOB的3’-UTR区域抑制RHOB的表达。3.4.2 LPS诱导的细胞损伤模型中miR-223抑制剂通过上调RHOB调控NF-KB信号通路诱导炎性因子的表达为了验证RHOB在miR-223调控的急性肺损伤模型中的作用,在LPS诱导的细胞损伤模型中,将细胞分为阴性对照（Negative）组、miR-223模拟物（miR-223）组和 miR-223 模拟物联合 RHOB（RHOB）组,首先通过 Western blot实验分析不同处理组中RHOB、TLR4和NF-κB表达水平的变化,与miR-223组相比,RHOB组中RHOB和NF-κB表达水平均显着增加（P<0.01）,而TLR4的表达水平无明显差异,表明A549细胞中,RHOB质粒得到有效表达,并能够恢复因过表达miR-223抑制的NF-κB的表达水平,但不影响TLR4的表达。通过ELISA实验检测上述不同处理组细胞中IL-1β和IL-18表达水平。与Negative组相比,miR-223组IL-1β和IL-18的表达水平显着下调（P<0.01）,并且RHOB组与miR-223组存在显着性差异（P<0.01）,以上结果表明miR-223通过抑制RHOB下调NF-κB的表达减轻LPS诱导的细胞损伤。[研究结论]1.本研究通过体内和体外两个层面发现:在LPS诱导的急性肺损伤中miR-223的表达水平显着降低,并与炎性细胞因子IL-1β、IL-18的表达水平呈负性相关;miR-223对LPS诱导的急性肺损伤具有保护作用。2.miR-223是一种ALI炎症反应的调控因子,在LPS诱导的急性肺损伤中可能通过负反馈调控RHOB激发的NF-κB信号、抑制TLR4及抑制NLRP3炎症小体发挥保护作用。miR-223有望成为一种新的治疗ALI的靶点。
陆红祥[7]（2020）在《创伤后脓毒症预警指标与方法研究》文中指出研究背景脓毒症是严重创伤后期最常见的并发症,是创伤患者院内死亡的主要原因。创伤后脓毒症的早期诊断是临床救治的关键。然而,创伤患者在伤后常处于“无菌性炎症”状态,这在很大程度上影响了脓毒症的早期诊断。因创伤后脓毒症发生率和致死率高,对脓毒症高危患者的早期识别并给予个体化治疗是降低创伤患者中脓毒症发病率的有效手段。因此,发现有效的创伤后脓毒症早期预警指标,并构建创伤后脓毒症早期预警模型是非常必要的。本研究拟从遗传背景、临床变量和转录组水平三个层面筛选可能与创伤后脓毒症易患性和发生相关的预警指标,构建创伤后脓毒症早期预警模型。材料和方法1.脓毒症易患性基因多态性位点的筛选:一方面采用“Sepsis”和“Polymorphism”作为关键词,在Pubmed、Embase、Web of Knowledge和HuGe数据库中检索筛选脓毒症易患性遗传关联研究文献,对研究人群数≥3的基因多态性位点进行Meta分析,而对研究人群<3的基因多态性位点进行系统评价,筛选出对脓毒症易患性具有预警作用的基因多态性位点。另一方面在前期研究基础上采用候选基因遗传关联策略,通过临床多中心关联研究、蛋白质免疫印迹、荧光素酶报告基因和凝胶电泳迁移实验等对核受体PPARG基因rs10865710C/G在创伤后脓毒症中的作用机制进行研究。2.创伤后脓毒症易患性遗传风险评分模型的建立:在中国创伤患者中对上述筛选出的64个脓毒症易患性基因多态性位点采用SNPscan方法进行分型,通过随机森林法筛选出平均下降准确度（MDA）≥1.0的基因多态性位点,根据各位点对创伤后脓毒症的贡献程度,构建创伤后脓毒症的权重遗传风险评分（wGRS）。然后,采用曲线下面积（AUC）对wGRS的早期预警能力进行评价,进一步采用净重分类改善指数（NRI）来评估遗传风险评分对创伤后脓毒症的再分类能力。3.创伤后脓毒症发生风险早期预警分析:收集严重创伤患者入院后24小时内的临床和实验室检测指标,对创伤后脓毒症的发生风险进行分析,采用Logistic回归和套索回归（LASSO）技术来筛选与创伤后脓毒症发生风险相关的指标,并构建创伤后脓毒症评分（TSS）。然后,采用曲线下面积（AUC）对TSS的早期预警能力进行评价,同时采用Hosmer-Lemeshow（H-L）拟合优度检验来评估TSS的校正能力。4.创伤后脓毒症相关转录组指标的筛选:一方面采用lncRNA转录组芯片技术检测LPS诱导后外周血单个核细胞（PBMCs）的lncRNAs表达变化,对差异表达的lncRNAs进行GO和KEGG分析,并构建lncRNAs-mRNAs共表达网络,筛选可能用于脓毒症发生相关的关键lncRNAs。另一方面对创伤人群外周血的转录组公共数据库进行挖掘,鉴定在创伤后表达显着变化的基因,并在创伤患者中对其表达变化进行验证,然后在严重创伤人群中对其在创伤后脓毒症早期预警中的作用进行研究。研究结果1.通过系统的文献检索,共筛选出349篇脓毒症易患性遗传关联研究文献,涉及405个基因多态性位点。对研究人群≥3的76个基因多态性位点进行了204个Meta分析,及根据年龄、种族划分进行的185个亚组Meta分析,发现29个基因多态性位点与脓毒症的发生相关;而对其余研究人群<3的329个基因多态性位点进行了系统评价,发现63个基因多态性位点与脓毒症的发生风险有潜在的关联性。同时,通过重庆和贵州地区两个临床中心关联研究发现核受体PPARG rs10865710C/G与创伤后脓毒症发生风险显着相关,且蛋白质免疫印迹、荧光素酶报告基因和凝胶电泳迁移实验证实rs10865710C/G是通过影响PPARG基因增强子活性和与转录因子CREB2的结合能力,进而影响PPARγ表达,从而影响创伤后脓毒症的易患性。2.在883例创伤患者中成功分型了64个脓毒症易患性潜在基因多态性位点,随机森林分析结果表明17个基因多态性位点MDA≥1.0,基于该17个位点构建了创伤后脓毒症易患性的遗传风险评分（wGRS）。关联分析显示遗传风险评分与创伤后脓毒症发生风险显着相关(OR=2.19（1.53-3.15）,P=2.01×10-5),对创伤后脓毒症易患性的预警作用的AUC为0.619（0.586-0.651）。当在临床预警模型中加入遗传风险评分后,预警模型的AUC达到0.768（0.739-0.796）,增加了3.40%(P=8.00í10-4),且NRI增加了25.18%（17.84%-32.51%）(P=6.00í10-5)。3.684例创伤患者纳入本部分研究,其中411例（60%）创伤患者划为训练人群,273例创伤患者划为验证人群。在训练人群中,通过Logistic和LASSO分析,从50个临床指标中共筛选出7个脓毒症早期预警临床变量:损伤严重程度评分（ISS）、格拉斯哥昏迷评分（GCS）、体温（T）、心率（HR）、血浆白蛋白（ALB）、国际标准化比率（INR）和C反应蛋白（CRP）,构建了创伤后脓毒症评分（TSS）。分析结果表明,在训练人群和验证人群中,创伤后脓毒症的发生率随着TSS的增加而增加(Ptrend=7.44×10-21和Ptrend=1.16×10-13),TSS对创伤后脓毒症预警作用的AUC为0.799（0.757-0.837）和0.790（0.736-0.836）,且TSS的预警能力优于SOFA评分（P<0.001）。同时,H-L检验发现TSS具有良好的校正能力（P=0.386和P=0.082）。4.对lncRNA转录组数据的差异表达分析发现,PBMCs在LPS诱导后有890个lncRNAs和1635个mRNAs差异表达（FC≥2,FDR<0.05）。根据GO和KEGG分析,差异表达lncRNAs的功能主要集中在NF-KB、NLR、TLR和TNF等信号通路中,这些研究结果为脓毒症的诊断和治疗提供了潜在的lncRNAs靶标。同时,对公共数据库的分析发现VNN1在严重创伤后显着增加,且VNN1可能参与创伤脓毒症的发生和发展。在包含283例和121例患者的两个创伤人群中,血浆vanin-1与创伤后脓毒症发生密切相关(OR=3.92（2.68-5.72）,P=1.67í10-12)和OR=4.26（2.22-8.17）,P=1.28í10-5)),且血浆vanin-1对创伤后脓毒症的早期预警能力(AUC=（0.82（0.77-0.87）和0.83（0.75-0.89））显着优于CRP、PCT和APACHE II（P<0.05）。结论本研究首先通过系统评价和荟萃分析筛选了系列可能与脓毒症易患性相关的基因多态性位点,在此基础上构建了创伤后脓毒症易患性的遗传风险评分。其次,基于创伤患者入院后的临床数据,筛选和构建了包含7个临床变量的创伤后脓毒症发生风险早期预警评分。最后,借助组学技术筛选到一些可能作为脓毒症研究新靶点的差异表达lncRNAs,并发现血浆VNN1可能是预测创伤后脓毒症发生风险的新的生物标志物。
夏德萌[8]（2020）在《LncRNA、miRNA及相关信号轴在脓毒症和创伤相关炎症反应中的调控作用》文中研究指明研究背景脓毒症主要是指宿主/机体对感染的反应失调而引起的一种常见临床综合征,可继发于重大创伤、手术、烧伤、严重感染等临床重症,发病率、死亡率居高不下。即使有着现代新的抗生素和新的治疗手段,并发脓毒症休克和机体多器官功能障碍（MODS,Multiple organ dysfunction syndrome）的致死率仍然在50%以上。脓毒症病因和发病机制复杂,往往涉及多个脏器和器官。目前,机体失控性炎症学说,被认为是脓毒症病理生理机制的重要基础,因此炎症反应平衡失调一直是脓毒症发生发展机制的研究重点。创伤作为最为严重的全球性公共健康问题之一,给全球疾病造成的总负担占10%。创伤引起的抗炎和促炎平衡的失调,一方面会引起器官脏器的实质性损伤,另一方面会增加脓毒症及其相关并发症的发生率。因此有效防治脓毒症和MODS等相关并发症,是提高创伤救治水平的关键。但目前脓毒症仍未发现特效药物或明确治疗方式,因此脓毒症的早期预警和诊断显得尤为重要,尤其是创伤后,这使得相关潜在生物标志物的探究一直是研究的热点。迄今为止,常见的C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）,降钙素原（Procalcitonin,PCT）和白介素（Interleukin,IL）虽然已经用于脓毒症的诊断,但在具体判断中各有优缺点。近年来,越来越多研究者关注在先天免疫与凋亡等各大生物过程中发挥重要作用的非编码RNA。已有研究发现lnc RNA与某些复杂疾病（如脓毒症,代谢紊乱,癌症和心血管疾病等）密切相关。在脓毒症方面,已证实lnc RNA NEAT1（后称:NEAT1）在脓毒症患者血清中的表达量显着高于健康人群,提示NEAT1有可能作为脓毒症的潜在生物标志物,并在脓毒症病理生理过程中对炎症反应程度发挥调控作用。另外,作为当前基因表达调控的研究热点,lnc RNA可作为竞争性内源RNA,靶向与特定的mi RNA结合,从而抑制mi RNA的表达。同时,mi RNA本身由于其疾病特异性,相对稳定性和易于获取性等特征,具有成为某些特定疾病诊断与预后的潜在生物标志物的基础。本研究通过ENCORI在线软件提供了许多可能由NEAT1发挥海绵作用的mi RNA,其中一部分是和炎症相关:mi R495-3p和mi R-211。因此提出mi R495-3p和mi R-211可能在脓毒症引起的炎症反应的调控中发挥作用,但NEAT1、mi R495-3p和mi R-211是否是脓毒症乃至创伤相关炎症的主要参与者,仍需要详细的探究和验证。研究目的本研究旨在从炎症的角度解释lnc RNA NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211与脓毒症/创伤的关联。通过构建创伤和脓毒症相关小鼠模型,观察其生存情况和促炎因子的表达并分析和NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211的相关性。进一步通过炎症细胞模型探究NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211在炎症反应中的调控机制,阐明NEAT1,mi R-495-3p,mi R-211和相关信号轴的作用机制,为脓毒症和创伤的诊治提供新的可能。研究方法第一部分NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211基因表达水平对脓毒症/创伤小鼠模型生存状况、促炎因子表达水平的影响通过构建假手术组（SHAM）、脓毒症组（LPS）、创伤组（TH）、创伤+脓毒症组（TH+LPS）的小鼠模型,跟踪记录小鼠的生存情况,绘制生存曲线。同时收集小鼠的血清、肝、脾和肺组织,使用自动生化分析仪定量分析小鼠肝功能,酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定小鼠血清和肝组织中的相关炎性细胞因子,MTT法评估脾细胞的增殖情况,并提取小鼠肺组织的RNA,使用RT-PCR检测NEAT1、mi R-495-3p和mi R-211的表达和分析其和小鼠生存率的相关性。最后采用生信分析的方法,将上述实验结果输入R软件,生成相关矩阵。第二部分NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211在炎症细胞模型中的作用通过LPS构建单核巨噬细胞的炎症反应模型,通过蛋白质印迹法（Western Blot）检测细胞中炎症相关因子（p-PI3K,PI3K,p-AKT,AKT,TNF-α,IL-8,IL-10和MCP-1）的表达水平,使用RT-PCR检测NEAT1、mi R-495-3p和mi R-211的表达情况。为了进一步验证基因的相关关系,依托细胞转瞬的技术用质粒转染靶基因并且通过荧光素酶报告基因分析NEAT1和mi R-495-3p/mi R-211的靶向调控关系。第三部分NEAT1对mi R-495-3p和mi R-211相关信号轴的调控作用在RAW264.7单核巨噬细胞中,采用Western blotting技术检测NEAT1、mi R-495-3p、STAT3过表达情况下STAT3蛋白的表达量,使用RT-PCR技术检测,在STAT3过表达情况下,NEAT1和mi R-495-3p基因的表达量,并采用荧光素酶报告基因技术检测mi R-495-3p和STAT3的靶向关系。在信号通路的验证实验中,PI3K/AKT的表达检测同样使用了Western blotting技术,mi R-211表达检测使用的是RT-PCR技术。研究结果第一部分NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211基因表达水平对脓毒症/创伤小鼠模型生存状况、促炎因子表达水平的影响1.创伤和脓毒症使小鼠模型的存活率:经过统计发现,SHAM组的小鼠中未发生死亡,TH组中发现了2只（6.67%）死亡,LPS组有4只（13.33%）死亡,TH+LPS组有22只（73.33%）死亡,提示脓毒症导致小鼠死亡率增高,同时创伤会进一步提高脓毒症小鼠模型的死亡率。2.创伤和LPS促进相关小鼠模型中炎症因子表达:与SHAM组相比,TH组和LPS组小鼠的血清TNF-α,IL-1β和IL-6的表达水平升高,而TH+LPS混合干预组水平最高（P<0.05）。在肝组织中的炎症因子检测、肝功能损伤指标方面也都出现了相同的趋势。更进一步分析,在脾细胞增殖能力评估上,相比于SHAM组,TH组和LPS组脾细胞活性显着降低,TH组和LPS组比SHAM组脾细胞释放的IFN-γ和IL-2量少,而TH+LPS组脾细胞比TH组或LPS组释放的量更少（P<0.05）。基于这些结果,本研究推测:创伤和脓毒症都会促进炎症因子的产生,同时,相比与创伤或者脓毒症单一干预,创伤后的脓毒症可能使小鼠模型产生更多的促炎因子,炎症反应更加剧烈。3.NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211基因表达水平与创伤和脓毒症小鼠模型生存状况的相关性:TH组和LPS组的小鼠NEAT1的含量均高于SHAM组,且TH+LPS处理的小鼠显示出更高的NEAT1水平（P<0.05）。同时,在mi R-495-3p和mi R-211含量方面,TH组和LPS组的小鼠NEAT1的含量均低于SHAM组,并且TH+LPS处理的小鼠显示出更低的mi R-495-3p和mi R-211水平（P<0.05）。在生存关系分析上:携带高水平NEAT1的小鼠的存活率比低水平NEAT1的小鼠差,而低水平mi R-495-3p和mi R-211小鼠存活率相对较低。结果表明:检测NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211的基因水平可能对预测小鼠模型的生存状况有意义。4.NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211的基因表达水平与创伤和脓毒症小鼠模型产生的促炎因子水平相关性研究:NEAT1,mi R-495-3p,mi R-211,脓毒症特征性的炎性细胞因子（即TNF-α,IL-6,IL-10和MCP-1）之间存在相关性,p-PI3K,p-AKT和STAT3在SHAM组的小鼠模型中并不明显。在TH组和LPS组的小鼠中,相关性变得更强,上述分子的相关性在LPS+TH组中最为明显。在混合组发现:NEAT1和炎性细胞因子呈现正相关,mi R-495-3p,mi R-211和炎性细胞因子呈现负相关。进一步证实了NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211水平能够反映了小鼠模型中炎症反应情况的可行性。第二部分NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211在炎症细胞模型中的作用1.NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211及相关炎症因子在细胞模型中的表达情况:在炎性细胞模型中检测到上调的NEAT1水平以及下调的mi R-495-3p和mi R-211水平（P<0.05）,同时也发现了p-PI3K,p-AKT等炎症通路磷酸化蛋白,TNF-α,IL-10和IL-6等促炎因子和MCP-1炎症趋化因子的高表达。2.LPS和NEAT1的相关性探究:LPS组和NEAT1（+）组都可以刺激NEAT1表达量的升高,两者共刺激后表达量水平更高。3.NEAT1在炎症细胞模型中对mi R-495-3p和mi R-211表达的影响:LPS组和NEAT1（+）组mi R-495-3p表达量较对照组下降,但LPS+NEAT1（-）组表达量升高,相同的趋势在mi R-211表达中也有表达。表明LPS和NEAT1都可以引起mi R-495-3p和mi R-211表达量的下降,但NEAT1对mi R-495-3p和mi R-211表达的影响可能超过LPS。4.mi R-495-3p和mi R-211在炎症模型中对NEAT1表达的影响:mi R-495-3p组、mi R-211组和对照组在NEAT1的表达量上无差异,提示mi R-495-3p和mi R-211对NEAT1的表达无影响。5.NEAT1对RAW264.7细胞中细胞因子的影响:整体趋势相似,发现升高NEAT1水平导致细胞因子（p-PI3K、p-AKT、STAT3、TNF-α、IL-6、IL-10和MCP-1）表达升高,在pc DNA3.1-NEAT1和LPS的双重干预产生的细胞因子表达变化最为明显（P<0.05）。相反,沉默NEAT1似乎可以逆转LPS对产生细胞因子的促进作用（P<0.05）。6.mi R-495-3p和mi R-211对RAW264.7细胞中细胞因子的影响:升高mi R-495-3p和mi R-211的水平均导致p-PI3K,p-AKT,STAT3,TNF-α,IL-6,IL-10和MCP-1的低表达,并且在mi R-495-3p（-）和mi R-211（-）中发现p-PI3K,p-AKT,STAT3,TNF-α,IL-6,IL-10高表达（P<0.05）。结合上述结果提示,NEAT1、mi R-495-3p和mi R-211可以有效地影响LPS处理的炎症细胞模型中的相关反应。7.NEAT1作为海绵对mi R-495-3p/mi R-211表达的影响pc DNA3.1-NEAT1的转染使mi R-211和mi R-495-3p水平显着降低,而沉默NEAT1后却大大提高了mi R-211和mi R-495-3p的水平（P<0.05）。然而,当mi R-211和mi R-495-3p的水平升高或降低时,NEAT1的水平很少改变（P<0.05）。因此,小鼠单核巨噬细胞中的NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211之间存在靶向调控关系。第三部分NEAT1对mi R-495-3p和mi R-211相关信号轴的调控作用1.NEAT1对mi R-495-3p/STAT3信号轴的调控:STAT3表达在LPS诱导的炎症细胞模型中显着提高（P<0.05）。用pc DNA3.1-NEAT1和mi R-495-3p抑制剂处理巨噬细胞也显着改善了STAT3的体外表达,相反,在用si-NEAT1和mi R-495-3p mimic干预后,STAT3的表达量出现下降。在反向验证中,pc DNA-STAT3组巨噬细胞中的STAT3表达有所提高,但在si-STAT3的作用下呈现下降（P<0.05）。尽管如此,转染pc DNA-STAT3或si-STAT3时,NEAT1或mi R-495-3p的基因水平相对稳定（P>0.05）,提示STAT3不能反向调控NEAT1。通过荧光素酶报告实验,发现p GL3-STAT3-MUT+mi R-495-3p mimic3组和p GL3-STAT3-WT+mi R-NC组相比,mi R-495-3p mimic3+p GL3-STAT3-WT转染的巨噬细胞的荧光素酶活性减弱（P<0.05）。这些结果提示,NEAT1可能通过mi R-495-3p/STAT3信号轴调节炎症反应。2.NEAT1对mi R-211/PI3K/AKT信号轴的调控:si-NEAT1和mi R-211 mimics的转染可以使巨噬细胞中的PI3K/AKT表达降低,而pc DNA3.1-NEAT1和mi R-211mimics处理的巨噬细胞中p-PI3K和p-AKT表达却得到增强（P<0.05）。进一步的,使用PI3K/AKT抑制剂进行干预虽然能够降低PI3K/AKT表达,但未能改变NEAT1和mi R-211的基因水平（P>0.05）。此外,PI3K/AKT抑制剂可逆转pc DNA3.1-NEAT1对p-PI3K,p-AKT,TNF-α,IL-6,IL-10和MCP-1表达能力的影响（P<0.05）。加入PI3K/AKT活化剂后,mi R-211mimic对TNF-α,IL-6,IL-10和MCP-1表达的促进作用也受阻（P<0.05）。因此,这提示PI3K/AKT信号介导了NEAT1和mi R-211对RAW264.7细胞中炎症反应的影响。研究结论综上所述,通过动物模型和细胞模型,本研究初步探究了炎症反应在脓毒症和创伤中的重要作用,同时验证了NEAT1能够通过修饰mi R-495-3p/STAT3轴和mi R-211/PI3K/AKT轴来改变脓毒症中特征性细胞因子的表达,丰富了非编码RNA在炎症反应中的调控机制。
刘凯[9]（2020）在《miR-155-5P在脓毒症急性肺损伤时调控肺泡巨噬细胞IL-6、MIP-2的表达对中性粒细胞迁移的影响》文中研究指明目的:探讨脓毒症急性肺损伤（ALI）时miR-155-5P对肺泡巨噬细胞白介素-6（IL-6）、巨噬细胞炎性蛋白2（MIP-2）表达的调控作用及中性粒细胞迁移的影响。方法:培养小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）并将其分为对照组、脓毒症组和miR-155-5P抑制物组,miR-155-5P抑制物组预先通过miR-155-5P antagomir完成转染,采用脂多糖干预脓毒症组和miR-155-5P抑制物组12 h,应用RT-PCR检测3组MH-S细胞miR-155-5P、白介素6 mRNA和MIP-2 mRNA的表达,酶联免疫吸附试验检测细胞悬液中白介素6和MIP-2的浓度;再次将MH-S分为上述3组培养在Transwell板的下室,CFSE荧光染料标记的中性粒细胞培养在上室,脂多糖干预后应用流式细胞术分别检测上室与下室细胞的荧光值,计算中性粒细胞的迁移率。结果:与对照组相比,脓毒症组肺泡巨噬细胞的miR-155-5P表达明显上调（P<0.05）,IL-6mRNA和MIP-2mRNA的表达也明显上调（P<0.05）,同时IL-6、MIP-2的浓度和中性粒细胞迁移率均显着增加（P<0.05）;而miR-155-5P抑制物组细胞的miR-155-5P表达被抑制（P<0.05）,IL-6mRNA、MIP-2mRNA的表达及IL-6、MIP-2的浓度均低于脓毒症组（P<0.05）,高于对照组（P<0.05）,中性粒细胞迁移率明显低于脓毒症组（P<0.05）,高于对照组,但差异无统计学意义（P=0.528）。结论:脓毒症ALI时,肺泡巨噬细胞miR-155-5P基因高度表达,促炎因子IL-6mRNA、MIP-2mRNA的表达也明显上调,其促进IL-6、MIP-2的产生,使中性粒细胞大量趋化迁移至肺内,造成肺损伤;而抑制miR-155-5P的表达,可以抑制IL-6、MIP-2的产生,从而减少中性粒细胞的趋化迁移,起到肺保护作用。
裴志龙[10]（2020）在《miR-6786对脓毒症的作用机制》文中研究指明目的:探讨脓毒症患者外周血miRNA-6786的表达,体外LPS刺激巨噬细胞模型探讨miRNA-6786通过靶基因FRAT-2调控参与炎症反应过程,并探究其调控机制为wnt/β-catenin和NF-KB信号转导通路。方法:1.临床研究:（1）脓毒症组（sepsis组）及健康对照组（NC组）各30例,sepsis组于入院d1、NC组于体检时取外周血,通过RT-PCR法检测miRNA-6786的表达。（2）.利用Mi RDB数据库预测miR6786与何种靶基因及信号通路的相关性最高。2.体外细胞实验:（1）THP-1单核巨噬细胞诱导分化为巨噬细胞后分为6组:（1）正常巨噬细胞组（C组）;（2）LPS刺激巨噬细胞组（L组）:10ug/ml LPS刺激巨噬细胞;（3）miR-6786mimic转染组（L+M组）:miR-6786mimic转染巨噬细胞后10ug/ml LPS刺激;（4）miR-6786mimic转染对照组（L+MC组）:乱码无功能miR6786mimic转染巨噬细胞后10ug/ml LPS刺激;（5）miR-6786inhibitor转染组（L+IN-M组）:miR-6786inhibitor转染巨噬细胞后10ug/ml LPS刺激;（6）miR-6786inhibitor转染对照组（L+IN-MC组）:乱码无功能的miR6786inhibitor转染巨噬细胞后10ug/ml LPS刺激。（2）RT-PCR测定巨噬细胞FRAT-2、β-catanin、NF-KB m RNA表达。（3）Western Blot测定巨噬细胞FRAT-2蛋白的表达。（4）ELISA测定细胞上清中IL-1β及IL-6、TNF-α的炎症因子。结果:1.临床研究结果:RT-PCR测定NC组和sepsis组的miRNA-6786表达量分别为:（1.34±0.026,7.350±1.418）,sepsis组较NC组miRNA-6786的表达显着增高（t=18.92,P<0.0001）。2.体外细胞实验:（1）RT-PCR测定miR-6786结果:L组较C组miRNA-6786的表达量表现升高（t=44.5,P<0.0001）,L+MC组、L+IN-MC组较L组miRNA-6786表达的无明显差异（P>0.05）,L+M组较L+MC组miRNA-6786的表达量明显升高（t=49.5,P<0.0001）,L+IN-M组较L+IN-MC组miRNA-6786的表达量明显减低（t=14.8,P<0.0001）。RT-PCR测定FRAT-2、β-catanin、NF-KB的m RNA结果:L组较C组FRAT-2的m RNA无显着差异（P>0.05）,β-catanin、NF-KB m RNA表达量明显升高（t=20.9和5.00,P<0.05）,L+MC组、L+IN-MC组较L组FRAT-2、β-catanin、NF-KB m RNA表达无显着差异（P>0.05）,L+M组与L+MC组相比,FRAT-2的m RNA无显着差异（P>0.05）,β-catanin、NF-KB m RNA表达量明显降低（t=11.5和15.6,P<0.001）,L+IN-M组与L+IN-MC组相比,FRAT-2的m RNA无显着差异（P>0.05）,β-catanin、NF-KB m RNA表达量明显升高（t=40.0和9.098,P<0.001）。（2）Western Blot测定FRAT-2蛋白结果:L组较C组蛋白灰度值表现降低（t=10.3,P<0.0001）,L+MC组、L+IN-MC组较L组蛋白灰度值无显着差异（P>0.05）,L+M组与L+MC组相比,FRAT-2蛋白灰度值明显降低（t=17.7,P<0.0001）,L+IN-M组与L+IN-MC组相比,FRAT-2蛋白灰度值明显升高（t=15.2,P<0.0001）。（3）ELISA测定IL-1β及IL-6、TNF-α结果:L组较C组IL-1β及IL-6、TNF-α的表达量升高（t=17.3、11.8和19.9,P<0.001）,L+MC组、L+IN-MC组较L组IL-1β及IL-6、TNF-α的表达量无显着差异（P>0.05）,L+M组与L+MC组相比,IL-1β及IL-6、TNF-α的表达量显着降低（t=12.5、8,20和7.72,P<0.05）,L+IN-M组与L+IN-MC组相比,IL-1β及IL-6、TNF-α的表达量显着升高（t=5.45、5.91和19.2,P<0.05）。结论:1、本研究发现mi-R6786在脓毒症患者外周血中高表达。2、LPS刺激的巨噬细胞实验证明:mi-R6786通过抑制FRAT2蛋白的产生,影响巨噬细胞Wnt/β-catenin通路,减弱NF-KB的转录活性,从而减少IL-1β、IL-6及TNF-α等促炎因子释放。3、LPS刺激巨噬细胞可以一定程度增加miR-6786,但未出现明显的抑炎作用,miR-6786转染后可明显提高miR-6786的表达量,明显减少IL-1β、IL-6及TNF-α等促炎因子释放,可能存在与miR-6786有关的量效关系。
二、基因芯片技术在脓毒症中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因芯片技术在脓毒症中的应用（论文提纲范文）
（2）基于基因芯片数据挖掘探讨microRNA 15a在脓毒症骨骼肌功能障碍中的作用及分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文献综述 miRNAs 调控脓毒症骨骼肌的相关研究 |
| 参考文献 |
| 1.前言 |
| 2.研究设计与研究路线图 |
| 3.材料与方法 |
| 3.1 主要设备与试剂 |
| 3.2 实验动物 |
| 3.3 细胞培养 |
| 3.3.1 成肌细胞C2C12 细胞系复苏、换液、传代培养与冻存 |
| 3.3.2 成肌细胞C2C12 细胞系种板培养 |
| 3.3.3 成肌细胞C2C12 细胞系分化培养 |
| 3.3.4 成肌细胞C2C12 细胞系LPS模型建立 |
| 3.3.5 成肌细胞C2C12 细胞系miR-15a-3p模拟物与miR-15a-3p抑制物的转染 |
| 4.主要实验技术 |
| 4.1 提取蛋白 |
| 4.2 蛋白质印记分析(Western Blotting) |
| 4.3 实时荧光定量PCR法(Real-time PCR) |
| 4.4 感染EGFP-LC3 病毒 |
| 5.统计学分析 |
| 6.研究结果 |
| 6.1 关于脓毒症骨骼肌基因芯片GSE13205中miRNAs差异分析 |
| 6.2 在LPS小鼠模型中miRNAs的差异表达 |
| 6.3 在脓毒症细胞模型中miRNAs的差异表达 |
| 6.4 在体情况下,腹腔注射LPS促进骨骼肌组织自噬蛋白的表达 |
| 6.5 离体情况下,LPS促进C2C12 成肌细胞自噬蛋白的表达 |
| 6.6 离体情况下,LPS促进C2C12 成肌细胞的自噬活性 |
| 6.7 离体情况下,miR-15a-3p模拟物促进C2C12 成肌细胞自噬蛋白的表达 |
| 6.8 离体情况下,miR-15a-3p模拟物促进C2C12 成肌细胞的自噬活性 |
| 6.9 离体情况下,miR-15a-3p抑制物抑制C2C12 成肌细胞自噬蛋白的表达 |
| 6.10 离体情况下,miR-15a-3p抑制物抑制C2C12 成肌细胞的自噬活性 |
| 6.11 PGC1α是 miR-15a-3p在 C2C12 成肌细胞中的潜在靶基因 |
| 6.12 在体情况下,腹腔注射LPS抑制骨骼肌组织PGC1α的表达 |
| 6.13 离体情况下,LPS抑制C2C12 成肌细胞PGC1α的表达 |
| 6.14 离体情况下,miR-15a-3p抑制物促进C2C12 成肌细胞PGC1α的表达 |
| 7.分析与讨论 |
| 8.结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间学术科研成果 |
| 致谢 |
（3）miRNA在革兰阴性菌相关脓毒症中的诊断价值研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 研究材料和方法 |
| 1.1 研究对象的筛选 |
| 1.2 仪器设备和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 第2章 研究结果 |
| 2.1 筛选队列基本资料对比 |
| 2.2 基因芯片测定结果 |
| 2.3 验证队列基本资料对比 |
| 2.4 G~-脓毒症患者生存组和死亡组比较 |
| 第3章 讨论 |
| 3.1 脓毒症诊断及相关指标 |
| 3.2 本研究中上调miRNA的诊断效能分析 |
| 3.3 miRNA可用于脓毒症患者预后的判断 |
| 3.4 总结与展望 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 非侵入性生物标志物微小RNA在感染性疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）基于生物信息分析筛选参与脓毒症的关键基因及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 主要的实验材料和仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 确定关键基因MMP8 |
| 3.2 脓毒症患者中性粒细胞中MMP8 基因表达升高 |
| 3.3 脓毒症患者 VCAM-1 基因在不同时间点的表达量 |
| 3.4 脓毒症患者血清增加 HUVEC 的 VCAM-1 表达 |
| 3.5 脓毒症血清刺激后p38MAPK和 ERK1/2 蛋白的相对表达量显着增高 |
| 3.6 MMP8 抑制剂抑制脓毒症患者血清 HUVEC 的 VCAM-1 表达 |
| 3.7 MMP8 抑制剂血清刺激后p38MAPK和 ERK1/2 蛋白的相对表达量显着降低 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 脓毒症病理生理学的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）脂多糖诱导BV2小胶质细胞中的竞争性内源RNA表达谱研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(abbreviation) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 脓毒症 |
| 1.2 脓毒症相关性脑病 |
| 1.3 构建脓毒症相关性脑病体外细胞模型 |
| 1.4 ceRNA机制 |
| 1.5 脓毒症相关性脑病ceRNA表达谱研究 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 实验主要仪器与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 BV2 细胞复苏和培养 |
| 2.2.2 BV2 细胞传代 |
| 2.2.3 BV2 细胞接板 |
| 2.2.4 BV2 细胞冻存 |
| 2.2.5 BV2 细胞处理和分组 |
| 2.2.6 BV2 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.7 ceRNA芯片检测及服务 |
| 2.2.7.1 芯片检测 |
| 2.2.7.2 层次聚类分析 |
| 2.2.7.3 GO富集分析 |
| 2.2.7.4 KEGG通路富集分析 |
| 2.2.7.5 lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络 |
| 3 结果 |
| 3.1 总RNA样品的质控 |
| 3.2 lncRNA、circRNA和 mRNA的差异表达 |
| 3.3 GO富集分析 |
| 3.4 KEGG通路富集分析 |
| 3.5 ceRNA网络构建 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 非编码RNA在脓毒症中的研究进展 |
| 1 非编码RNA的生物发生 |
| 1.1 miRNA的生物发生 |
| 1.2 lncRNA的生物发生 |
| 1.3 circRNA的生物发生 |
| 2 脓毒症发展中的非编码RNA |
| 2.1 脓毒症中miRNA的调控 |
| 2.2 脓毒症中lncRNA的调控 |
| 2.3 脓毒症中circRNA的调控 |
| 3 非编码RNA作为脓毒症的生物标志物和治疗靶点的前景 |
| 参考文献 |
（6）MicroRNA-223抑制NLRP3炎症小体和TLR4/NF-κB信号通路减轻急性肺损伤炎症反应（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 miR-223在LPS诱导的急性肺损伤模型中的作用 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 急性肺损伤模型(ALI)的建立 |
| 2.2.2 小鼠肺组织常规染色病理检查 |
| 2.2.3 ELISA检测小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18的表达 |
| 2.2.4 基因芯片检测LPS诱导的小鼠肺组织micorRNA的差异表达及候选microRNA的验证 |
| 2.2.5 建立LPS诱导A549细胞的炎症反应模型 |
| 2.2.6 ELISA法检测细胞因子在LPS诱导的A549细胞中的表达 |
| 2.2.7 qPCR检测miR-223在LPS诱导的A549细胞中表达的研究 |
| 2.2.8 miR-223对LPS诱导的A549细胞中炎症因子表达的调控 |
| 2.2.9 统计学处理 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 成功建立LPS诱导的ALI小鼠模型 |
| 3.2 miR-223在ALI小鼠肺组织的表达 |
| 3.3 细胞因子及miR-223在LPS处理的A549细胞中的表达情况 |
| 3.4 miR-223抑制IL-1β和IL-18在LPS处理A549细胞中的表达 |
| 4. 讨论 |
| 5. 研究结论 |
| 6. 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二章 miR-223抑制NLRP3、TLR4和NF-KB信号通路减轻LPS诱导的细胞损伤 |
| 1. 前言 |
| 2. 资料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养及细胞分组 |
| 2.2.2 脂质体介导的瞬时转染 |
| 2.2.3 qRT-PCR分析miR-223对细胞中NLPR3、TLR4和NF-κB mRNA的表达 |
| 2.2.4 Western Blot检测miR-223对NLPR3、TLR4、NF-κB、caspase-1、RHOB蛋白表达水平的影响 |
| 2.2.5 ELISA检测细胞因子IL-1β和IL-18的表达 |
| 2.2.6 免疫荧光实验检测NLRP3的表达 |
| 2.2.7 野生型NLRP3(pMIR-REPORT-NLRP3-3’-UTR)及RHOB(pMIR-REPORT-RHOB-3,-UTR)荧光素酶报告质粒的构建 |
| 2.2.8 突变型NLRP3(pMIR-REPORT-NLRP3-MUT)及RHOB(pMIR-REPORT-RHOB-MUT)荧光素酶报告质粒的构建 |
| 2.2.9 双荧光素酶报告实验分析miR-223对NLRP3及RHOB的调控 |
| 2.2.10 统计学处理 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 LPS诱导的细胞损伤中,miR-223抑制NLRP3、TLR4和NF-κB信号通路 |
| 3.2 miR-223抑制TLR4信号通路减轻LPS诱导的细胞损伤 |
| 3.3 miR-223抑制NLRP3减轻LPS |
| 3.4 miR-223通过调控RHOB抑制NF-KB信号通路减轻LPS诱导的细胞损伤 |
| 4. 讨论 |
| 5. 研究结论 |
| 6. 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三章 综述miRNA对急性肺损伤的调控作用 |
| 1. 急性肺损伤 |
| 2. miRNA与急性肺损伤研究进展 |
| 3. miR-223研究进展 |
| 参考文献 |
| 第四章 总结与展望 |
| 1. 总结 |
| 2. 创新点 |
| 3. 不足之处 |
| 4. 展望 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 攻读博士学位期间已发表的论文 |
（7）创伤后脓毒症预警指标与方法研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 创伤后脓毒症遗传易患性研究 |
| 2.1 创伤后脓毒症易患性基因多态性位点的筛选 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 2.2 创伤后脓毒症易患性遗传风险评分模型的建立 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 第三章 创伤后脓毒症发生风险早期预警研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 创伤后脓毒症转录组学层面新的预警生物标志物鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 遗传风险评分在复杂疾病预警中的应用 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 脓毒症预警模型的建立及其应用 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）LncRNA、miRNA及相关信号轴在脓毒症和创伤相关炎症反应中的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 NEAT1,miR-495-3p和 miR-211基因表达水平对脓毒症/创伤小鼠模型生存状况、促炎因子表达水平的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 NEAT1,miR-495-3p和miR-211在炎症细胞模型中的作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NEAT1对miR-495-3p和miR-211相关信号轴的调控作用 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 非编码RNA作为脓毒症生物标志物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（9）miR-155-5P在脓毒症急性肺损伤时调控肺泡巨噬细胞IL-6、MIP-2的表达对中性粒细胞迁移的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 3组MH-S细胞miR-155-5P、IL-6mRNA和MIP-2mRNA表达比较 |
| 2.2 ELISA检测三组MH-S细胞IL-6和MIP-2的表达 |
| 2.3 Transwell细胞迁移实验检测三组中性粒细胞的迁移率 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）miR-6786对脓毒症的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2. 临床研究 |
| 3. 细胞实验 |
| 4、实验结果 |
| 5、讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 标记物中 miRNA 对脓毒症的的作用机制的研究概述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、基因芯片技术在脓毒症中的应用（论文参考文献）
- [1]通过加权基因共表达网络分析脓毒症相关基因[J]. 陈昌勤,李莉,赵昌云,甄军海,严静. 中华危重病急救医学, 2021(06)
- [2]基于基因芯片数据挖掘探讨microRNA 15a在脓毒症骨骼肌功能障碍中的作用及分子机制[D]. 张书礼. 上海体育学院, 2021(09)
- [3]miRNA在革兰阴性菌相关脓毒症中的诊断价值研究[D]. 谢可心. 大理大学, 2021(09)
- [4]基于生物信息分析筛选参与脓毒症的关键基因及其作用机制的研究[D]. 段淑芳. 安徽医科大学, 2021(01)
- [5]脂多糖诱导BV2小胶质细胞中的竞争性内源RNA表达谱研究[D]. 詹震. 安徽医科大学, 2021(01)
- [6]MicroRNA-223抑制NLRP3炎症小体和TLR4/NF-κB信号通路减轻急性肺损伤炎症反应[D]. 闫玉荣. 山东大学, 2020(11)
- [7]创伤后脓毒症预警指标与方法研究[D]. 陆红祥. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [8]LncRNA、miRNA及相关信号轴在脓毒症和创伤相关炎症反应中的调控作用[D]. 夏德萌. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [9]miR-155-5P在脓毒症急性肺损伤时调控肺泡巨噬细胞IL-6、MIP-2的表达对中性粒细胞迁移的影响[D]. 刘凯. 山西医科大学, 2020(10)
- [10]miR-6786对脓毒症的作用机制[D]. 裴志龙. 内蒙古医科大学, 2020(03)