一、一种畸形鸡胚染色体核型的研究(论文文献综述)
戴旭[1](2020)在《PGT-A应用于复发性流产伴不孕患者妊娠结局的回顾性研究》文中认为目的:复发性流产(Recurrent spontaneous abortion,RSA)是指连续两次或以上的临床妊娠流产,在人群中的发生率为3%-5%。有许多夫妇经过一系列RSA相关病因学检查,仍未找到导致流产的原因。近年来,随着对流产物染色体检查,发现50%以上的流产物存在染色体异常。因此,有学者提出对于RSA患者,可采用胚胎植入前非整倍体检测技术(Preimplantation Genetic Testing for aneuploidy,PGT-A)筛选整倍体胚胎移植,以达到提高临床妊娠率、降低早期流产率的目的。但在临床上PGT-A技术用于RSA患者的治疗存在很大争议。本研究通过回顾性分析比较不明原因复发性流产伴不孕患者行单精子卵胞浆内注射(ICSI)+PGT-A助孕和行常规IVF/ICSI妊娠结局,探讨PGT-A对改善RSA患者妊娠结局的有效性,从而为临床上该类患者的助孕治疗提供依据。方法:回顾性分析2017年1月至2019年5月在西北妇女儿童医院生殖中心助孕的RSA患者的临床资料。RSA伴不孕患者纳入标准:临床妊娠流产≥2次同时伴有夫妻双方性生活正常未采取避孕措施同居1年未妊娠者。排除标准:1.夫妻双方染色体异常;2.生殖道解剖异常;3.内分泌异常;4.免疫学检查异常;5.血栓前状态;6.生殖道感染;7.男方精液检查异常;8.夫妻双方生活环境中存在导致流产高危因素。患者符合以上纳入排除标准参考2018年《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》中PGT-A可应用于不明原因反复自然流产2次及以上。根据接受辅助生殖助孕患者是否选择进行PGT-A分为PGT-A组和常规IVF/ICSI助孕对照组,PGT-A组最终纳入患者132例,常规IVF/ICSI助孕对照组最终纳入患者564例。比较两组患者的临床妊娠率、流产率和活产率。结果:1.基线资料:PGT-A组和对照组相比,PGT-A组女方年龄低于对照组(30.13±3.99 VS 32.39±3.84 P<0.001),差异有统计学意义;对照组因盆腔输卵管因素导致不孕周期数多于PGT-A组(50.71%VS 39.39%P=0.019),差异有统计学意义;两组间男方年龄、流产次数、女方BMI、男方BMI、基础窦卵泡数、基础FSH值、基础LH值、基础E2值,差异均无统计学意义(P>0.05)。2.控制性超促排卵及胚胎发育情况:两组间促排卵药物(Gn)使用天数、Gn总用量、HCG日激素水平、HCG日>14mm卵泡数、实际获卵数、受精率、卵裂率、D3可用胚胎率、D3优胚率、囊胚形成率,差异均无统计学意义(P>0.05)。3.PGT-A组胚胎染色体非整倍性检测结果:PGT-A组共活检469枚胚胎、成功活检胚胎数目452枚,胚胎整倍体率为44.35%,非整倍体率为49.47%,嵌合体率为2.56%、扩增失败率(N/A)为3.62%。将PGT-A组患者按年龄分为2组,年龄≥35岁患者胚胎非整倍体率高于年龄<35岁患者胚胎非整倍体率(56.92%VS 44.48%P=0.008),差异有统计学意义。4.妊娠结局:PGT-A组的临床妊娠率(68.94%VS 44.33%P<0.001)、活产率(53.03%VS 31.91%P<0.001)高于对照组,差异均有统计学意义。流产率低于对照组(23.08%VS 28%P>0.05),但差异无统计学意义。Logistic回归分析显示:调整女方年龄后,PGT-A组的临床妊娠率和活产率仍高于对照组(P<0.001),差异有统计学。将两组患者按年龄分为2组,女方年龄<35岁组中:PGT-A组的临床妊娠率(69.61%VS 57.24%P=0.029)高于对照组,差异有统计学意义。但活产率(55.88%VS 44.88%P>0.05)高于对照组以及流产率(19.72%VS 21.6%P>0.05)低于对照组,差异均无统计学意义。女方年龄≥35岁组,PGT-A组的临床妊娠率(66.67%VS31.32%P<0.001)、活产率(43.33%VS 18.86%P=0.022)均高于对照组,差异均有统计学意义。流产率(35%VS 39.77%P>0.05)低于对照组,差异无统计学意义。因PGT-A组均采用单囊胚移植,将PGT-A组与对照组中单囊胚移植周期妊娠结局相比,PGT-A组的妊娠率(68.94%VS 55.47%P=0.023)与活产率(53.03%VS 40.88%P=0.046)仍高于对照组,差异有统计学意义。流产率低于对照组(23.08%VS 26.32%P>0.05),差异无统计学意义。结论:1.不明原因RSA伴不孕患者进行ICSI+PGT-A助孕与行常规IVF/ICSI助孕相比临床妊娠率以及活产率显着提高。2.按照年龄分组分析:ICSI+PGT-A助孕可明显改善年龄≥35岁高龄患者妊娠结局。3.与常规IVF/ICSI助孕中单囊胚移植周期妊娠结局相比,PGT-A组临床妊娠率、活产率显着升高。4.PGT-A可以降低不明原因RSA伴不孕患者的流产率,但与对照相比,差异无统计学意义。
韩燊[2](2020)在《基于诱导多能干细胞模型研究法洛四联症的转录调控机制》文中进行了进一步梳理[研究背景和目的]先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是人类最常见的出生缺陷疾病,是导致婴幼儿非感染性疾病中最主要的死亡原因。法洛四联症(Tetralogy of Fallot,TOF)是最常见的复杂性、紫绀性CHD,其死亡率较高,在10岁内,未经治疗的患者死亡率高达70-75%,但是由于目前缺乏相应的疾病模型,TOF的基因学、细胞学及分子学病因仍未明确。因此,我们需要一种新的工具或疾病模型系统来对TOF进行研究,使我们更好的探索其发生及发展过程中的病理生理学机制。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是利用重编程技术向体细胞内导入重编程因子得到的一种具有与胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESCs)相似的全能性的细胞,基于其明确的基因背景等特点,iPSCs为发育生物学及遗传疾病的病因生物学的研究提供了一种全新的思路。在心血管疾病的研究中,由于其能较好的保留样本的遗传背景,同时能很好的模拟心脏的发育过程,iPSCs为探索遗传变异导致的心脏发育异常提供了一个独特的细胞平台。基于以上理论,我们拟建立来自于TOF及健康对照的iPSCs细胞系,为探索TOF的疾病机理建立一个良好的平台。然后,诱导iPSCs向心肌细胞分化,比较TOF及健康对照在细胞水平的功能差异。最后,基于心肌细胞模型研究TOF在心肌发育阶段的转录调控机制。[方法]第一部分:采集TOF及健康对照组的皮肤组织,通过组织块贴壁法获取皮肤成纤维细胞;使用仙台病毒作为载体将经典的“OCT3/4,SOX2,Klf4及c-Myc”4种重编程因子导入原代培养的皮肤成纤维细胞中,采用无血清及无滋养层细胞的方法进行iPSCs的诱导;进一步使用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、流式细胞术及qPCR等方法对iPSCs的多能性基因及蛋白进行检测,同时使用G显带核型分析法对细胞的核型进行分析;最后,使用体内畸胎瘤形成实验,对iPSCs的多向分化潜能进行检测。第二部分:通过使用小分子化合物CHIR99021及IWP-2对Wnt通路进行干预并结合维生素C及BMP4等使用单层细胞分化的方法诱导上述iPSCs向心肌细胞分化,进一步通过乳酸代谢的方法对其进行纯化后,使用免疫荧光、流式细胞术及qPCR等方法对诱导后的心肌细胞的特异性基因及蛋白表达进行检测,同时使用透射电镜对其超微结构检测;然后,通过CCK8及Ki67染色对不同组别的心肌细胞的增殖功能进行检测,并使用划痕实验对细胞的迁移能力进行检测。第三部分:收集iPSCs诱导分化后的心肌细胞(每株iPSCs进行三次独立的诱导分化后收集细胞),对细胞转录组进行提取扩增后,使用高通量测序技术对样本进行测序,对测序后的数据进行分析,寻找TOF组和健康对照间的差异表达基因,通过生物信息学分析探索关键的差异基因,并使用qPCR对关键差异基因MYL2、BMP10、CXCL12等进行验证。进一步使用siRNA敲低AC16心肌细胞中关键差异基因BMP10的表达,对成功敲低BMP10的心肌细胞使用CCK8及EdU染色检测细胞增殖能力,使用划痕实验检测迁移能力,以明确BMP10在心肌细胞中的作用;最后使用Western blot及qPCR对其下游调控的关键通路及分子进行研究。[结 果]第一部分成功构建iPSCs:通过使用组织块贴壁法,我们成功获取了 3例TOF及2例健康对照的皮肤成纤维细胞,且5株细胞均有较好的增殖活性;采用仙台病毒携带经典的“OSKM”重编程因子,我们成功将上述5株成纤维细胞诱导为具有与ESCs形态相似的克隆状的iPSCs。在培养过程中发现其中2株TOF组及1株健康对照组iPSCs有较好的克隆形态及增殖效率,而其余2株细胞活性较差且出现了明显的自分化现象;因此,我们选择生长较好的3株细胞进行鉴定及研究,首先3株iPSCs碱性磷酸酶染色均为阳性;免疫荧光、流式细胞术及qPCR检测多能性基因或蛋白OCT4、Nanog等均高表达;细胞核型经传代培养20代以后表型正常;畸胎瘤形成实验证实3株细胞具有较好的三胚层分化能力。第二部分iPSCs诱导分化为心肌细胞:使用干预Wnt通路结合维生素C及BMP4的方法成功将3株细胞定向分化为可自发搏动的心肌细胞,且该方法诱导效率较高,三株细胞均高于80%,组间无差异;同时使用乳酸代谢的方法成功将3株分化后的心肌细胞阳性率纯化至接近于95%;分化后的心肌细胞免疫荧光染色显示心肌特异性蛋白CTNT及α-actinin均高表达,qPCR检测显示心肌特异性基因表达水平显着增高;TOF组及健康对照来源的心肌细胞在细胞体积、搏动效率、离子通道基因的表达及超微结构上无显着差异;然而CCK8及Ki67染色显示TOF来源的心肌细胞相对于正常组增殖能力降低,其中TOF-1组显着降低;同时划痕实验发现TOF组来源的心肌细胞迁移能力也显着降低。第三部分iPSCs来源的心肌细胞转录组测序分析及关键差异基因功能研究:在TOF组与对照组间共筛选出差异表达的基因1388个,相对于健康对照组,TOF组表达上调的基因1006个,表达下调的基因382个;通过对差异表达基因的GO富集分析,我们发现表达下调的差异基因显着富集于与心脏的发育相关的term中,进一步的生物信息学分析发现MLY2、BMP10、CSRP3、TBX5、TBX20、WNT2、ISL1、CXCL12、TNF、SNAI1、S1PR1及SERP1NE1等基因位于局部基因簇的中心位置;通过使用qPCR对差异基因进行验证后,我们发现MLY2、CSRP3、BMP10、TBX5、TBX20、CXCL12、TNF及SERPINE1等基因在 TOF 组中的表达量显着低于健康对照。进一步使用人心肌细胞AC16验证BMP10基因功能发现:敲低AC16中的BMP10基因后,其增殖能力显着下降,而迁移能力无明显改变。进一步对其下游调控机制分析发现BMP10敲低后Smad1/5及Erk1/2的磷酸化水平下调,下游的转录因子TBX5及TBX20的表达水平下调。同样,在iPSCs-TOF组中心肌细胞的p-Smad1/5、p-Erk、TBX5及TBX20的表达水平也下调。[结论]1.本研究成功构建TOF及健康对照来源的具有多向分化潜能iPSCs,可作为疾病模型从细胞水平探索TOF的发病机制。2.TOF来源的iPSCs在心肌细胞分化效率上与健康对照无差异;而TOF组来源心肌细胞增殖能力及迁移能力降低,我们推测在心脏发育过程中,心肌细胞的增殖能力及迁移能力的异常可能参与了 TOF的发生。3.通过对心肌细胞转录组数据进行分析及验证后,我们发现MYL2、CSRP3、BMP10、TBX5、TBX20、CXCL12、TNF及SERPINE1基因的表达下调可能参与到心肌细胞的增殖及迁移等生物学功能中,并最终造成TOF的发生。4.BMP10的异常表达可通过调控下游Smad1/5及MAPK信号通路从而影响心肌细胞的增殖功能。此外,在TOF的发生中,BX5及TBX20可能是BMP10的下游调控的转录因子。
王圣然,吴东,王涛,霍晓东,高越,张梦汀,廖世秀[3](2019)在《1例16p11.2微重复综合征的产前诊断及遗传学分析》文中进行了进一步梳理目的明确1例右位主动脉弓胎儿染色体拷贝数目变异的性质,探讨其预后及发病机制。方法采用常规G显带核型分析1例右位主动脉弓胎儿羊水细胞染色体核型,应用微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization, aCGH)技术分析胎儿及其父母基因组DNA拷贝数目变异。结果 G显带核型分析结果显示胎儿染色体核型未见异常;aCGH分析结果为16p11.2区域存在525 kb的重复,其中包含右位主动脉弓相关的功能基因HIRIP3,其父母基因组DNA拷贝数目均未见异常。结论胎儿16p11.2区域重复为新发突变,具有致病性,可能与胎儿右位主动脉弓表型有关。
虞游[4](2019)在《基于患者特异iPSC的先天性心脏病模型建立和机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:心血管疾病严重威胁人类健康,先天性心脏病作为心血管疾病的一部分,在我国其发病率在新生儿中高达1%。心脏关键基因的突变与先天性心脏病的发生有着密切的关系。诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)来源于成体细胞的重编程,与成体细胞具有相同的遗传物质,并且与胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)特性类似,具有自我更新和分化包括心肌细胞在内三胚层细胞的能力。因此,利用iPSC可以建立病人特异的心脏疾病模型,针对病人的心肌病理机制开发药物,可实现精准医疗。GATA4作为心脏发育过程中的核心转录因子,参与心脏发育过程中的心肌细胞分化和增殖等重要过程。研究方法:本研究建立了携带GATA4 T280M突变的先天性心脏病患者特异的iPSC疾病模型,并通过基因编辑技术建立了 GATA4T280M杂合突变的ESC细胞模型。利用心肌细胞定向分化获得心肌细胞,分析了GATA4T280M突变蛋白质对心肌细胞增殖的影响。结合基因组学和转录组学的分析方法,开展了致病机制的相关研究。研究结果:病人特异携带GATA4T280M突变的iPSC(iPSC-GATA4T280M)和野生型iPSC均具有自我更新和三胚层分化潜能。通过心肌细胞的定向分化发现,iPSC-GATA4T280M分化的心肌细胞增殖能力明显降低,基因编辑引入GATA4T280M突变的ESC(ESC-GATA4T280M,H7G4)分化的心肌细胞也出现相同表型。通过细胞免疫荧光以及蛋白核质分离实验,发现GATA4T280M蛋白质和野生型GATA蛋白质都定位在细胞核里;通过荧光素酶分析发现,GATA4T280M蛋白对下游靶基因的转录活性明显降低;通过对所分化的心肌细胞进行ChIP-Seq和RNA-Seq的高通量分析表明,GATA4T280M结合DNA的能力明显下降,并且在结合的DNA序列的偏好性上出现了明显的偏移;从转录组水平上来看,GATA4T280M心肌细胞中与增殖相关基因表达显着下调。通过联合比较分析iPSC-GATA4T280M和野生型iPSC分化心肌细胞的ChIP-Seq和RNA-Seq结果发现,与细胞增殖相关的差异基因仅有4个(JUN、FGF16、HMOX1和FLT4),其中,FGF16与心脏发育相关并且在GATA4T280M心肌细胞中表达明显下调。为了验证FGF16基因是否为GATA4的靶基因,在GATA4T280M心肌细胞中过表达FGF16基因能够挽救心肌细胞的增殖效率。通过ChIP-PCR和启动子荧光素酶分析发现,野生型GATA4能够直接结合到FGF16基因的启动子上,对其进行正向调控,而GATA4T280M蛋白的结合能力变弱。结论:通过构建病人特异的iPSC模型和基因编辑的ESC模型,我们发现GATA4的突变(T280M)并不会影响多能干细胞的干性和分化能力,但GATA4 T280M心肌细胞的增殖能力显着降低。在调控机制方面,GATA4T280M蛋白转录活性明显降低,且直接影响FGF16基因的表达,从而导致心肌细胞增殖减慢;而在GATA4T280M心肌细胞中过表达FGF16能够挽救心肌细胞增殖。本研究首次从人的心肌细胞中明确了GATA4T280M的突变与先天性心脏病的直接关系,为先天性心脏病产前筛查提供了重要靶点,同时为GATA4T280M突变先天性心脏病的治疗提供了药物筛选模型。
马波[5](2015)在《人胚胎二倍体细胞株Walvax-2的建立、检定及应用》文中进行了进一步梳理人胚肺二倍体细胞是病毒性疫苗生产的重要宿主细胞之一,20世纪60年代至今,使用人胚肺二倍体细胞制备的疫苗在世界各地使用,如脊髓灰质炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、水痘病毒疫苗及甲肝病毒疫苗等。长期使用证明人胚肺二倍体细胞生产的疫苗是安全有效的,成为WHO推荐的病毒疫苗生产最安全的细胞。目前全球应用较多的是MRC-5和WI-38人二倍体细胞,虽然有很多企业及团体在开展人二倍体细胞的研究,但由于严格的伦理审查、复杂的遗传背景资料调查,使新型人胚肺二倍体细胞的研制缓慢。同时,人胚肺二倍体细胞有限的生命周期及有限使用代次的特性,使得人胚肺二倍体细胞资源弥足珍贵。现在使用的WI-38和MRC-5的供应逐渐减少,在我国使用较多的MRC-5,也存在生产细胞代次高及外部环境两个限制因素。因此,新的人胚肺二倍体细胞的研制已迫在眉睫。国内自建的KMB-17和2BS人二倍体细胞仅在自建单位及少数单位使用,由于体制原因,难以获得两株的细胞的使用权。基于人胚肺二倍体细胞基质的优越性和资源的珍贵性,本研究于2008年至今开展了全新的人胚胎二倍体细胞株的研制,成功筛选到一株合格的人胚肺二倍体细胞,命名为Walvax-2细胞株。该细胞株来源于3月龄流产女婴的肺部组织,经无菌分离及传代培养建立了冷冻保存的完整的三级细胞库,三级细胞库经细胞鉴别试验、无菌检查、支原体检查、细胞内、外源病毒因子检查、逆转录病毒检查、人源、牛源和猪源病毒等全面检定,质量合格,未检出各类微生物污染,且成瘤性检查结果为阴性,未发现结瘤驮,是一株优质细胞株。Walvax-2细胞株经用于多种病毒的适应性研究,以MRC-5细胞作为对照,开展了狂犬病毒株(CTN-1V株/PV-2061株)、水痘病毒株(Oka株)、甲肝病毒株(YN5株)的传代适应工作。结果显示,两株狂犬病毒在Walvax-2细胞上病毒滴度均获得有效增长,狂犬病毒CTN-1V株从第1代病毒滴度为4.84 log FFU/ml,传至第10代上升到8.141ogFFU/ml。狂犬病毒PV-2061株第1代病毒滴度为4.44 log FFU/ml,传至第10代达到8.02 log FFU/ml,而对照MRC-5细胞适应的病毒滴度表现为:CTN-1V株传至第10代为7.41 log FFU/ml, PV-2061株传至第10代为7.11 log FFU/ml。相同代次病毒滴度比较,Walvax-2细胞获得的病毒滴度均高于MRC-5细胞,Walvax-2和MRC-5细胞适应情况有明显的差异(P<0.05); Oka株(使用时毒株为32代)在Walvax-2细胞上进行病毒传代,病毒滴度平均值第1次传代就达到6.28 log PFU/ml,至Oka株传到41代时,最高病毒滴度达到6.66 log PFU/ml,而在MRC-5细胞上传代,最高滴度小于6.0 log PFU/ml。总体适应情况有显着差异(P<0.05); YN5株(使用时毒株代次为23代)在Walvax-2细胞上进行病毒传代,病毒滴度第1次传代达到7.32 logCCID50/ml,连续传代至31代,病毒滴度上升至7.65 log CCID50/ml。在Walvax-2细胞上总体情况较MRC-5细胞7.0-7.36 log CCID50/ml较高。实验结果表明3种病毒均对Walvax-2人胚肺二倍体细胞株表现了良好的适应性,适应性病毒培养后滴度均高于MRC-5细胞,且有统计学差异。Walvax-2作为一株新的人胚肺二倍体细胞株,对病毒有较好易感性,有希望成为现用二倍体细胞的替代者。
毕志香,李鹏成,揭鸿英,朱亚露,何家惠,陈瑾,褚轩,于漾,侯继波[6](2015)在《DF-DF-1细胞的保存期试验及致瘤性鉴定》文中进行了进一步梳理为研究DF-1细胞的保存期及其传代过程中的稳定性和安全性,将来源于ATCC的DF-1细胞建立细胞库,取液氮保存12、24及48个月的DF-1细胞复苏,经3次传代后,观察不同批次细胞的生长特性并接种鸡传染性法氏囊病病毒,研究各批次细胞出现病变的时间及病毒含量;同时制备不同代次细胞的染色体并进行核型分析;对基础细胞库14代和最高代次60代的DF-1细胞进行致瘤性检测。结果显示,DF-1细胞在液氮中保存48个月,对细胞生长特征及增殖病毒无明显影响,经传60代后的细胞,染色体核型无明显差异且无致瘤性,表明DF-1细胞在传代过程中是稳定且安全的。
刘贤侠[7](2013)在《鸡、鹌鹑及其杂交种胚胎性分化相关基因的研究》文中进行了进一步梳理鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎的早期死亡可能正是由于在其性分化过程中,分别来自鸡和鹌鹑的相关基因在表达上出现了差异,从而导致了早期胚胎死亡,这样胚胎死亡的主要原因就和雌激素受体及其调控的相关基因的表达密不可分。因而本研究采用ER等性分化相关基因作为首要研究对象进行了研究。为了保证后续实验采样的需要,进行了提高鸡()与鹌鹑()杂交胚胎受精率和存活率的试验研究,结果表明,连续2d输精后间隔1d,早晚采集公鸡混合精液各输精2次,并且鹌鹑处于产蛋高峰期(产蛋率在80%以上),孵化采用德国进口Grumbach旋转孵化机(温度37.8-38.6℃,湿度:60%—80%),在鹌鹑阴道浅部输精,连续2天输精,每天早晚各1次,间隔1天后再进行操作较好,可以取得较好的效果。对影响鹌鹑早期胚胎发育及性别分化的4个基因的表达进行研究。采用Wpkci基因和多重PCR鉴定鹌鹑早期胚胎的性别,在此基础上,选取早期胚胎发育不同时间点(3、4、5、6、7、8d)雌雄鹌鹑胚胎共120枚,其中雌雄各60枚,每个时间点10枚。采用Real-time PCR方法检测鹌鹑雌雄胚胎发育过程中不同时间点性别分化相关基因(3β-HSD、P-450c17、P450arom和ER)的表达,探讨了3β-HSD、P-450c17、P450arom和ER基因对鹌鹑早期胚胎发育及性别分化的影响。结果表明,鹌鹑胚胎P-450c17、P450arom和ER基因在鹌鹑胚胎发育的第4天雌性均高于雄性,其中P450arom基因仅在雌性胚胎中检测出有表达,且表达量在第4天达到最高峰(P﹤0.01),雄性胚胎整个发育过程中都无P450arom基因的表达;ER基因在鹌鹑胚胎发育第4天雌性显着高于雄性(P﹤0.05);P-450c17在鹌鹑胚胎发育第4天虽雌性高于雄性,但无显着性差异(P﹥0.05)。另外,3β-HSD在鹌鹑胚胎发育第5天达到其表达最高值,且雌性极显着高于雄性(P﹤0.01)。研究结果表明,3β-HSD、P-450c17、P450arom和ER基因在鹌鹑早期胚胎性别分化过程中起着重要的作用,尤其是在胚胎发育45d。为了对鸟类性别分化中起重要作用的基因进行深入分析,对家鸡性反转胚胎雌激素及相关调控基因表达模式进行了检测,分析这些性激素在鸟类性别分化调控起到的作用。选择ER、3βHSD、P450c17、P450arom4个基因为主要研究对象,采用外源注入formestane(福美司坦)和17β-estradiol(17β雌二醇)2种手段,并设置雌雄鸡胚2个对照组,检测以上基因在胚胎早期发育过程中(84h、96h、120h、144h、168h、192h)的表达变化趋势。ER、3βHSD、P450c17、P450arom基因的表达变化在注入外源激素的试验组同未注射组间,差异均显着(P<0.05)或极显着(P<0.01),其中ER表现为下降趋势,P450arom表达激增,3βHSD、P450c17基因表达变化缺乏明显规律。雌激素调控是一个复杂的过程,在外源激素注入过程后,原有调控模式可能会被打乱。由于类固醇激素在禽类性腺的发育中起到重要作用,因此研究催化类固醇激素生物合成的5中酶的基因表达就尤为重要。在鸡、鹌鹑及杂交种胚胎性别分化前后这段时间内,与ER相关的基因的表达情况在性分化中起着重要的作用,利用PCR鉴定胚胎性别技术,结合RT-PCR技术对3β-HSD、P-450c17、Aromatase、ER等基因的表达规律进行分析,探索不同性别、不同胚胎发育时间,雌激素受体等相关基因的表达规律,对比鸡与鹌鹑中各基因的表达情况,可以分析杂交种胚胎大量早期死亡中雌激素受体所起的作用,及其相关调控机制。研究结果表明,3β-HSD基因雌性杂交胚胎的表达峰值分别出现在3d6h(78h)、4d(96h)和5d(120h),而雄性胚胎表达明显比雌性低。P-450c17基因雌性杂交胚胎的表达峰值出现在3d6h(78h),4d内明显高于雄性,此后杂交胚胎不管雌性和雄性表达均处于很低水平。P450arom基因雌性杂交胚胎的表达峰值分别出现在3d(72h)、3d12h(84h)、4d(96)、5d(120h),雄性杂交胚胎不表达P450arom基因。ER基因雌性和雄性胚胎的表达峰值都分别出现在3d(72h)、4d12h(108h),但是雌性相对表达较高,4d(96h)、5d(120h)时表达均处于低水平,6d(144h)后表达均很低。采用RIA法测定鸡、鹌鹑及其杂交胚胎第3天—第6天每个3h时间段的雌二醇和睾酮含量。结果显示,杂交胚胎的睾酮含量明显比鸡和鹌鹑早期发育胚胎高,并且雌二醇含量呈现波动性变化,在性分化前后激素合成紊乱也是导致杂交胚胎发育异常的原因,这也初步证明了以上性激素生成过程中基因表达的异常。综合以上研究结果提示,正是由于在其性分化过程中,分别来自鸡和鹌鹑的相关基因在表达上出现了差异,从而导致了早期胚胎死亡,这样胚胎死亡的主要原因就和雌激素受体及其调控的相关基因的表达密不可分,ER在杂交种早期死亡中确实扮演了重要的角色。杂交种出现的基因表达、激素水平异常表现说明了杂交种存在着自己独特的基因表达模式,而这种模式出现的时间又与其死亡时间吻合。
龚立[8](2013)在《肺动脉闭锁遗传学初步研究》文中进行了进一步梳理第一部分肺动脉闭锁染色体核型分析[目的]对肺动脉闭锁患儿进行核型检测,分析染色体异常与肺动脉闭锁的关系。[方法]35例肺动脉闭锁患儿行G显带常染色体检测。[结果]发现1例合并有21三体综合征,余染色体核型正常。[结论]21三体综合征可合并有肺动脉闭锁,肺动脉闭锁患儿染色体核型异常并不多见,提示应用常规染色体核型分析无法对这种严重复杂的先心病进行筛查。第二部分肺动脉闭锁TBX1微缺失研究[目的]对肺动脉闭锁患儿进行TBX1微缺失检测,探讨肺动脉闭锁与TBX1的关系。[方法]选用荷兰Kreatech公司Poseidon FISH DNA的KBI-40104MD DiGeorge T-boxl(22q11)/22q13(SHANK3),应用染色体原位荧光杂交技术(FISH)对染色体核型正常的34例肺动脉闭锁患儿进行TBX1微缺失检测。[结果]发现3例TBX1微缺失阳性患儿,阳性率为8.82%。[结论]TBX1是22q11.2微缺失的核心基因,22q11.2微缺失是肺动脉闭锁的主要致病原因之一,TBX1可能是肺动脉闭锁易感基因。第三部分全外显子测序初步筛选右室流出道梗阻易感基因[目的]对一个右室流出道梗阻家系中2名成员进行全外显子测序,进行数据分析,初步筛选右室流出道梗阻易感基因。[方法]收集一个右室流出道梗阻家系中2名成员的静脉血,采用life technology全外显子捕获试剂盒进行捕获,用Life technology solid5500x1高通量测序仪进行高通量测序,测序结果与公共遗传突变数据库(db132SNP)及华中科技大学人类基因组中心正常人外显子数据库进行比对,过滤已报道的常见变异,再将单核苷酸非同义突变进行整合,初步筛选出候选基因。[结果]结果显示过滤后落在外显子区域的单核苷酸变异(SNP)数目外婆为42727个,孙子为38207个;过滤后落在外显子区域未报道的单核苷酸变异数目外婆为4582个,孙子为4249个;通过ACCESS数据分析发现,有121个新发现单核苷酸变异同时存在于祖孙两人的基因组中。同时使用华中科技大学人类基因组中心已有正常人外显子对照数据库进行筛选,46个变异没有在对照数据库中发现。将46个变异输入到使用ANNOVAR软件预测可能有害的突变位点,将候选基因范围缩小到19个。[结论]WNK1、KRTAP1-1、UBR2、EPS15、CKAP2、PIGB、DENND4A、 HYDIN、CNTN3、NDUFC2、SAMD9L、KIAA0825、C7orf58、NCKAP5、SPINK5、 FCRL3、TTN、MUC等19个基因可能是右室流出道梗阻易感基因,但须进一步确认。
田卉[9](2013)在《QF-PCR检测22q11.2微缺失方法建立及产前诊断应用研究》文中指出第一部分QF-PCR检测22q11.2微缺失方法的建立研究目的以TBX1基因附近SNP位点作为靶位点,探讨运用荧光定量PCR检测22q11.2微缺失的准确度及灵敏度,在此基础上,建立一种准确度高、特异性强、快速、高通量、费用低且适合在国内开展的诊断22q11.2DS的方法。方法和材料1研究对象2010年10月至2011年5月在天津市儿童医院进行CHD手术的患儿84例,年龄1个月~14岁,平均年龄(2.55±0.36)岁。另选30例在儿童医院进行查体的健康儿童作为对照组。2研究材料抽取患者外周血4ml,其中,2ml用于淋巴细胞培养、染色体核型分析,1ml采用酚-氯仿的方法提取DNA并保存于-20℃备用;另1ml按FISH处理方法进行离心、低渗、固定处理并保存于-20℃备用。3染色体核型分析实验组及对照组所有样本通过普通光学显微镜进行染色体核型分析,计数30个核型,分析5个。根据染色体核型分析结果将所有样本分成核型正常组和核型异常组。4QF-PCR对染色体核型正常的实验组及对照组进行QF-PCR检测。选取位于22号染色体TBX1基因上游4660bp的SNP位点rs9618682(G/A)作为本研究的靶位点,19号染色体上的PTBP1基因作为内参基因。将原始数据、扩增曲线等信息从定量软件中导出进行分析,得到样本基因相对表达量rGCN及图谱。rGCN=1时,表示无缺失,rGCN=0.5时,表示有缺失。5FISH对染色体核型正常的实验组和对照组进行FISH检测。应用双色荧光探针,以位于22q11.2区域的TUPLE1基因为目标基因,显示红色荧光信号;位于22q13.3区域ARSR基因为对照基因,显示绿色荧光信号,按FISH程序进行制片、干燥、变性、杂交、后洗、染色和镜检。正常诊断标准:单个细胞内红、绿色信号各2个。22q11.2DS诊断标准:单个病例中大于60%的单个细胞内绿色信号2个,红色信号缺失1个。6统计学分析将QF-PCR与FISH两种方法结果对比,统计学分析。结果1染色体核型分析结果84例CHD患儿中共检出异常核型2例,包括1例46,XX,inv(9)(p11q12),1例46,XY,16qh+.对照组染色体异常核型0例。2DNA提取的质量用酚-氯仿的方法提取外周血DNA,DNA的浓度在44.61ng/μ1~161.2ng/μl,A260/280在1.65~1.85之间。3QF-PCR检测结果82例染色体正常的CHD患儿中,77例的TBX1与PTBP1基因拷贝数的比值为(0.922±183),接近于1;5例患儿的比值明显降低,为(0.512±0.046),接近于0.5。对照组TBX1与PTBP1基因拷贝数的比值为(0.929±0.220),接近于1。且5例患儿均与正常人群的比值无交叉重叠。4FISH检测结果FISH检测82例染色体核型正常的CHD患儿中,发现5例有22q11.2缺失,余未见缺失;且检测结果与QF-PCR检测的结果完全一致。30例对照组均未见缺失。5统计学分析QF-PCR检测灵敏度100%,特异度100%,Kappa值1.0。实验组先天性心脏病患儿中,22q11.2微缺失检出率为6.10%(5/82);在对照组,22q11.2微缺失检出率为0%(0/30),行Fisher精确概率法检测,实验组与对照组22q11.2微缺失检出率之间存在明显差异p=0.048(<0.05)。结论1SNPrs9618682位点是检测22q11.2微缺失非常重要的一个靶位点。2QF-PCR检测22q11.2微缺失准确度高、特异性强,快速、简便、高通量,可以作为22q11.2DS的诊断依据,为明确CHD患儿病因提供可靠的实验室证据。3本实验通过对实验组及对照组22q11.2微缺失的检测结果比较得出结论,22q11.2微缺失是引起CHD最重要遗传学病因之一。第二部分QF-PCR检测22q11.2微缺失在产前诊断中的应用研究目的将QF-PCR法应用于CHD的产前诊断中,以明确部分CHD病因,指导临床决策,降低我国的围产儿死亡率及CHD出生缺陷率,从而提高出生人口的质量。方法和材料1研究对象2011年5月至2013年3月在天津市中心妇产科医院经B超诊断为CHD的胎儿45例,胎龄20~30周,平均胎龄(24.33±1.28)周;另选30例经B超诊断正常、因计划外怀孕需做引产的胎儿作为对照组。2研究材料孕妇签署知情同意书后,常规皮肤消毒铺巾,B超引导下进行羊水穿刺术,取羊水30m1于无菌离心管中。10m1用于胎儿羊水培养、染色体核型分析,10ml羊水采用酚-氯仿的方法提取DNA并保存于-20℃备用;另10m1羊水按FISH处理程序进行离心、低渗、固定处理并保存于-20℃备用。3染色体核型分析实验组及对照组所有样本通过普通光学显微镜进行染色体核型分析,计数30个核型,分析5个。根据染色体核型分析结果将胎儿分成核型正常组和核型异常组。4QF-PCR对染色体正常的CHD胎儿样本及对照样本进行QF-PCR检测,方法同第一部分QF-PCR法。5FISH验证对QF-PCR检测有缺失CHD胎儿进行FISH验证。方法同第一部分FISH检测法。结果1染色体核型分析结果45例CHD例胎儿共检出异常核型3例,1例47,XX,+21,1例47,XX,+13,1例46,XX,inv(9)(p11q12)。2DNA提取的质量用酚-氯仿的方法提取羊水DNA,提取DNA的浓度在44.31ng/μl~160.1ng/μl, A260/280在1.63~1.81之间。3QF-PCR检测结果42例染色体正常CHD胎儿中,40例TBX1与PTBP1基因拷贝数的比值为(0.936±0.310),接近于1;2例胎儿的比值明显降低,为(0.507±0.038),接近于0.5。对照组TBX1与PTBP1基因拷贝数的比值为(0.918±0.306),接近于1。且2例胎儿均与正常人群的比值无交叉重叠。4FISH检测结果QF-PCR检测有缺失的2例胎儿均经FISH验证为阳性,QF-PCR检测结果与FISH结果一致。结论QF-PCR检测结果可靠,可用于产前诊断CHD的胎儿,有助于孕妇选择、孕期管理和遗传咨询,达到优生优育的目的。
冯欣璐[10](2010)在《药物诱导性反转鸡、鹌鹑及其属间杂交种胚胎性别相关基因表达规律的研究》文中提出禽类的胚胎发育过程十分复杂,导致胚胎死亡的因素是多方面的。鸡与鹌鹑属间杂交的早期胚胎发育过程有一个死亡高峰期,至出壳后鉴定个体全部为雄性且完全不育,这些现象用普通意义上的胚胎死亡原因无法解释。本研究主要从形态学上观察鸡与鹌鹑属间杂交种的形态发育差异,通过胚蛋注射的方法对鸡、鹌鹑以及其属间杂交种胚胎进行处理,观察Formestane和17p-estradiol对其性别分化的影响,探讨ER等基因在鸡、鹌鹑以及其属间杂交种胚胎药物处理前后基因表达规律与鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎早期死亡的关系而展开本实验。1鸡、鹌鹑以及其属间杂交种胚胎发育的形态学观察目前关于鸡和鹌鹑胚胎发育形态的研究已有较详细的报道,但对杂交禽胚胎发育形态的实验研究未见报道。本实验以杂交禽、鹌鹑和鸡为实验材料,从其入孵至出雏,取活体胚胎做解剖和拍照,通过解剖显微镜观察其发育特征,进行比较分析,结果表明:杂交禽、鹌鹑以及鸡的胚胎从整体上观察,形态发育差异不大;时间上比较,杂交禽发育进程比鸡的快比鹌鹑慢,并且在9天之前差异较大。2 Formestane和17β-estradiol诱导鸡、鹌鹑胚胎性反转的研究性激素对孵化早期的家禽胚胎性别有很大影响,给止常孵化的鸡、鹌鹑种蛋注射17β-雌二醇和芳香化酶抑制剂,可分别将其性别诱导为雌性和雄性。为了研究验证Formestane和17β-estradiol对鸡和鹌鹑胚胎性分化的影响,本试验根据家禽性别分化的机理,利用100μg/ml的Formestane和50μg/ml的17β-estradiol,通过胚蛋注射的方法对3日龄的鸡胚和2日龄的鹌鹑胚进行处理,观察Formestane和17β-estradiol对鹌鹑性别分化的影响。结果表明,注射Formestane和17β-estradiol的鸡胚和鹌鹑胚都发生了性反转。同时对杂交禽也采取和鹌鹑同样的方法进行处理,但结果显示死亡率很高,出壳率基本为零。据此推测,注射药物引起基因表达紊乱很可能也是杂交种全部死亡的原因之一3ER、3(3-HSD、P450c17和P450arom基因的表达量分析鸟类胚胎的性分化在早期受性激素影响,特别是雌激素在性分化中起着非常重要的作用。而体内雌激素一般是由胆固醇转化产生,这一转化过程需要羟基类固醇脱氢酶(在家禽中主要有3β-HSD及P-450c17等类固醇类基因)和P450arom基因的作用。本实验采集72、96、120、144、168、192h的鸡、鹌鹑和杂交种胚胎各10枚,在胚胎性别鉴定的基础上,运用实时荧光定量PCR方法检测ER、3β-HSD、P450c17和P450arom四个基因的表达量,发现作为ER的调控基因,3β-HSD、P450arom和P-450c17基因的表达在杂交种中都表现出提前表达的趋势,而ER既提前表达,而且其表达的量也表现出与其亲本有较大差异,同时其表达的时间与其胚胎死亡的时间基本吻合,因此可以猜测ER很可能在杂交种胚胎早期死亡中起着较为关键的作用。4凋亡因子bcl-2和p53基因的表达量分析鸡和鹌鹑胚胎发育早期各个时间段bcl-2、P53基因表达模式的研究尚未见报道,本试验采集72、96、120、144、168、192h的鸡、鹌鹑和杂交种胚胎各10枚,在胚胎性别鉴定的基础上,运用实时荧光定量PCR方法检测bcl-2和p53基因的表达量,发现雌性胚胎bcl-2表达高峰点与其P53表达最低水平相吻合;与鸡和鹌鹑胚胎比较,杂交胚胎在72、120 h bcl-2、P53基因表达出现异常,因此可以猜测bcl-2、P53基因异常表达很可能也是引起杂交种胚胎早期死亡的原因之一5性诱导后ER等基因的表达量分析性激素在鸟类早期胚胎的性分化过程中有很大的影响,本试验采用荧光定量PCR方法研究外源激素处理的鸡和鹌鹑胚胎不同时期的ER、3β-HSD、P450c17、P450arom、bcl-2和p53基因表达,发现和正常情况下比较,ER等基因表达出现紊乱,这种情况与外源激素处理的鸡和鹌鹑胚胎死亡率高基本吻合,可以猜测这也可能是引起药物注射后杂交胚胎死亡率高,出壳率基本为零的原因。
二、一种畸形鸡胚染色体核型的研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种畸形鸡胚染色体核型的研究(论文提纲范文)
(1)PGT-A应用于复发性流产伴不孕患者妊娠结局的回顾性研究(论文提纲范文)
缩略语表 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
文献回顾 |
1 RSA概述 |
1.1 女方年龄 |
1.2 夫妻双方染色体核型 |
1.2.1 染色体平衡易位 |
1.2.2 染色体罗伯逊易位 |
1.2.3 染色体倒位 |
1.3 生殖道解剖异常 |
1.4 内分泌因素 |
1.5 血栓前状态 |
1.6 免疫因素 |
1.7 感染等其它相关因素 |
1.8 男方因素 |
1.9 不明原因 |
2 PGT-A概述 |
2.1 胚胎活检技术 |
2.1.1 极体活检 |
2.1.2 卵裂期活检 |
2.1.3 囊胚期活检 |
2.1.4 非侵入性植入前遗传筛查(NIPGS) |
2.2 活检后胚胎冷冻 |
2.3 PGT测序技术的发展 |
2.3.1 荧光原位杂交技术(FISH) |
2.3.2 微阵列比较基因组杂交技术(a CGH) |
2.3.3 单核苷酸多态性分析微阵列(SNP array) |
2.3.4 二代测序技术(NGS) |
3 PGT-A在复发性流产患者中的应用 |
3.1 复发性流产患者使用PGT-A适应证 |
3.2 复发性流产患者行PGT-A助孕的流程 |
3.2.1 充分评估和知情同意书的签署 |
3.2.2 超促排卵以及胚胎活检 |
3.2.3 高通量测序和获取染色体检测结果报告 |
4 复发性流产患者进行PGT-A的争议 |
4.1 赞同方 |
4.1.1 PGT-A提高了RSA患者的妊娠率和单胚胎移植率 |
4.1.2 高龄女性可从PGT-A中受益 |
4.1.3 使用PGT-A节省治疗成本 |
4.1.4 减少异常胚胎的冻存 |
4.2 反对方 |
4.2.1 PGT活检中嵌合体胚胎的存在可能影响结果的准确性 |
4.2.2 活检对胚胎的损伤 |
4.2.3 PGT-A治疗周期长 |
4.2.4 卵巢储备功能低下患者无整倍体胚胎移植可能性增加 |
4.2.5 染色体异常的胚胎早期发育终止 |
1 资料与方法 |
1.1 研究对象与分组 |
2 方法 |
2.1 卵母细胞和精子获取 |
2.2 常规IVF和 ICSI授精 |
2.3 胚胎观察 |
2.4 囊胚评级和活检 |
2.5 PGT-A检测 |
2.6 胚胎移植 |
2.7 评价指标 |
2.8 统计学方法 |
2.9 流程图 |
3 结果 |
3.1 两组基线数据统计学分析 |
3.2 控制性超促排卵及实验室胚胎发育情况统计学分析 |
3.3 PGT-A组胚胎染色体非整倍体检测结果 |
3.4 两组患者临床妊娠结局对比 |
4 讨论 |
小结 |
参考文献 |
个人简历和研究成果 |
致谢 |
(2)基于诱导多能干细胞模型研究法洛四联症的转录调控机制(论文提纲范文)
缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
第一部分: 法洛四联症患者及健康对照iPSCs细胞系的建立 |
前言 |
材料与方法 |
1. 研究对象 |
2. 主要的实验试剂及仪器 |
3. 主要的实验方法 |
结果 |
1. 研究对象基本信息及超声检查情况 |
2. 皮肤成纤维细胞的分离培养及鉴定 |
3. 诱导多能干细胞的建立及鉴定 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第二部分: 法洛四联症及健康对照iPSCs向心肌细胞分化研究及其功能分析 |
前言 |
材料与方法 |
1. 主要的实验试剂及仪器 |
2. 主要的实验方法 |
结果 |
1. iPSCs向心肌细胞的定向分化 |
2. iPSCs向中胚层分化效率检测 |
3. iPSCs向心肌细胞诱导分化后的纯化及鉴定 |
4. iPSCs诱导分化后的心肌细胞功能检测 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第三部分: 法洛四联症及健康对照来源iPSC-CM细胞转录组学研究及关键差异基因功能分析 |
前言 |
材料与方法 |
1. 研究样本准备 |
2. 主要的试剂和仪器 |
3. 数据库 |
4. 主要的实验方法 |
结果 |
1. TOF及健康对照iPSC-CM转录组测序分析 |
2. 差异表达基因的生物信息学分析 |
3. 关键差异表达基因的验证分析 |
4. 关键差异表达基因BMP10的功能分析 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
全文总结 |
附录 知情同意书 |
综述 诱导多能干细胞在遗传性心脏疾病中的研究进展 |
参考文献 |
攻读学位期间获得的学术成果 |
致谢 |
(3)1例16p11.2微重复综合征的产前诊断及遗传学分析(论文提纲范文)
1 资料与方法 |
1.1 一般资料 |
1.2 方法 |
1.2.1 羊水细胞染色体核型分析 |
1.2.2 基因组DNA提取 |
1.2.3 aCGH分析 |
2 结 果 |
2.1 羊水细胞染色体核型分析结果 |
2.2 aCGH分析结果 |
2.3 随访结果 |
3 讨 论 |
(4)基于患者特异iPSC的先天性心脏病模型建立和机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
1 引言 |
1.1 先天性心脏病的现状及分类概述 |
1.2 心脏发育与先天性心脏病 |
1.2.1 心脏的发育过程 |
1.2.2 心脏发育调控机制与疾病 |
1.2.3 GATA4与先天性心脏病 |
1.3 iPSC与心血管疾病模型 |
1.3.1 人多能干细胞研究进展 |
1.3.2 iPSC在心血管疾病模型中的应用 |
1.3.3 基因编辑干细胞与心血管疾病模型研究 |
1.4 研究目的和意义 |
2 实验材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 主要实验试剂 |
2.1.2 主要实验仪器 |
2.1.3 实验所用抗体信息 |
2.1.4 实时荧光定量PCR引物 |
2.1.5 基因编辑相关引物 |
2.1.6 其他相关引物 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 尿液细胞的收集 |
2.2.2 尿液细胞重编程 |
2.2.3 人多能干细胞的培养 |
2.2.4 心肌细胞定向分化及纯化 |
2.2.5 心肌细胞钙瞬变 |
2.2.6 拟胚体形成实验 |
2.2.7 畸胎瘤形成实验 |
2.2.8 苏木精-伊红染色 |
2.2.9 小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 |
2.2.10 细胞免疫荧光 |
2.2.11 碱性磷酸酶染色 |
2.2.12 染色体核型分析 |
2.2.13 Gibson重组 |
2.2.14 荧光素酶活性分析 |
2.2.15 Taq普通PCR |
2.2.16 KOD高保真PCR |
2.2.17 细胞基因组DNA的提取 |
2.2.18 细胞总RNA的提取 |
2.2.19 cDNA的合成 |
2.2.20 实时荧光定量PCR |
2.2.21 ChIP-qPCR |
2.2.22 细胞蛋白的提取 |
2.2.23 蛋白质印迹 |
2.2.24 细胞转染 |
2.2.25 PCR定点突变 |
2.2.26 琼脂糖凝胶回收DNA |
2.2.27 载体构建基本过程 |
2.2.28 大肠杆菌的转化 |
2.2.29 质粒的制备 |
2.2.30 慢病毒的包装 |
2.2.31 染色质免疫共沉淀 |
2.2.32 流式细胞术检测细胞增殖 |
2.2.33 细胞活力测定(CCK8法) |
2.2.34 RNA-Seq生物信息分析基本过程 |
2.2.35 ChIP-Seq生物信息分析基本过程 |
2.2.36 数据分析 |
3 实验结果 |
3.1 GATA4~(T280M)细胞模型的建立 |
3.1.1 先天性心脏病患者特异的iPSC-GATA4~(T280M)建立 |
3.1.2 基因编辑的ESC-GATA4~(T280M)建立 |
3.2 先天性心脏病致病位点GATA4~(T280M)的功能研究 |
3.2.1 GATA4~(T280M)对干细胞自我更新的影响 |
3.2.2 GATA4~(T280M)对干细胞分化潜能的影响 |
3.2.3 GATA4~(T280M)对心肌细胞增殖的影响 |
3.3 先天性心脏病致病位点GATA4~(T280M)的致病机制研究 |
3.3.1 GATA4~(T280M)突变位点的生物信息学分析 |
3.3.2 GATA4蛋白的结构及保守性分析 |
3.3.3 GATA4~(T280M)蛋白质的细胞定位分析 |
3.3.4 GATA4~(T280M)蛋白质对下游基因转录活性的分析 |
3.3.5 GATA4~(WT)和GATA4~(T280M)蛋白质DNA结合能力的高通量分析 |
3.3.6 GATA4~(WT)和GATA4~(T280M)蛋白质转录组的高通量分析 |
3.3.7 GATA4~(WT)和GATA4~(T280M)蛋白质DNA结合和转录组的联合分析 |
3.3.8 GATA4-FGF16调控通路的分析 |
4 讨论 |
4.1 先天性心脏病疾病模型的研究与应用 |
4.2 GATA4-FGF16信号通路在心脏中的作用 |
4.3 先天性心脏病的早期诊断 |
5 结论 |
参考文献 |
附录 |
攻读博士期间主要科研成果 |
致谢 |
(5)人胚胎二倍体细胞株Walvax-2的建立、检定及应用(论文提纲范文)
论文创新点 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
第一章 引言 |
1.1 人胚胎发育生物学 |
1.1.1 胚胎的发育过程 |
1.1.1.1 生殖细胞和受精 |
1.1.1.2 卵裂和胚泡的形成 |
1.1.1.3 植入和胚层的形成 |
1.1.1.4 胚体的形成和胚层的分化 |
1.1.1.5 胎儿的发育 |
1.1.2 人胚胎二倍体细胞胚胎获取要求 |
1.1.2.1 米非司酮的作用 |
1.1.2.2 米非司酮对胎儿发育的影响 |
1.1.2.2.1 米非司酮对输卵管阶段胚胎生长发育的影响 |
1.1.2.2.2 米非司酮对早期胚胎在子宫阶段生长发育的影响 |
1.2 人胚胎二倍体细胞的研究 |
1.2.1 人胚胎二倍体细胞的体外培养研究 |
1.2.1.1 人胚胎二倍体原代细胞的制备 |
1.2.1.2 人胚胎二倍体细胞的培养 |
1.2.1.3 人胚胎二倍体细胞的冻存及复苏 |
1.2.1.4 人胚胎二倍体细胞体外培养的生物学特性 |
1.2.2 人胚胎二倍体细胞建立细胞贮存库的研究 |
1.2.2.1 WI-38二倍体细胞 |
1.2.2.2 MRC-5二倍体细胞 |
1.2.2.3 KMB-17二倍体细胞 |
1.2.2.4 2BS二倍体细胞 |
1.2.3 人胚胎二倍体细胞的质量控制研究 |
1.2.3.1 人胚胎二倍体细胞的历史来源 |
1.2.3.2 人胚胎二倍体细胞体外培养原材料的控制 |
1.2.3.3 人胚胎二倍体细胞库的检测标准 |
1.2.3.3.1 细胞鉴别 |
1.2.3.3.2 外源因子污染检测 |
1.2.3.3.3 细胞致瘤性检查 |
1.2.3.4 人胚胎二倍体细胞的安全性研究 |
1.3 人胚胎二倍体细胞的应用 |
1.3.1 病毒及疫苗学研究 |
1.3.2 老年学研究 |
1.3.3 其他生命医学领域 |
1.4 本研究的目的及意义 |
第二章 人胚胎二倍体细胞株的建立及检定 |
摘要 |
2.0 引言 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 材料 |
2.1.1.1 胚胎 |
2.1.1.2 细胞系 |
2.1.1.3 菌种 |
2.1.1.4 主要培养基、溶液及试剂 |
2.1.1.5 主要仪器及软件 |
2.1.1.6 器材 |
2.2 方法 |
2.2.2.1 原代细胞培养 |
2.2.2.2 细胞传代 |
2.2.2.3 细胞冻存 |
2.2.2.4 细胞复苏 |
2.2.2.5 细胞生命线传代 |
2.2.2.6 生长曲线测定 |
2.2.2.7 人胚胎二倍体细胞株检定 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 人胚胎的基本信息 |
2.3.2 Walvax-2细胞株的生命线传代结果 |
2.3.3 Walvax-2细胞株生长曲线测定 |
2.3.4 Walvax-2细胞株检定 |
2.3.4.1 无菌检查结果 |
2.3.4.2 细胞鉴别结果 |
2.3.4.3 支原体检查结果 |
2.3.4.4 细胞内、外源病毒因子检查结果 |
2.3.4.5 逆转录病毒检查结果 |
2.3.4.6 特殊外源病毒检测结果 |
2.3.4.7 细胞株成瘤性试验结果 |
2.3.4.8 Walvax-2细胞株的染色体检查结果 |
2.4 讨论 |
小结和创新点 |
第三章 病毒对WALVAX-2细胞的初步适应研究 |
摘要 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 材料 |
3.2.1.1 细胞 |
3.2.1.2 毒株 |
3.2.1.3 主要培养基、溶液及试剂 |
3.2.1.4 主要仪器及实验器材 |
3.2.1.5 主要实验器材 |
3.2.2 方法 |
3.2.2.1 细胞传代方法 |
3.2.2.2 狂犬病毒传代及检测 |
3.2.2.3 水痘病毒传代及检测 |
3.2.2.4 甲肝病毒传代及检测 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 狂犬病毒毒株传代滴度检测结果 |
3.3.2 水痘病毒毒株传代滴度检测结果 |
3.3.3 甲肝病毒毒株传代滴度检测结果 |
3.4 讨论 |
小结和创新点 |
参考文献 |
在校期间发表及待发表的文章 |
致谢 |
(6)DF-DF-1细胞的保存期试验及致瘤性鉴定(论文提纲范文)
1材料与方法 |
1.1材料 |
1.1.1试剂 |
1.1.2细胞及病毒 |
1.1.3试验动物 |
1.2方法 |
1.2.1 DF-1细胞库的建立 |
1.2.2细胞生长特性 |
1.2.3 DF-1细胞对IBDV的敏感性 |
1.2.4细胞染色体的制备及核型分析 |
1.2.5致瘤性检测 |
2结果 |
2.1细胞生长特性 |
2.2病毒繁殖及含量测定 |
2.3染色体的制备及核型分析 |
2.4致瘤性检测 |
3讨论 |
(7)鸡、鹌鹑及其杂交种胚胎性分化相关基因的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
本文部分缩写的中英文对照 |
引言 |
第一章 文献综述 |
第一节 鸡与鹌鹑远缘杂交研究现状 |
第二节 家禽的性别分化及鉴定 |
1 鸡的性别决定理论 |
1.1 性染色体决定学说 |
1.2 常染色体平衡学说 |
1.3 胚胎性别分化的激素学说 |
2 家禽的性别分化 |
3 家禽的性别鉴定 |
3.1 家禽性别鉴定方法 |
3.2 家禽分子水平上的性别鉴定 |
4 家禽性别鉴定的意义 |
第三节 类固醇激素转化路径中相关基因的研究进展 |
1 P450_(SCC) |
2 3β-HSD |
3 P450_(C17) |
4 17β-HSD |
5 AROMATASE(P450_(AROMATASE): P450_(AROM)) |
5.1 芳香化酶的特性 |
5.2 芳香化酶的功能 |
5.3 芳香化酶在鸡上的研究进展 |
第四节 CL-2、P53基因研究进展 |
1 BCL-2 基因 |
2 P_(53)基因 |
3 BCL-2 与 P_(53)的相互作用 |
第五节 禽类性激素、ER 对胚胎发育和性分化的研究进展 |
1 禽类性激素对胚胎发育和性分化的相关研究 |
1.1 禽类胚胎中性激素相关研究 |
1.2 外源激素对胚胎发育和性别分化的影响 |
1.3 胚胎中雌、雄激素含量的测定 |
2. 雌激素受体对胚胎发育和性分化的研究进展 |
2.1 雌激素受体生物学研究 |
2.2 禽类 ER 对胚胎发育和性分化的影响 |
3 实时荧光定量 RT-PCR 技术 |
3.1 实时荧光定量 RT-PCR 基本原理 |
3.2 RT-PCR 在家禽上的研究进展 |
3.3 荧光定量 PCR 技术的展望 |
第二章 实验部分 |
实验一 提高公鸡与母鹌鹑杂交早期胚胎受精率和存活率的研究 |
1. 材料和方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
1.3 统计分析 |
2. 结果分析 |
2.1 鸡(?)与鹌鹑(?)杂交人工授精间隔时间不同对杂交早期胚胎受精和存活的影响 |
2.2 不同的输精次数对杂交早期胚胎受精和存活的影响 |
2.3 不同孵化机对杂交早期胚胎受精和存活的影响 |
2.4 输精部位不同对杂交早期胚胎的受精率和胚胎存活的影响 |
3. 讨论 |
3.1 输精间隔时间对杂交早期胚胎受精和存活的影响 |
3.2 鸡与鹌鹑的孵化条件对杂交胚胎的受精率和存活率的影响 |
3.3 孵化机的不同对胚胎发育的影响 |
3.4 输精量、输精时间、输精次数和输精部位对杂交胚胎的受精率和存活率的影响 |
3.5 日常管理对鸡精液品质的影响 |
4. 小结 |
实验二 鹌鹑早期胚胎生成过程中性别分化相关基因的表达分析 |
1. 材料和方法 |
1.1 实验动物 |
1.2 试验方法 |
2. 结果与分析 |
2.1 多重 PCR 鉴定早期胚胎性别 |
2.2 鹌鹑早期胚胎形成过程中性别分化相关基因的表达 |
3. 讨论 |
4. 小结 |
实验三 ER 及其相关基因在鸡性反转胚胎中的表达 |
1. 材料与方法 |
1.1 试验时间、地点 |
1.2 试验材料 |
1.3 试验方法 |
2. 结果与分析 |
2.1 Formestane 和 17β-E2注射后鸡胚 ER 基因表达分析 |
2.2 3β-HSD 基因表达分析 |
2.3 P450c17 基因表达分析 |
2.4 P450arom 基因表达分析 |
3. 讨论 |
4. 小结 |
实验四 鸡(?)与鹌鹑(?)杂交种早期胚胎 ER 等相关基因的表达分析 |
1.材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 实验方法 |
2.结果与分析 |
2.1 杂交胚胎样品中总 RNA 质量 |
2.2 多重 PCR 鉴定早期胚胎性别 |
2.3 熔解曲线分析结果 |
2.4 扩增曲线分析结果 |
2.5 标准曲线分析结果 |
2.6 ER 相关基因表达分析 |
3. 讨论 |
3.1 3β-HSD 基因在不同性别杂交胚胎发育早期的表达 |
3.2 P450c17 基因在不同性别杂交胚胎发育早期的表达 |
3.3 P450arom 基因在不同性别杂交胚胎发育早期的表达 |
3.4 ER 基因在不同性别杂交胚胎发育早期的表达 |
4. 小结 |
实验五 鸡、鹌鹑及其杂交种胚胎雌二醇和睾酮含量的变化规律研究 |
1. 实验材料和方法 |
1.1 胚胎样品 |
1.2 仪器设备 |
1.3 试剂和药品 |
1.4 胚胎样品的采集和制备处理 |
1.5 测定方法 |
1.6 统计分析 |
2. 结果与分析 |
2.1 鸡、鹌鹑及其杂交种发育不同时间点胚胎重量变化 |
2.2 鸡、鹌鹑及其杂交种早期发育胚胎中睾酮含量变化 |
2.3 鸡、鹌鹑及其杂交种早期发育胚胎中雌二醇含量的变化检测结果 |
3. 讨论 |
3.1 鸡、鹌鹑及其杂交种早期胚胎的重量变化 |
3.2 鸡、鹌鹑及其杂交种发育不同时间点胚胎中雌二醇含量的变化 |
3.3 鸡、鹌鹑及其杂交种发育不同时间点胚胎中睾酮含量的变化 |
3.4 鸡、鹌鹑及其杂交种胚胎发育早期测定激素样品的处理 |
4.小结 |
全文总结 |
创新点 |
参考文献 |
简历 |
致谢 |
导师评阅表 |
(8)肺动脉闭锁遗传学初步研究(论文提纲范文)
目录 |
缩略词 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
参考文献 |
第一部分:肺动脉闭锁染色体核型分析 |
对象与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
附表图 |
第二部分:肺动脉闭锁TBX1微缺失研究 |
对象与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
附表图 |
第三部分:全外显子测序初步筛选右室流出道梗阻易感基因 |
对象与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
附表图 |
结论、创新与展望 |
综述 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
(9)QF-PCR检测22q11.2微缺失方法建立及产前诊断应用研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
缩略语 |
前言 |
研究现状、成果 |
研究目的、方法 |
一、QF-PCR检测先心病22q11.2微缺失方法的建立 |
1 染色体培养及核型分析 |
1.1 研究对象 |
1.2 研究方法 |
1.2.1 实验试剂及仪器 |
1.2.2 实验方法 |
2 QF-PCR方法检测 |
2.1 研究对象 |
2.2 研究方法 |
2.2.1 实验试剂及仪器 |
2.2.2 实验方法 |
3 突光原位杂交技术 |
3.1 研究对象 |
3.2 研究方法 |
3.2.1 实验试剂及仪器 |
3.2.2 实验方法 |
4 结果 |
4.1 核型分析结果 |
4.2 DNA提取的质量 |
4.3 QF-PCR结果 |
4.4 FISH结果 |
4.5 QF-PCR结果与FISH结果对比 |
4.6 22q11.2微缺失在实验组和对照组的比较 |
5 小结 |
二、QF-PCR检测22q11.2微缺失在产前诊断应用研究 |
1 染色体培养及核型分析 |
1.1 研究对象 |
1.2 研究方法 |
1.2.1 实验试剂及仪器 |
1.2.2 实验方法 |
2 QF-PCR方法检测 |
2.1 研究对象 |
2.2 研究方法 |
2.2.1 实验试剂及仪器 |
2.2.2 实验方法 |
3 焚光原位杂交技术 |
3.1 研究对象 |
3.2 研究方法 |
3.2.1 实验试剂及仪器 |
3.2.2 实验方法 |
4 结果 |
4.1 核型分析结果 |
4.2 DNA提取的质量 |
4.3 QF-PCR结果 |
4.4 FISH结果 |
5 小结 |
讨论 |
1 染色体核型异常与CHD |
2 22q11.2微缺失与CHD的关系 |
3 QF-PCR检测的准确性与特异性 |
4 QF-PCR用于产前诊断的可行性 |
结论 |
参考文献 |
发表论文和参加科研情况说明 |
综述 先天性心脏畸形22q11.2微缺失研究 |
综述参考文献 |
致谢 |
(10)药物诱导性反转鸡、鹌鹑及其属间杂交种胚胎性别相关基因表达规律的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
目录 |
本文部分缩写的中英文对照 |
前言 |
第一章 文献综述 |
1 鸡与鹌鹑属间杂交种的研究进展 |
2 家禽胚胎的形态学的研究进展 |
3 家禽的性别控制的研究进展 |
4 雌激素受体及相关基因的研究进展 |
5 凋亡因子bcl-2、P53的研究进展 |
6 基因表达量分析研究背景及现状 |
第二章 杂交禽、鹌鹑与鸡胚胎发育的形态学观察 |
1 材料及方法 |
2 结果与分析 |
3 讨论与小结 |
第三章 Formestane和17β-estradiol诱导鸡、鹌鹑胚胎性反转的研究 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
3 讨论与小结 |
第四章 ER等基因的表达量分析 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
3 讨论与小结 |
第五章 凋亡因子bcl-2和p53基因的表达量分析 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
3 讨论与小结 |
第六章 性诱导后ER等基因的表达量分析 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
3 讨论与小结 |
全文结论 |
创新 |
参考文献 |
作者简介 |
致谢 |
导师评阅表 |
四、一种畸形鸡胚染色体核型的研究(论文参考文献)
- [1]PGT-A应用于复发性流产伴不孕患者妊娠结局的回顾性研究[D]. 戴旭. 西安医学院, 2020(08)
- [2]基于诱导多能干细胞模型研究法洛四联症的转录调控机制[D]. 韩燊. 昆明医科大学, 2020(02)
- [3]1例16p11.2微重复综合征的产前诊断及遗传学分析[J]. 王圣然,吴东,王涛,霍晓东,高越,张梦汀,廖世秀. 中华实用诊断与治疗杂志, 2019(06)
- [4]基于患者特异iPSC的先天性心脏病模型建立和机制研究[D]. 虞游. 苏州大学, 2019(06)
- [5]人胚胎二倍体细胞株Walvax-2的建立、检定及应用[D]. 马波. 武汉大学, 2015(07)
- [6]DF-DF-1细胞的保存期试验及致瘤性鉴定[J]. 毕志香,李鹏成,揭鸿英,朱亚露,何家惠,陈瑾,褚轩,于漾,侯继波. 中国家禽, 2015(03)
- [7]鸡、鹌鹑及其杂交种胚胎性分化相关基因的研究[D]. 刘贤侠. 石河子大学, 2013(03)
- [8]肺动脉闭锁遗传学初步研究[D]. 龚立. 华中科技大学, 2013(02)
- [9]QF-PCR检测22q11.2微缺失方法建立及产前诊断应用研究[D]. 田卉. 天津医科大学, 2013(02)
- [10]药物诱导性反转鸡、鹌鹑及其属间杂交种胚胎性别相关基因表达规律的研究[D]. 冯欣璐. 石河子大学, 2010(02)