一、丙型肝炎病毒干扰素敏感决定区基因“盒”的研究（论文文献综述）
刘丽莉[1]（2020）在《住院病人丙型肝炎病毒感染的筛查及快速筛查方法的评价》文中研究说明丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）因其人群普遍易感性呈全球性流行构成了严重的公共卫生问题。目前,全球约有7,100万HCV感染者,但80%的患者对自身感染不知情。丙型肝炎相关死亡病例逐年增加,带来巨大的经济和社会负担。2016年,WHO提出了彻底消除HCV感染的战略目标。因此,发现和治疗潜在的已感染HCV人群,简化HCV筛查手段,快速提高丙肝诊断率,成为实现目标的必经之路。一方面,我国医院对拟进行手术或侵入性医疗操作的住院病人常规筛查HCV,但缺乏进一步确诊和治疗,对实际筛查情况的认识也不充分。另一方面,基于实验室检测的普遍丙肝筛查难以实现。为快速提高丙肝诊断率和筛查率,充分掌握和利用医院已有的筛查数据,同时开发快速、便捷且成本低的HCV筛查工具必不可少。基于上述原因,本课题针对丙肝病毒感染筛查的策略与方法展开以下两部分研究。第一部分:目的:了解我国不同地区住院患者的HCV筛查情况,并提出更有价值的HCV筛查策略。方法:我们进行了一项包含全国不同地区8家三级甲等医院的多中心研究。收集2016年1月至2016年12月全国不同地区8家三级甲等医院的住院患者信息和HCV筛查结果,计算总体筛查率,比较不同地区、不同年龄组的非肝病相关科室住院患者HCV阳性率。进而推算在现行政策下每年接受筛查的人数及可检测出的HCV抗体阳性患者的数量。制定更好的HCV筛查和管理策略。结果:2016年8个中心的总住院患者850,379人,其中HCV筛查人数为512,938,最终有467,008例（51.20%为男性）非肝病相关科患者纳入研究,非肝病相关科室HCV筛查率大于50%。HCV抗体阳性患者4,129例,总体HCV抗体阳性率为0.88%（95%置信区间[confidence interval,CI],0.85%–0.91%）,男性总体HCV抗体阳性率为0.91%,高于女性的0.85%,差异具有统计学意义。不同年龄组HCV抗体阳性率随着年龄增长而增加,相反,年龄越小,HCV抗体阳性率越低,证实了近年来我国政府针对HCV筛查和防控所做相关努力的积极影响和效果。值得注意的是,40岁以上人群占HCV抗体阳性患者的90.14%（3,722/4,129）,其中,6064岁年龄组阳性率最高。儿科患者HCV抗体阳性率最低为0.13%（95%CI,0.06%–0.20%）,肿瘤科患者HCV抗体阳性率最高,达1.80%（95%CI,1.36%–2.24%）。根据我国卫生和计划生育统计年鉴数据,2016年全国医院总住院患者为1.75亿人次,如果各医院同样能达到50%的筛查率,推算2016年在医院接受丙肝筛查的人数为8,750万人,进一步按照我们的阳性率推算可发现约77万非肝病科丙肝抗体阳性患者。最后,我们提出一种基于加强HCV筛查后管理的建议。结论:八家三级甲等医院住院人群HCV筛查率高达50%以上,加强对已筛查人群的管理,可发现更多的丙肝病毒的感染者,有效提高丙肝诊断率及治疗率。建议有关部门制定对住院患者检查结果充分利用的相关政策,有助于找到中国的千百万已感染患者,加快消除丙肝的步伐。第二部分:目的:HCV快速检测方法的评价性研究,对丙型肝炎病毒抗体口腔分泌物检测试剂进行首次临床效能评价。明确其应用于筛查HCV中的潜在价值,进一步推动清除HCV进程。方法:在不同地区的三家医院进行多中心研究,通过与已有的实验室检测方法对比,评估维尔试剂的敏感性和特异性。应用江苏维尔试剂对所有受试者进行口腔分泌物HCV抗体检测,并应用现有的血清HCV抗体检测试剂（雅培ARCHITECT丙肝抗体检测试剂及英科新创丙肝抗体检测试剂）进行血清HCV抗体检测。对于维尔试剂及雅培试剂结果为阳性的样本,通过HCV RNA检测进一步验证。此外,根据受试者意愿,一部分患者也接受了美国Ora Quick快速丙肝病毒检测试剂的检测及维尔试剂的自采自测。结果:共纳入1,179名受试者,其中慢性丙肝感染者486例,其他非丙肝感染的肝病患者108例,体检人群585例。以雅培血清HCV抗体检测试剂为参考依据,Well口腔分泌物HCV抗体检测试剂（考核试剂）的敏感性为91.88%（95%CI,88.97%–94.09%）,特异性为98.00%（95%CI,96.58%–98.86%）。考核试剂与英科新创生物科技公司的HCV抗体检测试剂的一致性为97.02%（1,138/1,179）。考核试剂与Ora Quick试剂的一致性为98.50%（197/200）。此外,受试者应用考核试剂自我检测结果与研究人员的检测结果高度一致（Kappa=0.979）。HCV RNA检测结果还表明,在39例考核试剂出现假阴性的样本中,仅1例检测到HCV RNA阳性,同时在172例HCV RNA阳性病例中,考核试剂可检测到171例为阳性。结论:口腔分泌物HCV抗体检测试剂具有较高的敏感性和特异性,其诊断能力能够满足HCV筛查需求。该试剂检测快速,无创,不需要仪器,成本低,且易于操作,特别适合用于社区及家庭医疗中的HCV筛查。有望未来用于HCV的全面筛查,识别已感染人群,尽早实现消除HCV的目标。
郭明哲[2]（2019）在《丙型肝炎病毒复制子新型构建方法的建立及基因3a、6a型病毒株耐药性的研究》文中研究指明HCV（Hepatitis C virus,HCV）丙型肝炎病毒是属于黄病毒科、丙型肝炎病毒属的单股正链RNA病毒。HCV在全球总人口的大约百分之一中以慢性感染的形式存在,因此HCV感染一直以来是一个沉重的社会负担。近年来直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral agents,DAA）的出现使得HCV病人的治疗得到极大的改观。但临床资料显示DAA的耐药突变的产生仍是一个严峻的问题。绝大多数HCV病人样品中的HCV病毒无法在体外的肝癌细胞系中建立高效的感染,该现象的分子机制仍未被完全阐明。第一个高效的HCV体外感染模型在2005年由三个实验室同时创建并都依赖了JFH1（Japanese fulminant hepatitis1）共有序列。但迄今为止,JFH1共有序列是唯一一个不需要任何额外改变就能在肝癌细胞系中建立高效感染的HCV序列。由于共有序列无法反映出体内复制HCV序列的真实状态,因此我们拟通过筛选HCV病人血清中准种序列的方法来提高获得具有复制能力序列的可能性。为此我们建立了一种高效的构建HCV复制子cDNA文库的方法,并在稳定表达Sec14L2的Huh7.5.1细胞系中测试了多种基因型HCV复制子cDNA文库的集落形成能力。通过上述的功能筛选策略,我们成功地获得了基因1b,3a,6a型的HCV复制子克隆细胞,而且我们所获得的亚克隆HCV复制子cDNA都有较强的复制能力。后续的序列分析表明每个复制子细胞克隆中都含有不同数量的来自于准种序列的突变,因此我们的实验结果证明来自于准种序列的多样性可以帮助HCV病毒株在肝癌细胞系中复制。使用DAA疗法的基因3型病人的SVR（Sustained virological response）显着低于其他基因型。这个临床现象中比较重要的一个原因是基因3型HCV拥有天然的NS3 DAA耐药性。我们通过基因3a型复制子PR87A7研究了基因3型NS3168Q所介导的NS3 DAA耐药性。并且通过在基因2型的JFH1复制子中引入NS3 168Q及相关位点研究了NS3 168Q稳定存在的分子机制。我们发现NS3168Q的稳定存在需要NS3蛋白酶中其他残基的帮助,其中包括123T。研究显示索磷布韦耐药位点NS5B S282T可以在基因6型病人的基线序列中以较高的频率出现,因此基因6型HCV病毒株中产生索磷布韦耐药突变的壁垒可能低于其他基因型的HCV毒株。为了证明我们的假设,我们研究了基因6a型复制子PR58C4针对索磷布韦的耐药特性,结果显示PR58C4产生NS5B S282T的分子壁垒显着低于基因1b型的Con1复制子。NS5B S282T的产生导致了PR58C4对索磷布韦处理的敏感型的降低,并且NS5B K535R与NS5B S282T的同时存在可能提高了后者的耐药表型。综上所述,我们的研究建立了一种可以用于多种基因型HCV病人样本的复制子构建方法。基因1b型PR50,基因3a型PR87,基因6a型PR58复制子克隆的成功建立证明了我们上述功能筛选策略的通用性及有效性。在基因3a型PR87的耐药研究中,我们的结果对理解HCV耐药突变的产生与病毒复制能力维持之间的平衡提供了新的思路。在基因6a型PR58的索磷布韦耐药研究中,我们发现其产生NS5B S282T耐药突变的分子壁垒较低,同时发现了一个可以提高S282T耐药能力的突变K535R,这对理解临床中复杂耐药性的产生有重要意义。
阳光[3]（2019）在《丙型肝炎病毒NS5B区基因耐药多态性研究》文中认为目的:分析中国广西地区丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）不同基因型NS5B区耐药基因相关变异（resistance associated variants,RAVs）发生率及不同性别间的差异。方法:收集广西医科大学第一附属医院感染科门诊诊治的135例感染HCV的初治患者为研究对象。抽取患者基线时血清样本,抽取2例直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral agents,DAAs）治疗后未获得持续性病毒学应答（Sustained virological response,SVR）患者的血清样本,从患者血清中提取HCV RNA,设计并合成HCV NS5B区的特异性引物进行巢式PCR扩增,对未获得SVR的2例患者同时扩增HS5A区片段,所得产物外送上海生工生物有限公司进行NS5B区基因测序,将测序结果与基因库标准株进行比对,分析耐药突变情况,比较未获得SVR患者治疗前后SVR情况。对不同性别间患者的年龄、HCV RNA、ALT和AST采用两独立样本t检验,不同性别患者间的耐药位点变异率采用单因素方差分析,分类资料采用卡方检验,计量资料用均数±标准差表示,计数资料采用百分率表示,P<0.05为差异有统计学意义。结果:（1）入选的135例患者中126例获得完整的NS5B区序列信息,慢性丙型肝炎103例,丙肝肝硬化患者23例,其中GT1b型患者55例,GT3a型患者13例,GT3b型患者20例,GT6a型患者38例。（2）126例扩增成功的患者NS5B区RAVs发生率为46%（58/126）,其中单位点突变率为15.1%（19/126）,多位点联合突变率为30.9%（39/126）。（3）GT 1b型55例患者NS5B区RAVs发生率为96.4%（53/55）,其中C316为94.5%（52/55）、A338为70.9%（49/55）及T19为74.5%（41/55）为主要的变异位点,同时检测到C316+T19、C316+T19+A338等多位点联合突变;GT 3a型患者并未检测到RAVs位点;GT 3b型20例患者NS5B区RAVs发生率为10%（2/20）,A421V为检测到的变异位点;GT 6a型38例患者NS5B区RAVs发生率为7.9%（3/38）,V494A为检测到的变异位点。（6）各基因型突变率两两比较结果:GT1型和GT3型的突变率比较（96.4%VS6.1%）,P<0.05,差异有统计学意义;GT1型和GT6型的突变率比较（96.4%VS7.9%）,P<0.05,差异有统计学意义;GT3型和GT6型的突变率比较（6.1%VS7.9%）,P>0.05,差异无统计学意义。（7）不同性别间患者在年龄、HCVRNA、AST和ALT方面的差异均无统计学意义（均P>0.05）;男性RAVs发生率为60.6%（40/66）,女性为58.3%（35/60）,比较差异无统计学意义（P>0.05）。（8）慢性丙型肝炎伴肝硬化患者RAVs为78.3%（18/23）,高于慢性丙型肝炎患者的55.3%（57/103）,P<0.05,差异有统计学意义。结论:广西地区初治型慢性丙型肝炎患者存在较高的NS5B区RAVs发生率,既有单位点突变,也存在两位点联合突变,甚至在GT1b型患者中出现多位点联合突变。GT1b型患者主要的耐药突变位点为C316N、A338V和V321I;GT3a型在本研究中未检测到耐药位点的发生;GT3b型主要耐药突变位点为E237G;GT6a型主要耐药突变位点为V494A:多位点联合突变主要发生在GT1b型患者中,C316N+T19S、C316N+V321I和C316N+T19S+A338V;慢性丙型肝炎伴肝硬化患者RAVs发生率高于慢性丙型肝炎患者;不同性别间基线处RAVs并无明显差别。
王俊洁[4]（2015）在《宿主MDR1多态性及HCV基因组变异对慢性丙型肝炎抗病毒治疗复发的影响》文中认为研究背景和目的丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）主要经血液途径传播,感染HCV后,50%-80%将进展为慢性状态,其中20%-30%的患者将发展为肝硬化或肝癌。据世界卫生组织（WHO）统计目前全球有接近1.8亿人感染HCV。我国抗-HCV阳性率在不同地区有较大差异,2006年以营养调查人群剩余血清进行的研究显示,在1-59岁的一般人群中抗-HCV阳性率约为0.43%（不包括特殊人群和高发地区的研究）。遗憾的是,目前还没有针对丙型肝炎有效的预防性疫苗,预防HCV传播的主要措施还依赖于安全输血和侵袭性操作。HCV感染后症状隐匿,又有相当一部分患者的ALT在正常范围内或仅有轻度升高而未引起重视,等到就诊时已是肝硬化,甚至是失代偿肝病,失去了最佳治疗时机。在未来二十年内,丙肝相关终末期肝病患者的数量将持续增长,会成为世界性的医学、社会难题和经济负担。目前公认的慢性丙型肝炎（Chronic hepatitis C,CHC）标准治疗方案（Standard of care,SOC）是聚乙二醇干扰素（Peg-IFN α）联合利巴韦林（ribavirin,RBV）抗病毒治疗,基因型不同,抗病毒治疗药物方案、疗程不同,且抗病毒治疗的持续病毒学应答率（Sustained virological response,SVR）也存在差异。各大指南均明确指出,基因1型的治疗疗程为48周,而非1型（2/3型）的疗程为24周。基因1型患者,治疗结束SVR率约为40%-50%;基因2型、3型的感染者SVR率能够达到75%-80%。也就是说,仍有不少患者在忍受了 SOC治疗的各种副作用和较大费用代价后,依然没有获得疗效。抗病毒治疗失败的表现包括3类:完全无应答（non-response）、治疗过程中反弹（breakthrough）及停药后复发（relapse）。临床上将这些初始治疗无应答或治疗后复发及没有获得SVR的患者,定义为“难治性丙型肝炎”,这已成为临床上的难点和研究上的热点。对于难治性丙型肝炎的发生机制众说纷纭,尚无定论。从宿主因素和病毒因素着手深入研究干扰素抵抗现象发生的分子机制,为丙型肝炎患者抗病毒治疗提供疗效预测指标,将有助于进入慢性丙型肝炎个体化治疗的时代。HCV感染是宿主与病毒相互作用的一个过程,最近十年来,为数众多的宿主相关因子基因多态性被发现与丙型肝炎的抗病毒治疗失败相关。自2009年以来,全球多项研究发现人基因组编码干扰素的基因IL28B附近rs12979860和rs8099917 位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）与聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗应答有关,这一发现标志着在HCV研究领域对宿主基因多态性的认识进入新的阶段。随后,陆续有研究发现了其他宿主因子多态性对SVR的作用,包括RBV摄取和代谢相关的平衡和集中核苷酸转运因子（equilibrative nucleoside transporters,ENTs;concentrative nucleoside transporters,CNTs）、苷三磷酸酶基因（inosine triphosphatase,ITPA）及维生素 D信号通路调节因子等,其多态性与抗病毒治疗失败有关。多药耐药基因（Multidrug resistance 1,MDR1）位于人类第7号染色体,基因全长约209kb,可编码药物转运蛋白P（P-glycoprotein,P-gp）。P-gp是一个分子量大小为170kDa的膜蛋白,高表达于肝脏、小肠、结肠和血脑屏障等器官,依赖主动运输能量通过限制物质的肠道吸收或增加其胆道和尿液的排泄,将外源性化学物质从细胞内泵出体外,是影响药物吸收、代谢、分布和排泄的重要蛋白,近年来大量研究证实了遗传因素在个体间P-gp表达和功能的差异中扮演了重要角色,MDR1多态性可能会影响P-gp的活性和功能。自1989年Kioka等首次描述MDR1的SNPs以来,迄今已发现50多个SNPs,其中外显子21、26和12的G2677T/A、C3435T和C1236T SNP是MDR1编码区最常见的突变位点,且它们间有一定的连锁,连锁程度在不同种族间差异很大。既往MDR1基因多态性的研究多集中于肿瘤发生、化疗耐药等方面,目前还没有关于MDR1 3435多态性与中国CHC接受SOC治疗效果的关系的研究。HCV基因型是影响抗病毒疗效的最主要因素,因为基因1型感染者SVR率（40%-50%）显着低于基因2/3型（75%-80%）,这说明病毒因素在干扰素抗病毒治疗中起着重要作用,提示应该着重从病毒因素开展相应研究。目前已有大量研究表明多个HCV蛋白与干扰素抵抗发生相关,如Core（尤其是aa70/91）,E2 上的 PePHD、HVR1、HVR2、HVR3,NS3/NS4A 及 NS5A 上的 ISDR、PKR-BD、V3、V4和IRRDR等。但是这些研究尚未达成明确的共识,并且体内和体外的研究结果还得出了相互矛盾的结论。多数研究仅分析了单一时间点（通常为治疗基线,非纵向观察队列）,将达到SVR的患者与未达到SVR患者体内HCV的某段功能基因序列与某一指定GenBank里的HCV序列进行比对,并不能反映出在机体和/或干扰素调节的免疫压力下病毒的适应性演变过程。并且这种比较很难排除个体基因遗传背景的差异以及不同患者间的宿主因素差异对治疗结果的影响。SOC方案治疗有很多副作用和禁忌症,且花费昂贵,致使部分患者无法完成全程治疗或无法接受该治疗方案。近期FDA批准NS5B聚合酶抑制剂（sofosbuvir,SOF）用于治疗CHC,开启了 CHC的无IFN治疗时代,SVR率高达95%以上,且疗程更短、副作用更少;但也随之而来的是高额经济负担。根据我国国情,近几年治疗HCV感染的方案仍以将Peg-IFN-α联合RBV为主。因此,积极探索能够预测抗病毒治疗疗效的因素,对患者避免治疗带来的高风险、降低药物的毒副作用以及合理的进行个体化治疗,具有重要的临床实践意义。上述关于丙型肝炎病毒方面及宿主基因多态性方面的研究,都需要血标本,标本的数量和质量对于课题的顺利展开是不可或缺的。为了合理利用病例资源,迅速为研究者提供高质量、大数量的HCV标本,缩短课题研究周期,促进HCV研究,有必要建立HCV标本库。此外,对于华南地区的CHC而言,有多少患者属于“难治性丙型肝炎”?这些患者临床特征如何呢?抗病毒治疗失败的患者,表现为治疗中无应答、治疗过程中发生病毒学突破还是停药后复发呢?有无其他因素（宿主基因多态性位点或者病毒突变位点）可以预测抗病毒治疗失败呢?本研究首先扩大完善了我国华南地区丙肝标本库,随后从中选择完成SOC治疗并至少随访24周的患者,分析患者经抗病毒治疗后的临床转归,揭示抗病毒治疗失败患者尤其是停药后复发患者的临床特点。其次,从宿主基因多态性方面,以第一部分停药后复发患者为研究对象,匹配其他已知的影响抗病毒疗效的因素后,分析MDR1C3435T对SVR的影响。最后,从病毒突变方面,分析NS5A氨基酸突变对SVR的影响;并构建纵向研究队列,采集停药后复发患者的基线和停药后复发两个时间点的血清用于HCV全序列扩增和分析,以期进一步发掘HCV可能与抗病毒治疗失败相关的特征性氨基酸替换位点/类型或功能区域。第一If部分慢性丙型肝炎干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗失败患者的临床特点研究研究方法纳入2009年1月～2014年12月就诊于南方医科大学附属南方医院感染内科门诊和住院部,确诊为慢性丙型肝炎的患者（均符合《病毒性肝炎防治方案》）,收集患者临床资料及血液标本,定期随访,完善资料。在课题组前期基础上扩大、扩充标本库。随后从中选择237例完成抗病毒治疗（普通干扰素或长效干扰素联合利巴韦林）并至少随访24周的丙型肝炎病毒慢性感染者,系统分析这部分患者的临床特点,特别是难治性CHC患者和反复复发的CHC患者的临床特点。统计学分析:计数资料采用卡方检验;计量资料组间比较采用one-way ANOVA统计分析;连续性变量呈偏态分布资料的组间比较,采用Kruskal-Wallis检验统计分析。P<0.05有统计学差异,所有统计学分析使用SPSS13.0。结果1、扩大并完善华南地区丙肝标本库,已纳入慢性丙型肝炎患者758例,血清标本1052份,PBMC标本195例;患者流行病学及临床资料完善。427例CHC进行HCV基因分型检测,149例CHC进行IL28B rs12979860检测,98例进行IL28Brs8099917 检测。2、237例慢性丙型肝炎患者完成SOC治疗并至少随访24周,总体SVR率为 66.2%（157/237,2a/3a/3b 疗效最好,6a 次之,1b 最低）。3、80例抗病毒治疗失败患者的类型,5例治疗中反弹（6.25%）,22例完全无应答（27.5%）,53例停药后复发（66.25%）。4、53例停药后复发患者特点:（1）基因型分布:1b型43例,6a型7例,其他基因型3例;（2）复发时间分布:停药后4周:13例、停药后12周:25例、停药后24周:12例、停药后48周:2例、停药后72周:1例;（3）感染途。径分布:40例经输血或使用血液制品感染（75.5%）,3例经静脉吸毒感染,5例经纹身、穿耳孔、刮脸、小诊所牙科治疗等未严格消毒的操作感染,还有5例传播途径不明。第二部分宿主MDR1 C3435T多态型对慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的影响研究方法从第一部分237例研究对象中纳入109例1b亚型慢性丙型肝炎（CHC）患者。所有患者接受长效干扰素135ug/180ug（每周）联合利巴韦林1000mg（体重<75kg）/1200（体重>75kg）（每天）,疗程为48周,治疗结束后至少随访24周。采用我们先期开发的高敏感、高特异的四引物扩增阻滞突变体系聚合酶链反应法对MDR1 3435进行分型,并从中取部分样本行PCR扩增后直接测序,BioEdit分析测序峰图进行分型验证。分析MDR1 3435多态性与抗病毒治疗复发的关系。统计学分析:组间比较采用两独立样本t检验行统计分析,连续性变量呈偏态分布资料的组间比较采用Mann-Whitney U检验行统计分析。P<0.05差异有统计学意义。结果1、建立四引物扩增阻滞突变体系聚合酶链反应法（T-ARMS-PCR）进行MDR1 3435基因分型,是一种特异、敏感、简洁的检测方法。2、109例1b型CHC患者,男性67例,女性42例;MDR1基因第26外显子3435基因型分布:CC型51例,CT型为49例,TT型为9例。3、109例1b型CHC接受SOC后,65例获得SVR,总体SVR为59.6%;SVR 和 Non-SVR 两组患者的基线 IL28B rs12979860 基因型、ALT、AST、ALB、WBC、PLT及合并肝硬化比例,均无统计学差异（P值分别为:0.880、0.946、0.053、0.737、0.069、0.817,均>0.05）。4、SVR 组中,3435 CC 型、CT 型、TT 型各为 21 例（32.3%）、36 例（55.4%）和8例（12.3%）;非SVR组中,3435 CC型、CT型、TT型分别为30例（68.2%）、13例（29.5%）和1例（2.3%）。两组MDR1 3435基因型存在显着差异（χ2=14.31,P=0.001）。第三部分抗病毒治疗复发的慢性丙型肝炎患者治疗前后病毒变异情况研究研究方法从本研究第一部分建立的丙肝标本库中,选择70例基因1b型CHC,接受IFN/RBV抗病毒治疗并至少随访24周,扩增HCV NS5A;随后再从中选择1b和6a型慢性丙型肝炎抗病毒治疗复发患者各2例。采用血清微量HCV RNA抽提技术、长片段PCR扩增和测序技术、HCV全长读码框序列的拼接技术等获取患者初治基线和停药后复发两个时间点的全长基因组HCV序列,通过Vector NTI软件、MEGA 4软件比对分析碱基和氨基酸的变异和进化情况。结果1、HCV 1b亚型NS5A氨基酸变异数目与IFN/RBV治疗后的SVR明显相关,尤其是 ISDR/PKRBD 区（Z=-3.814,P<0.001;Z=-2.308,P=0.021）,该区域氨基酸突变数目越多,则SVR率越高。2、成功扩增2例1b亚型慢性丙型肝炎Peg-IFN/RBV治疗复发患者的HCV RNA全基因组,2例6a型扩增、测序尚在进行中。3、2例1b亚型复发患者基线与停药后复发的比较,HCV功能蛋白E2和NS5A区域的变异率较高（E2蛋白,核苷酸突变比例为17.4%和19.4%,氨基酸突变比例为16.3%和16.5%;NS5A蛋白,核苷酸突变比例为23.7%和16.2%,氨基酸突变比例为30.8%和27.8%）。结论1、扩大、完善了华南地区慢性丙型肝炎感染者的临床资料标本库,该标本库的建立将为HCV的基础和临床研究提供平台。2、华南地区CHC接受干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗,总体SVR率为66.2%（157/237）,2a/3a/3b 疗效最好（78.79%）,6a 次之（75%）,1b 最低（60.14%）。抗病毒治疗失败,多表现为停药后复发,停药后24周内为复发高危时期,但停药72周还可能复发,应延长随访时间。3、四引物扩增阻滞突变体系聚合酶链反应法（T-ARMS-PCR）是一种特异、敏感、简洁的MDR1 3435基因分型方法;MDR1 C3435T突变与基因1b型CHC患者抗病毒治疗应答有关,MDR1 3435CT/TT基因型获得SVR的比例显着高于MDR1 3435CC 基因型。4、HCV 1b亚型NS5A氨基酸变异数目与IFN/RBV治疗后的SVR明显相关,尤其是ISDR/PKRBD区,该区域氨基酸突变数目越多,则SVR率越高。经IFN/RBV治疗停药后复发的1b亚型患者,HCV功能蛋白E2和NS5A区域的变异率较高。
毛源,苗盛巍,王伟,邱洁,沈传来,沈玲,胡朝晖,谢维[5]（2013）在《HCV-1b型基因变异与干扰素/利巴韦林疗效的相关性研究》文中提出目的探讨HCV-1b型ISDR区、PKR-BD区、NS5A-V3功能区及E2-PePHD功能区的基因序列突变程度与干扰素/利巴韦林联合治疗慢性丙型肝炎疗效的相关性。方法收集拟进行干扰素和利巴韦林联合治疗的慢性丙型肝炎患者的血清标本以及实验室数据和随后的临床治疗资料。提取血清标本RNA,RT-PCR鉴定HCV基因型。选取HCV-1b型阳性的标本,利用RT-PCR分别扩增ISDR区、PKR-BD区、NS5A-V3功能区及E2-PePHD功能区的基因片段,对PCR产物进行基因测序,与标准株的基因序列比对,确定各区的氨基酸突变位点和数量。回顾性分析各基因区氨基酸突变数量与干扰素/利巴韦林疗效的相关性。结果 169例慢性丙型肝炎患者中HCV-1b型患者124例,占74.4%;在干扰素/利巴韦林联合治疗满12个月并随访满6个月的HCV-1b型感染者中,治疗前NS5A区的ISDR突变程度与持续病毒反应（SVR）的发生率之间呈显着相关性（P<0.05）。突变型（突变氨基酸数≥4）患者群的SVR发生率为85.7%,中间型（突变氨基酸数为13）患者群的SVR发生率为55%,而野生型患者群的SVR发生率最低,仅为30%;而PKR-BD区、NS5A-V3功能区以及E2-PePHD功能区的氨基酸突变数量与SVR发生率无显着相关性（P>0.05）。结论 HCV-1b型感染者治疗前NS5A区的ISDR突变程度对于干扰素/利巴韦林联合治疗的疗效具有很大的预测价值。
李京涛[6]（2012）在《HCV 1b亚型NS5A氨基酸变异对慢性丙型肝炎抗病毒治疗的影响》文中研究指明研究背景和目的丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）感染可导致慢性肝病、肝硬化、肝细胞癌等,是肝脏疾病的主要原因之一。WHO评估目前全球约有1.8亿人口感染HCV（感染率：3%）。我国人群抗-HCV阳性率约为3.2%,全国约有4000万人感染HCV。聚乙二醇化干扰素（Pegylated interferon, PEG-IFN）联合利巴韦林（Ribavirin, RBV）治疗是目前慢性丙型肝炎（Chronic hepatitis C,以下简称为CHC或慢性丙肝）患者的标准方案。但此方案对HCV1b亚型的疗效欠佳,持续病毒学应答率（SVR）仅约为50%。在对HCV1b型基因序列的研究中,许多报道发现HCV NS5A蛋白多个区域的氨基酸（amino acid, aa）序列突变与IFN、IFN/RBV的疗效有关,这些区域包括ISDR （aa2209-2248）、PKRBD （aa2209-2274）、V3（aa2356-2379）、IRRDR （aa2334-2379）。ISDR:1995年日本学者研究发现HCV的非结构蛋白5A区（NS5A） C端2209-2248位氨基酸突变数目可作为HCV1b型干扰素疗效的独立预测因素,干扰素应答组患者的ISDR变异数目高于无应答组病人。遂把HCV NS5A2209-2248氨基酸序列命名为干扰素敏感性决定区（IFN sensitivity-determining region, ISDR）。其重要的研究结论为：HCV1b型患者ISDR区氨基酸序列与干扰素疗效密切相关,与HCV-J相比,突变型（氨基酸变异≥4个）对干扰素敏感,中间型（氨基酸变异1-3个）和野生型（未变异）不敏感。此结论被日本的诸多后续研究证实,但是来自欧洲和美国的多项研究结果与这一结论存在矛盾之处。PKRBD:1997、1998年Gale等通过体外实验证实,HCV抵抗IFN a主要是通过NS5A和PKR蛋白的相互作用,PKR蛋白是主要的宿主抗病毒蛋白之一。这种相互作用需要ISDR以及其后的26个氨基酸残基,该区域位于aa2209-2274,被称为PKR-binding domain （PKRBD）. HCV1b型PKRBD变异与IFN a或IFNa/PEG-IFN a联合RBV的持续病毒学应答明显相关已有报道。V3和IRRDR:近些时候,Veillon和El-Shamy等研究发现HCV NS5A的V3区（aa2356-2379）,以及V3加上其N端侧翼区,被称为Interferon/ribavirin resistance determining region （IRRDR; aa2334-2379）存在高度变异现象,V3和IRRDR的氨基酸变异与IFNa和RBV治疗的应答有关。更有2009年Bouzgarrou等报道NS5A从ISDR至V3（aa2209-2379）的氨基酸变异能够影响抗病毒治疗的应答。IFN a的经典信号通路是通过JAK/STAT途径。Ⅰ型IFN与相应的受体结合,激活信号级联反应,从而调节一系列干扰素刺激基因（ISGs）的转录翻译,而翻译的一些蛋白因子具有抗病毒活性,如PKR、MxA、ISG15等。蛋白激酶PKR在RNA病毒基因复制时可与dsRNA结合而激活,激活后能够磷酸化翻译启始因子eIF-2a亚单位的51位丝氨酸残基,使磷酸化的eIF-2a无法参与蛋白多肽链的翻译过程,从而抑制病毒或细胞蛋白的合成,达到抗病毒的效果。而Gale等通过体外实验证明NS5A蛋白通过PKRBD,能够结合IFN a诱导产生的PKR。HCV NS5A蛋白与宿主细胞内蛋白激酶PKR的相互作用对细胞内干扰素刺激基因（ISGs）的翻译起着重要抑制作用。综上所述,HCV1b型NS5A关键区域发生氨基酸突变的数目不同,则干扰NS5A-PKR蛋白相互作用的程度不同,进而不同程度地影响干扰素发挥其疗效。除过日本,来自亚洲其他国家和地区的相关研究报道极少,尤其是中国大陆的研究报道。所以,本研究的目的是首先确定是否治疗前HCV1b亚型感染患者的NS5A的氨基酸变异与PEG-IFN联合RBV治疗疗效有关。分析聚焦于NS5A区的ISDR、PKRBD、IRRDR和V3四个功能区域。同时筛选NS5A关键区域变异数目不同的合适的临床毒株构建HCV重组replicon,建立HCV复制子细胞培养系统,对HCV NS5A不同氨基酸变异数目与以IFN为基础抗病毒治疗应答的机理进行初步探讨。第一部分HCV1b型NS5A全长基因的扩增和克隆构建研究方法采用RT-PCR技术从53例临床丙型肝炎患者血标本中扩增HCV1b型NS5A全长基因,测序分析,MEGA4软件比对其与HCV J株（GenBank注册号：D90208）病毒NS5A蛋白PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区的氨基酸突变数目和位点,了解广东HCV1b亚型NS5A氨基酸突变情况。同时根据NS5A测序结果,挑选合适的NS5A基因片段与pMD18-T载体连接,构建pMD18-NS5A克隆。统计分析软件应用SPSS17.0,统计描述采用频数表示,计量资料采用均数±标准差（x±s）表示,组间比较采用两独立样本t检验,进行Levene方差齐性分析,方差齐同条件下采用t检验,方差不齐条件下采用Satterthwaite近似t检验。P<0.05有统计学意义。结果1. HCV1b亚型NS5A基因成功扩增,全长1477bp, pMD18-NS5A克隆成功构建。2.广东地区HCV1b亚型NS5A的ISDR区氨基酸突变率为73.6%（39/53）,ISDR突变数目超过4个以上的仅占1.9%（1/53）,其余均为为野生型和中间型。PKRBD氨基酸残基突变数目5.7±1.4,V3氨基酸残基突变数目4.9±1.1,IRRDR氨基酸残基突变数目5.7±1.5。3. HCV lb型NS5A氨基酸突变数目与性别、年龄和传播途径的统计结果显示：年龄分组（≥50岁/<50岁）与V3区氨基酸变异数目有显着统计学差异（t=0.555,P=0.033）,年龄分组（≥50岁/<50岁）与IRRDR区氨基酸变异数目有显着统计学差异（t=0.288,P=0.041）,说明感染HCV年纪较大的患者IRRDR和V3区氨基酸变异较多,而ISDR和PKRBD区无显着差异（P=0.222和P=0.081）。NS5A氨基酸突变数目与性别和传播途径无关（P>0.05）。第二部分HCV NS5A变异对Peg-IFN/RBV治疗1b亚型CHC疗效的影响研究方法对广东地区53例HCV1b亚型感染的慢性丙型肝炎患者,经PEG-IFN/RBV标准方案（40例经180μg/次或135μg/次pegylated IFN-a-2a联合RBV800-1200mg/日方案,13例经80μg/次pegylated IFN-a-2b联合RBV800-1200mg/日方案）治疗48周随访24周,进行回顾性研究。分析HCV NS5A aa变异及其影响抗病毒治疗应答的特点。分析主要聚焦于NS5A区的ISDR、PKRBD、IRRDR和V3功能区域。统计分析软件应用SPSS17.0,统计描述采用频数表示,计量资料采用均数±标准差（x±s）表示,组间比较采用两独立样本t检验；分类变量比较采用X2检验；二分类Logistic回归用于分析与SVR有关的各种因素。P<0.05有统计学意义。结果1.53例慢性丙型肝炎患者采用PEG-IFN联合RBV治疗48周并随访24周,EVR、ETVR和SVR分别是69.8%（37/53）、73.6%（39/53）和50.9%（27/53）。治疗前基线特征中年龄与SVR有显着统计学差异（t=3.499,P=0.001）,PLT与SVR有显着统计学差异（t=-2.611,P=0.0120）,EVR与SVR有显着统计学差异（χ2=6.173,P=0.013）, ETVR与SVR有显着统计学差异（X2=19.757,P=0.000）。EVR和ETVR作为IFN的预测因素已被广泛接受。本研究显示PLT与SVR相关（P=0.012）,分析原因是由于患者基线特征的差异所致,因为获得SVR的27例患者中有6例为肝硬化（22.2%）,而26例未获得SVR的患者中有10例为肝硬化（38.5%）。进一步年龄分组比对,≥50岁组的CHC患者SVR率比<50岁组的SVR率低（P=0.008）,但是两组都可以获得较高的EVR和ETVR。提示对于获得了ETVR的≥50岁的CHC患者,延长疗程至72周或更长,可能提高SVR。2. ISDR aa突变数目与SVR有显着统计学差异（1.3±1.1对0.6±0.5；t=-3.095,P=0.003）。进一步分析发现ISDR aa突变数目≥2组与<2组之间SVR率存在显着统计学差异（X2=7.767,P=0.005）。研究结果显示采用PEG-IFN/RBV抗病毒治疗,ISDR氨基酸突变数目不仅能够预测SVR,更为重要的是,ISDR aa变异数目由既往Enomoto报道的4个降为2个即可对SVR进行有效预测。经与Meta分析结果对比发现,采用PEG-IFN/RBV联合方案,主要提高了既往HCV1b亚型感染患者ISDR aa突变中间型的SVR。3. PKRBD aa突变数目与SVR有显着统计学差异（6.1±1.7对5.3±0.7；t=-2.315,P=0.027）。进一步分析发现PKRBD aa突变≥6组与<6组之间的SVR率存在显着统计学差异（X2=4.259,P=0.039）。研究结果说明PKRBD aa序列的变异数与PEG-IFN/RBV疗效明显正相关,变异数≥6的病例所获得的SVR显着高于其他病例,从临床的角度支持Gale等的研究结果。4.对于V3、IRRDR以及整个NS5A （ISDR-V3）区,统计分析未发现其氨基酸突变与病毒学应答有显着统计学差异（P=0.819、P=0.949和P=0.244）。5.广东HCV1b亚型NS5A区单个氨基酸突变的常见位点为2218、2257、2259、2260、2262、2265、2268、2270、2271、2336、2351、2356、2360、2367、2368、2372、2373、2375和2378。统计分析未发现上述单个氨基酸位点的突变与PEG-IFN/RBV治疗疗效有统计学差异（P>0.05）,有必要增加病例数进行深入研究。6. Logistic回归分析结果显示：影响SVR的最主要因素是ISDR aa突变数目（OR=9.2,P=0.006）,其次为年龄（OR=0.9,P=0.006）。第三部分HCV1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建研究方法以能够高效复制的HCV1b replicon质粒为骨架,构成带有MIu Ⅰ和Bel Ⅰ双酶切位点的拉链质粒,前期采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）从不同CHC患者血清中扩增获得HCV1b亚型NS5A全长片段,克隆到pMD-18载体中,测序分析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区域的变异情况,挑选重要区域aa突变数目不同的NS5A片段,插入到此HCV replicon拉链质粒中。扩增产物中无MIu Ⅰ和Bel Ⅰ酶切序列的,在引物中引入相关酶切序列后再扩增,双酶切后将NS5A区段置换入HCV1b replicon骨架中,构建包含中国NS5A区段的插入式复制子重组质粒。结果分析Dr. Z. Huang惠赠的HCV1b replicon质粒,发现其NS5A区具有MIuⅠ和Bcl Ⅰ的单一酶切位点,双酶切移去质粒中原有的NS5A后（此时暂称为HCV replicon拉链质粒）,可以方便地插入从具有不同临床抗病毒治疗结局的CHC患者血清标本中克隆出的HCV NS5A,进而在细胞培养中深入分析不同来源的NS5A的生物学特点,阐明其与抗病毒药物疗效之间的关系。本研究从克隆的NS5A全长片段中挑选重要区域aa突变数目不同的3个片段,插入到HCVreplicon拉链质粒中,成功构建了包含中国NS5A区段的插入式复制子重组质粒,为研究中国HCV1b亚型NS5A蛋白的生物学功能、难治性CHC干扰素抵抗的机制以及个体化抗病毒治疗相关因素的分析奠定了的基础。第四部分HCV NS5A变异与以IFN为基础抗病毒治疗应答机理的初步探讨研究方法通过将各个HCV1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒进行Sca Ⅰ单酶切线性化,体外转录成RNA,转染Huh7.5.1细胞,利用荧光素酶检测鉴定不同时间点HCV RNA的瞬时表达,经G418筛选得到含有HCV RNA稳定复制的Huh7.5.1细胞,利用RT-PCR法和免疫荧光检测鉴定细胞中HCV NS5A的基因和蛋白表达,验证各重组replicon质粒是否能够正常工作。用干扰素α-2b0IU/ml、25IU/ml、50IU/ml、100IU/ml、200IU/ml和400IU/ml; RBV0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml; IFN/RBV不同方案：IFN25IU/ml+RBV10μg/ml、IFN50IU/ml+RBV10μg/ml和IFN100IU/ml+RBV10μg/ml,分别干预负载有重组replicon的Huh7.5.1细胞48h后,收集细胞裂解液,测定荧光素酶活性,从而通过体外实验验证临床研究的结果,对其机理做初步探讨。统计分析软件用SPSS17.0,实验数据均采用均数±标准差（x±s）表示,不同浓度和方案的药物干预Huh7.5.1,三组间采用析因设计资料的方差分析进行显着性检验统计分析,同时对每个浓度药物、每个方案干预Huh7.5.1的结果采用one-way ANOVA方法进行显着性检验统计分析,方差齐同条件下,采用LSD法对各组数据进行多重比较,方差不齐条件下,采用Dunnett’T3方法对各组数据进行多重比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.经检测不同时间点各重组replicon转染Huh7.5.1的瞬时表达效率,通过G418筛选得到含有HCV RNA稳定复制的Huh7.5.1细胞,利用RT-PCR法和免疫荧光检测鉴定细胞中HCV NS5A的基因和蛋白表达,证明重组的HCV replicon能够正常工作,可用于进一步的实验研究。2.用不同浓度的IFN和RBV分别干预负载有重组replicon的Huh7.5.1细胞,发现三组的荧光素酶活性均呈现剂量依赖性的下降,说明IFN和RBV对HCV RNA复制的抑制作用呈剂量依赖性增加。以不同浓度的IFN处理HCV复制子细胞后,析因设计资料的方差分析结果显示：不同组间有显着差异（F=5.432,P=0.009）。不同药物浓度间有显着差异（F=583.930,P=0.000）。对每个浓度干预结果统计分析时,三组的one-way ANOVA分析显示：在100IU/ml浓度时,三组有显着性差异（F=6.588,P=0.031）,在200IU/ml浓度时,三组有显着性差异（F=34.220,P=0.010）。多重比较发现经过这2个药物浓度干预后,NS5A-3组的荧光素酶活性都是最低水平。说明HCV NS5A关键区域PKRBD/ISDR区发生氨基酸突变较多毒株,对IFN治疗的反应敏感。3.用不同方案的IFN联合RBV进行了干预实验,采用不同方案干预Huh7.5.1,析因设计资料的方差分析结果显示：不同组间有显着差异（F=10.579,P=0.001）。对每个浓度干预时,三组的one-way ANOVA分析显示：IFN50IU/ml+RBV10μg/ml方案下,三组比较有显着性差异（F=8.565,P=0.017）,多重比较发现NS5A-1组病毒量显着高于NS5A-2组和NS5A-3组,说明HCV NS5A关键区域PKRBD/ISDR区发生氨基酸突变的replicon,对联合用药反应敏感。而而IFN100IU/ml+RBV10μg/ml方案下,三组比较有显着性差异（F=14.317,P=0.005）,多重比较显示组间两两比较有统计学差异,而NS5A-3组的病毒量最低,NS5A-2组居中。说明联合用药方案情况下,HCV对以IFN为基础的联合抗病毒治疗的反应敏感,并且HCV NS5A关键区域PKRBD/ISDR区变异数目越多,对药物的反应越好,这些发现与我们前期的研究结果相符合。结论1.本研究表明：HCV lb亚型NS5A氨基酸变异与以干扰素为基础的抗病毒治疗应答密切相关,关键区域集中在NS5A的ISDR和PKRBD区。并且采用PEG-IFN联合RBV标准方案治疗,ISDR氨基酸突变对治疗应答的预测可由4个降为2个。而实验部分也证明：对于HCV1b型NS5A区PKRBD/ISDR变异数目较多的病毒株,采用IFN联合RBV用药干预较单用IFN干预,治疗反应会更加敏感,并且HCV NS5A关键区域PKRBD/ISDR区变异数目越多,对联合治疗的反应越好。2.本研究提示：对于HCV1b型NS5A蛋白与抗病毒治疗的研究应给予足够重视,在基础实验研究中,利用本实验构建的重组replicon细胞培养系统,针对NS5A区不同区域氨基酸突变如何影响IFN信号转导通路的实验研究值得深入探索。
魏君锋[7]（2011）在《ISDR变异对聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗1b型慢性丙型病毒性肝炎疗效的影响》文中研究指明研究背景丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）感染常引起慢性肝病,感染HCV25～30年后肝硬化发生率为5%-25%,HCV相关肝硬化患者10年后肝功能失代偿发生率为30%,肝细胞癌年发生率为1%-3%。目前尚无有效的疫苗预防。有效的抗病毒治疗可改善患者长期生存率与生活质量。因此,抗病毒治疗的长期目标为降低HCV相关肝硬化、肝衰竭与肝细胞癌的发生率,降低HCV相关病死率,改善患者生活质量。HCV感染一般病情缓慢进展,抗病毒疗效评价多采用短期的临床指标,包括病毒学应答、生化学应答与肝组织学应答等指标。其中病毒学应答指标中的持续病毒学应答（sustained virological response, SVR）是当前评判疗效的最主要指标。SVR是指治疗结束24周后应用敏感PCR方法检测血清HCV RNA仍为阴性,被视为疾病的“病毒学治愈”。干扰素（interferon, IFN）联合利巴韦林（ribavirin, RBV）是目前慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C, CHC）抗病毒治疗的标准方案。多项大型临床研究均表明,聚乙二醇干扰素（Pegylated interferon, Peg-IFN）联合RBV的方案SVR可达65%,疗效明显优于普通IFN联合RBV方案。HCV基因型是影响CHC患者抗病毒治疗应答的重要因素,不同基因型患者治疗疗程与方案不同,AASLD（?）临床指南推荐HCV 1型患者Peg-IFN联合足量RBV治疗疗程48周,而2型和3型患者应用Peg-IFN及低剂量的RBV治疗疗程24周,在患者开始抗病毒治疗前,应检测HCV基因型。HCV基因型分布存在明显地区和人群差异；HCV不同基因型和亚型感染者的临床表现、肝病严重程度存在差异。由于目前国内尚无市售HCV分型试剂盒可供使用,建立一种可靠、灵敏、简洁、实用的HCV基因分型技术,对丙型肝炎的临床研究和相关的分子流行病学研究均具有重要意义。影响抗病毒疗效的基线指标很多,其中患者基因型与基线HCV RNA载量是目前最重要的两个预测指标。其他指标还包括性别、年龄、体重、有无胰岛素抵抗以及肝脂肪病变与纤维化程度、是否酗酒以及是否使用静脉毒品等。这些预测指标有助于临床医生与患者对于可能的治疗结局有充分的认知,也可作为个体化治疗方案的依据。在中国、日本以及东南欧流行的HCV 1b基因亚型感染抗病毒治疗应答较差。对于HCV 1b型慢性丙型病毒性肝炎患者,单用普通干扰素治疗SVR率只有10%-40%,标准抗病毒治疗方案Peg-IFN联合RBV治疗也仅达到约40%-50%。而Peg-IFN联合RBV治疗费用昂贵、副作用大。因此,病毒相关因素如基因型的检测及lb型疗效的影响因素预测将有助于临床合理地选择病例进行干扰素的治疗,从而提高干扰素疗效。日本学者Enomoto等研究发现HCV lb型NS5A 2209～2248氨基酸序列氨基酸突变数目可作为干扰素抗病毒疗效的独立预测因素,并把该区命名为干扰素敏感性决定区（Interferon sensitivity determining region, ISDR）。他们认为野生型株（HCV J）为耐干扰素株,其他病毒株的ISDR序列如与之相同则为野生株,会对IFN无应答；如与野生型株ISDR序列相差4个氨基酸以上为突变株,对IFN持续应答；差别在1-3个氨基酸之间为中间型,以无应答为主。随后日本学者的系列研究证实了这个发现。M Pascu等进行Meta分析认为：ISDR氨基酸残基突变在HCV lb型患者中可以做为一个亚型用于预测IFN治疗的应答反应,可用于预测IFN治疗疗效。然而有关ISDR国内是否可做为HCV治疗的预测因素仍存在争议。唐振亚等对武汉地区12例IFN治疗患者进行研究,认为中国分离株ISDR高度保守,中国的野生株对干扰素治疗产生SVR；胡芸文等发现上海丙型肝炎患者血清HCV的ISDR序列相对保守,干扰素治疗前24份血清HCV病毒株均为ISDR野生型株和中间型株,未发现突变株,认为国内少见ISDR氨基酸残基突变,ISDR不能做为疗效预测因素。然而,他们的研究对象为普通干扰素治疗患者,样本量过小,未进行统计分析；而Shen等对江苏地区应用IFN治疗的20例患者进行回顾性分析,认为ISDR氨基酸残基突变影响干扰素治疗疗效,Yen等对及台湾地区应用Peg-IFN联合RBV治疗的60例患者ISDR氨基酸残基突变与SVR显着相关。国内有关Peg-IFN联合RBV治疗的HCV 1b慢性丙型病毒性肝炎ISDR氨基酸残基突变的研究尚未见报道。本研究主要从影响疗效的HCV病毒学因素方面进行研究,包括以下三部分组成：1、采用RDH法建立HCV基因分型技术；2、建立一种以HCV 1b型ISDR特异性引物为基础的RT-PCR法,对广东地区HCV ISDR进行序列测定,了解广东地区ISDR氨基酸残基突变的分布情况；3、回顾性分析ISDR及治疗前、随访后等临床资料,分析ISDR氨基酸残基突变对Peg-IFN联合RBV治疗lb亚型CHC的影响因素,探讨影响SVR的主要预测因素及ISDR的临床意义。具体内容如下：一、反向点杂交技术检测丙型肝炎病毒基因型的方法建立与应用目的：建立HCV基因分型技术PCR-反向点杂交法（PCR-RDH）方法：应用生物信息学软件针对HCV 5’端非编码区（5’UTR）和核心蛋白区（C）设计特异性捕获探针及生物素标记引物,建立HCV基因分型的PCR-反向点杂交技术。应用本技术对115份丙肝血清标本进行基因型和基因亚型检测,同时对其中38份标本中的HCV进行RT-PCR基因扩增、测序、系统进化树分析确实HCV基因型和亚型,以评价反向点杂交法的准确性及临床应用价值。结果：115份血清标本中,反向点杂交法基因型及基因亚型检出率为96.5%（111/115）,15份阴性对照全部为阴性。111例基因型明确标本中lb型63例（56.8%）；2a型9例（8.1%）；3a型4例（3.6%）,3b型6例（5.4%）；6a型28例（25.2%）,1b/2a混合型1例（0.9%）。经测序分型确定此法检测准确度为100%,特异性为100%。HCV基因型反向点杂交法检测准确可靠、简单经济、高效,适用于临床检测。与10余年前研究相比,目前广东地区的HCV基因型分布仍以lb型为主,但呈现出1b型比例下降,3a、6a型比例升高的趋势。二、HCV 1b型ISDR的检测方法的建立目的：建立一种以HCV 1b型ISDR特异性引物为基础的RT-PCR方法,对广东地区HCV ISDR进行序列测定,了解广东地区ISDR氨基酸残基突变的分布情况。方法：根据已知GenBank中的HCV 1b基因型D90208的全长序列及参考文献设设计HCV 1b NS5A ISDR引物序列,选择南方医院感染内科门诊就诊和住院的55例HCV 1b型慢性丙型肝炎患者的血清提取HCV RNA,采用巢式PT-PCR,扩增HCV 1b NS5A的ISDR,并与HCV J株进行序列比对确定ISDR区氨基酸残基突变数目,分析广东地区HCV 1b型患者ISDR分布情况。结果：HCV ISDR区扩增产物全长249bp,电泳显示条带清晰,大小符合预期分子量,无非特异性条带扩增,测序结果经BLAST分析为目的片段。广东地区HCV 1b型ISDR分布为：ISDR野生株（无突变）占25.5%（14/55）,中间型（突变数目1一3个）占72.7%（40/55）,突变株（突变数目超过3个者）占1.8%（1/55）。变异对ISDR联合RBV治疗1b亚型CHC疗效的影响Peg-IFN目的：探讨广东地区患者HCV 1b变异对ISDR联合RBV抗病毒Peg-IFN治疗的影响因素及临床意义。方法：选择经检测并接受ISDR联合RBVPeg-IFN治疗的型CHC44例患者进行回顾性分析。结果：SVR率为43.2%（19/44）,HCV 1b组与Peg-IFNα-2a组SVR相比,两者无统计学差异（P=0.797）；Peg-IFNα-2b氨基酸残基突变数目>2个与早期病毒学应答及SVR显着相关（P=0.018ISDR及氨基酸残基突变与EVR及SVR有统计学差异,而与P=0.005）, ISDRETVR无统计学差异（P=0.056）：在年龄组（年龄≤40岁）中,ISDR与年龄相关（P=0.012）,年龄小则ISDR突变数目多；ISDR与输血及非输血传播途径无关（P=0.117）。;ISDR 2218位氨基酸突变最多,在SVR组中突变中有14例（14/18,占77.8%）,NR组中11例（11/15,占73.3%）,无统计学差异（P=0.767）。多因素Logistic回归分析显示：影响SVR的最主要因素是ISDR氨基酸残基突变（OR=17.038,95%可信区间为：1.923-150.944,P=0.011）,其次是年龄≤40岁（OR=12.259,95%可信区间为：0.012～0.559,P=0.011）,AST影响SVR （OR=1.021,95%可信区间为：1.003～1.039,P=0.020）。结论：1、本研究建立的PCR-反向点杂交法对我国常见的HCV基因亚型lb、2a、3a、3b和6a检测的准确性、特异性及灵敏度较好,适宜我国临床推广应用；2、广东地区的HCV基因型分布仍然以1b型多见,呈现出lb型比例下降,3a、6a型比例升高的趋势；3. HCV ISDR区扩增顺利,无非特异性条带扩增,测序及BLAST分析为目的片段,方法可靠。广东地区HCV 1b型ISDR分布以野生株及中间株为主,多突变株比例较低（1.8%）4、聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗广东地区HCV 1b型CHC患者SVR率为43.2%（19/44）, Peg-IFNα-2a组与Peg-IFNα-2b组SVR相比无统计学差异；5、ISDR氨基酸残基突变数目≥2个与早期病毒学应答及SVR相关；ISDR氨基酸残基突变与输血及非输血传播途径无关；6、广东地区ISDR氨基酸残基突变以2218位氨基酸突变居多,但对SVR的影响未见统计学差异,需扩大样本深入研究；7、ISDR氨基酸残基突变数目、年龄≥40岁和AST是Peg-IFN联合RBV治疗CHC 1b型患者获得SVR的独立预测因素,其中ISDR氨基酸残基突变数目和年龄≥40岁对SVR的影响最大（OR=17.038, OR=12.259）;8、ISDR氨基酸残基突变对SVR的影响可能与HCV病毒进化相关。
张立新[8]（2011）在《丙型肝炎病毒5’非编码区及非结构蛋白5A的基因变异及其临床意义》文中指出研究背景和目的：丙型肝炎（Hepatitis C）是威胁人类身体健康的重要传染病,其病原体是丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）,全球范围内大约有1.7亿人感染了HCV,我国的感染率约为3%。HCV感染容易慢性化,慢性丙型肝炎约有20%-30%会在20年内缓慢进展为肝硬化和肝癌,HCV感染成为导致肝癌及终末期肝病的重要原因。HCV为单股正链RNA病毒,整个基因组只有一个开放读码框（Open reading frame, ORF）,位于基因组中央,在基因组的5’和3’末端各含有一段非编码序列（Non-cording Region, NCR）。基因组从5’NCR依次为C、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B及3’NCR, C区编码核壳蛋白,E1、E2区编码包膜糖蛋白,P7及NS2到NS5分别编码不同功能的非结构蛋白。HCV具有高度变异性,但不同区段变异率不同,有些区段变异性较大,而另有些区段则遗传保守性很高,其中5’NCR和C区最保守,E区最容易变异。HCV 5’NCR是整个基因组最为保守的区域,长度和序列非常稳定,这个区段核苷酸突变少,并且其变异可以代表基因型。HCV可以分为6个基因型及不同亚型,HCV基因型分布有明显的地域差别,我国大陆主要是1b、2a型及少量的la、2b、3b、4a及6a型等。研究表明,HCV基因型与临床有密切的关系,基因1型HCV感染者往往病毒载量较高,疾病进展快,对干扰素的应答较差,但是基因型对临床的影响仍然存在一定的争议。HCV 5’NCR是病毒复制的起始部分,在病毒的复制及病毒蛋白的翻译方面起到很重要的作用,5’NCR某些核苷酸的特异性变异可能会影响病毒的复制水平及对干扰素的治疗应答。NS5A是HCV编码的非结构蛋白,在HCV多蛋白的成熟和RNA的复制过程中具有十分重要的作用,具有抗肝细胞凋亡作用,并下调干扰素a（IFNa）刺激的抗病毒效应。HCV NS5A某些区域的基因变异可能导致其抗干扰素作用的减弱,研究最多的区域是ISDR,日本学者研究发现NS5A羧基末端第2209到2248氨基酸的40个氨基酸区域的序列与干扰素治疗的敏感性有关,将这个区域称为干扰素敏感决定区（ISDR）,认为ISDR变异株（4个以上氨基酸突变）对干扰素的应答较好,但是欧洲和美国的一些研究并未证实ISDR的突变与治疗转归的关系,考虑ISDR外还存在与干扰素疗效相关的序列,如V3区、干扰素及利巴韦林耐药区（IFN/RBV resistance determining region, IRRDR）等。目前对ISDR变异与干扰素应答关系的研究较多,但是对NS5A区基因全序列的变异对干扰素应答影响的研究还很少,国内尚未见报道。为了明确HCV 5’NCR及NS5A的变异情况以及变异对临床的影响,本研究应用基因芯片法及基因测序法检测山东地区HCV感染者5’NCR区,对进行抗病毒治疗的基因1b型慢性丙型肝炎病人进行NS5A序列测定,观察HCV 5’NCR及NS5A的变异情况及其临床意义。材料与方法：1.2005年1月至2008年10月期间济南市传染病医院门诊及住院的慢性丙型肝炎及肝硬化病人170例,抗HCV及HCV RNA均阳性,并排除了HAV、HBV、HEV、HIV感染及酒精性肝炎和药物性肝炎,空腹抽静脉血5m1。应用聚乙二醇干扰素a-2a 180ug或a-2b 1.0-1.5ug/kg治疗,基因1型疗程12个月联合利巴韦林800-1200mg,非基因1型疗程6个月联合利巴韦林800-1000mg。应用基因芯片法检测HCV基因型,观察基因型与疾病严重程度、感染途径、HCV RNA定量及干扰素应答的关系。2.2008年1月至2009年12月期间济南市传染病医院住院的慢性丙型肝炎病人118例,进行HCV 5’NCR的序列测定,应用分子生物学软件ClustalX2.0及Mega4.0进行分析,以Mega4.0软件构建遗传进化树,以此了解不同病毒株的亲源性；与国内外HCV流行株相比较,观察不同病毒株5’NCR区核苷酸序列的变异,了解山东地区HCV 5’NCR的基因变异特点；观察特征性的基因变异与HCVRNA定量水平及干扰素应答的关系。3.对35例进行抗病毒治疗的基因1b型慢性丙型肝炎病人治疗前的血清进行NS5A序列测定,全长NS5A序列设计5对引物,分5段进行测序,测序结果应用ClustalX2.0及Mega4.0软件进行核苷酸及氨基酸序列的比对,与HCV 1b型标准株HCV-J比较,观察NS5A全基因的核苷酸及氨基酸变异率及特异性的区域ISDR、V3区、IRRDR等的变异情况,以及以上变异与干扰素应答的关系。结果：1.基因芯片法检测HCV基因型结果为：基因1b型63.1%,2a型28.6%,1a及3b型均为1.19%,1b+2a及1a+1b混合型6%；肝硬化和慢性肝炎两组病人基因型分布无差别；有输血史者占67.9%,有输血史者及无输血史者基因型分布无差别；基因1b型与基因2a型血清HCV RNA定量log值分别为：6.42±1.0及5.69±1.15,t=3.89,p=0.0001；基因1b型与基因2a型抗病毒治疗SVR率分别为63.6%、90%,0.01<p<0.05。2.慢性丙型肝炎病人的5’NCR区基因序列分析结果表明：基因型分别为1b型65例、基因2a型45例、1a型2例、3a型1例、3b型2例及6a型3例。3.42例1b型慢性丙型肝炎病人5’NCR区序列跟国内外多数参考株序列相同,23例病人发生1-2碱基变异,存在120位C-T（9例）和204位C-T（8例）两个位点的特征性变异。2例1a病人5’NCR区基因序列与中国株序列相同,与2株美国株同源性为99.5%-100%。2a型病人5’NCR序列同源性为97.8%-100%,存在与参考株完全相同的病毒株,共有11个位点存在碱基变异,有222位及247位两个位点的特征性变异,根据这两个位点碱基的不同可以将2a型病人分为3组：均为T组、均为C组及分别为C、T组。3a型5’NCR和标准株同源性为98.1%,有4个碱基不同。2例3b型病人的5’NCR与国内外流行株同源性分别为99.1%-100%。6a病人都具有特征性的第-145位的CA插入,病人及参考株之间仅存在3个位点的碱基的不同,其中2例病人序列与中国株之一相同,与另一中国株及香港株同源性均为99.5%,另外1例病人与参考株的同源性为98.5%-99.5%。4.1b型5’NCR区120位C-T变异株和野毒株HCV RNA定量分别为5.16+1.40 log和6.14+1.01 log（p=0.041）,差别有显着性；而1b型5’NCR区204位C-T变异株和野毒株HCV RNA定量分别为5.95±0.95 log和6.14±1.01log（p=0.23）。2a型病人根据5’NCR第222位及247位的碱基分为3组,3组病人HCV RNA定量没有明显差别。1b型及2a型5’NCR区变异株与野毒株比较干扰素的应答率没有差异。5.35例病人中有20例得到全序列HCV NS5A测序结果,其中11例实现持续病毒学应答（SVR）,9个病人无应答或停药后复发（NR）。与HCV标准株J株进行比较,NS5A变异率较高,核苷酸变异数目为136+9.2,氨基酸变异数目为31.3士4.2,但病人之间同源性较高。SVR及NR两组病人NS5A全长序列的氨基酸变异数目没有差别（32.4+4.4及30.4士3.7,p=0.302）, ISDR为突变型、中间型及野生型人数分别为：1、6、2及0、4、7（p>0.05）, IRRDR氨基酸变异数目在SVR组及NR组分别为：6+1.33及4.4+1.14（p=0.014）, SVR组及NR组氨基酸变异数≥6的比例分别为6/9及2/11（p=0.04）,差异有显着性。结论：1.山东地区HCV主要流行株是基因1b型,其次为2a型,存在少量的1a、3a、3b、6a型及混合型感染。其中基因3a和6a型感染以前在山东地区未见报道。2.HCV感染者大部分有输血史,基因型与疾病的进展无关,1b型感染者HCVRNA定量（病毒载量）较高,且持续病毒学应答较差。3.HCV 5’NCR区序列高度保守,与国内外流行株同源性高,变异率低。基因1b型及2a型5’NCR区均有特征性的核苷酸变异,1b型HCV感染者5’NCR第120位C-T的变异减弱了病毒的复制水平,其余位点的变异不影响病毒的复制水平,5’NCR的变异对干扰素的应答无明显的影响。4.与HCV J株比较,山东地区慢性丙型肝炎病人HCV NS5A区核苷酸及氨基酸变异率较高,但病人之间NS5A序列的同源性较高。ISDR的氨基酸变异率较高者抗病毒治疗应答者较好,但差异没有统计学意义,IRRDR氨基酸变异数≥6预示丙型肝炎抗病毒治疗疗效较好。
何立华[9]（2011）在《HCV准种变异特性及其免疫逃逸机制初步研究》文中认为丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）为单股正链RNA病毒,属于黄病毒科,肝炎病毒属,基因组全长约9.6kb。HCV在复制过程中,由于RNA依赖的RNA聚合酶缺乏校对功能,导致HCV高度变异。病毒在宿主体内存在的多种变异株（同源性>95%）称为准种。感染者体内存在的HCV准种反映在特定环境下以病毒复制、变异为基础的突变株竞争性选择的结果。准种的复杂情况与疾病进展、病程转归密切相关。病毒CTL抗原表位编码基因发生变异产生的HCV准种,是病毒逃避宿主免疫监控及药物治疗不反应的主要原因。本研究首先根据HCV病毒载量等临床指标,从50例候选者中筛选出16名HCV单独感染者,经5NCR区和NS5B区基因扩增及核酸序列分析,确定研究入选者感染HCV为4种基因型/亚型,分别为1b、3a、3b和6n,以1b（41.25%）和3b（36.75%）型为主。16名入选者均接受不同程度的药物治疗,经长期（1.5年）病程跟踪和临床指标检测发现,8例入选者继续维持慢性感染,另外8例病程转归,病毒RNA检测为阴性。进而建立了E2区和NS5A区准种检测方法-—多克隆测序分析法,以准种Neighbor-joining进化树、标准化熵值、平均遗传距离和dN/dS值等指标评价准种特性与变化情况。研究发现,慢性感染者和治疗病程转归者在入选初期,体内E2区准种平均遗传距离波动分别为0.0097～0.0625和0.0037～0.0269,熵值波动分别为0.9063～0.9786和0.5769～0.8849；NS5A区准种平均遗传距离波动分别为0.0050～0.0113和0.0022～0.0095,熵值波动分别在0.8847～0.9734和0.5187～0.8007。两个区段HCV准种的平均遗传距离和熵值,慢性感染者均大于治疗病程转归者,表明HCV准种异质性程度越低的患者,更易于产生治疗应答。对入选初期E2区和NS5A区准种dN/dS比值分析发现,所有慢性感染者和6例病程转归者准种dN/dS比值都小于1,其体内准种变化主要由遗传漂变引起。在病程转归者中,有2例患者dN/dS比值大于1,其准种变异是由达尔文进化压力造成的。进而,研究对入选者病程跟踪,多个时间点采集的样本,使用BEAST软件估算患者体内HCV准种的起源时间和进化速率,构建准种群体数量变化的BSP图,并对HCVE2区准种变化指标（多样性和复杂性）与临床指标（ALT值和AST值）相关性进行分析。发现8名慢性感染者随着病程进展,E2区和NS5A区准种存在渐变和彻变两种进化模式,这两个基因区段准种变异呈现出协同进化的特点,即在同一个病人体内E2区和NS5A区段进化模式相同。治疗病程转归者HCV准种进化速率（5.84×10-3 sub/site/month）明显高于持续感染者（0.61×10-3～1.31×10-3sub/site/month）。HCV E2区准种的多样性和复杂性与血清ALT、AST值之间无显着相关性（p>0.05）。最后,研究采用Elispot方法对一例慢性感染者（KM10）病程进展过程中,不同时间采集的PBMC中效应性CTL数量进行了测定。经HCV主要准种氨基酸序列分析发现,该慢性感染者在入选观察初期（T1期）病毒E2区CTL抗原表位（LLFTPGSKQNV）随着病程进展（T4期）1年内发生了较大变化（SFFTSGPKQNI）,利用合成的T1期主要准种抗原多肽（NH2-SLLFTPGSKQNVQ-COOH）,分别刺激T1和T4期采集的PBMC细胞,发现此抗原多肽的效应性CTL在观察初期（T1期）为307个,病程后期（T4期）只有21个,由于抗原表位编码基因变异,CTL明显不能免疫识别。本研究对经过治疗的HCV单独感染者进行随访研究,使用多克隆测序法分析HCV准种变异规律,并建立了Elispot方法分析HCV免疫逃逸,初步分析了CTL抗原表位变异的免疫逃逸能力及其对病程进展的影响,为丙型肝炎慢性化致病机制及疫苗研制等方面的研究提供直接依据。
叶莺[10]（2011）在《福建省丙型肝炎流行特征及体外细胞培养模型的构建与应用》文中认为目的近年疾病监测网络直报数据显示,我国丙型肝炎报告病例数呈递增态势,而丙型肝炎感染后症状的隐匿性使其易发展成慢性肝炎、肝硬化甚至是肝细胞癌,丙型肝炎已经成为重大的公共卫生问题。我国关于丙型肝炎流行病学、病原学方面的研究较少,而福建省仅在1992年进行过自然人群丙型肝炎抗体阳性率的调查,此后未见大规模的流行病学研究,也未见报道福建省丙型肝炎病毒基因型的分布特征。另外,不同基因型间对抗病毒药物的敏感性不同,而丙型肝炎病毒体外培养模型的缺乏使其在致病机制、疫苗研究、药物筛选等方面的研究长期停滞不前。因此,为了更好地预防和控制丙型肝炎,非常有必要对福建省丙型肝炎的流行特征进行分析,获取丙型肝炎流行现状的基础资料,建立丙型肝炎报告数的预测模型,为丙型肝炎防治策略的制定提供数据支持;此外,建立福建省丙型肝炎流行基因型病毒株的体外培养模型,为丙型肝炎基础研究提供平台,在此基础上进行药物筛查等工作,从实践意义上指导丙型肝炎临床用药。方法1、采用多阶段抽样的方法,通过横断面调查研究,获取丙型肝炎流行现状的基础资料;应用间接ELISA方法检测血清中的丙型肝炎病毒抗体,分析2006年福建省自然人群抗-HCV阳性率;2、通过收集无偿献血者、吸毒者以及医院来源的抗-HCV阳性的血清标本,采用RT-PCR方法,分别进行C/E1区和NS5B区基因的扩增、克隆和测序,应用生物学软件对序列进行分析比较,构建序列的系统发育树,分析福建省不同人群间基因分布的特征;3、根据《中国疾病预防控制信息系统》疫情数据库中福建省2004～2010年HCV的月报发病数据,分析其数据特征,建立最优的发病预测模型;4、应用长片段核酸扩增和基因克隆技术,获取不同亚型HCV基因组的全长序列,构建重组质粒;将福建流行株全长基因与JFH1株的非编码区进行嵌合,经体外转录、Huh7细胞转染,构建不同亚型嵌合的体外细胞培养模型,经IFA、RT-PCR等方法对其进行验证鉴定,并初步将该模型用于体外药物筛选。结果1、福建省自然人群抗-HCV阳性率为0.7%,地区分布无差异,男女无差异,随着年龄增长,抗-HCV阳性率有增加趋势,尤其是50岁以上年龄组,抗-HCV阳性率远高于50岁以下年龄组;虽然1992年人群抗-HCV阳性率的调查存在假阳性率等问题,结合其他资料,可以认为人群抗-HCV阳性率呈下降趋势,但HCV防治形势不容乐观;2、福建省丙型肝炎主要流行基因型为6a和1b,其次为3b和2a,不同人群间流行基因型有差别,临床病例的主要流行基因型为1b,而无偿献血者和吸毒者主要流行基因型为6a,从不同人群间流行基因型分布的差异可以推论,可能存在主要流行基因型由1b向6a转变的情况;还发现可能存在混合感染的情况,主要表现为3b亚型与其他型别的重组;3、《中国疾病预防控制信息系统》疾病监测数据显示,自2004年实行网络直报后,丙型肝炎报告数呈逐年上升趋势,且报告数的上升是由临床诊断病例数上升引起的,实验室确诊病例数基本保持稳定,临床诊断病例数的上升可能有几个方面原因:责任人报告意识增强、感染者发展为病人、报告人掌握的HCV诊断标准不严谨;4、建立的ARIMA（2,1,0）（2,1,0）12（无常数）模型对丙型肝炎月报数进行了较好的跟踪与预测,但由于外界其他因素变化的影响,用于中短期预测效果优于长期预测。5、扩增并拼接了6株不同亚型的丙型肝炎病毒全长基因（其中1b亚型两株,3a、3b、6a及6n亚型各一株）以及1a亚型半长片段;构建了全长重组质粒pBS1、pBR2、pBSR5、pXX4、pXX19及pXQ124;6、成功构建了pBS1/JFH1（6a/2a）嵌合体外细胞培养模型。pBS1/JFH1经体外转录产生的感染性RNA转染Huh7细胞后产生的衍生病毒可以引起新的Huh7细胞的感染,与pJFH1相比,构建的嵌合株感染力相对较弱;7、将构建的pBS1/JFH1（6a/2a）嵌合体外细胞培养模型初步应用于药物筛选。研究结果表明INFα能有效抑制病毒复制,而且这种抑制呈剂量依赖性,RBV、NTZ和CsA单独应用也都能抑制HCV病毒的复制,但需要较大剂量,而这三种药物与INFα联合应用,都能显着提高INFα的抗病毒作用。结论1、福建省自然人群抗-HCV阳性率呈现下降趋势,但由于受HCV易慢性化特点的影响,使多年前HCV较高的阳性率表现为目前发病率的逐年增加。2、完成福建省不同人群HCV基因流行型分析,发现可能存在主要流行基因型由1b向6a转变的情况以及目前存在较多HCV混合感染的情况。3、扩增并拼接了6株5个亚型的HCV全长基因,成功构建出pBS1/JFH1（6a/2a）嵌合体外细胞培养模型。该模型用于药物筛选具有可行性,可为深入研究HCV的毒力基因、致病机制等基础性研究提供有利的工具。
二、丙型肝炎病毒干扰素敏感决定区基因“盒”的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎病毒干扰素敏感决定区基因“盒”的研究（论文提纲范文）
（1）住院病人丙型肝炎病毒感染的筛查及快速筛查方法的评价（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 丙肝的流行病学 |
| 1.1.1 全球的疾病负担 |
| 1.1.2 各地区流行状况 |
| 1.1.3 全球基因型分布 |
| 1.1.4 传播途径 |
| 1.1.5 特殊人群的流行病学研究 |
| 1.1.6 我国的丙肝流行病学研究 |
| 1.2 HCV病原学 |
| 1.3 HCV感染的自然史 |
| 1.4 丙肝的预防与诊治 |
| 1.4.1 预防措施 |
| 1.4.2 实验室检查 |
| 1.4.3 诊疗及管理 |
| 1.4.4 抗病毒治疗 |
| 1.5 防治丙肝面临的挑战 |
| 1.5.1 WHO的战略目标 |
| 1.5.2 我国丙肝防治面临的挑战 |
| 1.5.3 HCV筛查的必要性及可行性 |
| 1.5.4 HCV筛查策略 |
| 1.5.5 HCV筛查方法 |
| 第2章 住院病人丙型肝炎病毒感染的筛查 |
| 2.1 研究对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 研究方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HCV抗体的检测 |
| 2.2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.3.1 研究对象的选择和分布 |
| 2.3.2 研究人群的人口学特征 |
| 2.3.3 不同性别、年龄间HCV抗体阳性率的比较 |
| 2.3.4 HCV抗体阳性患者年龄分布 |
| 2.3.5 不同地区HCV抗体阳性情况 |
| 2.3.6 不同地区HCV抗体阳性率随年龄的变化情况 |
| 2.3.7 不同科室HCV抗体阳性情况 |
| 2.3.8 全国丙肝抗体检测情况推算 |
| 2.3.9 加强医院内丙肝筛查管理建议 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 丙肝病毒感染快速筛查方法的效能评价 |
| 3.1 研究方法 |
| 3.1.1 总体方案设计 |
| 3.1.2 研究对象 |
| 3.1.3 研究步骤 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 考核试剂检测 |
| 3.2.2 参比试剂1检测 |
| 3.2.3 血样采集及处理 |
| 3.2.4 血清样本检测 |
| 3.2.5 数据收集 |
| 3.2.6 统计学分析 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 受试者分布 |
| 3.3.2 各中心检测情况 |
| 3.3.3 人口学资料及临床特征 |
| 3.3.4 检测结果描述性统计 |
| 3.3.5 考核试剂与金标准的一致性 |
| 3.3.6 考核试剂与参比试剂1的一致性 |
| 3.3.7 考核试剂与参比试剂2的一致性 |
| 3.3.8 参比试剂1与金标准的一致性 |
| 3.3.9 参比试剂2与金标准的一致性 |
| 3.3.10 自采自测使用方式的适用性 |
| 3.3.11 病毒学阳性检出率 |
| 3.3.12 假阴性结果分析 |
| 3.3.13 低滴度样本分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 第5章 本实验创新点及意义 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）丙型肝炎病毒复制子新型构建方法的建立及基因3a、6a型病毒株耐药性的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 丙型肝炎病毒的流行病学 |
| 1.2 丙型肝炎病毒的基因型分布 |
| 1.3 丙型肝炎病毒的分子病毒学 |
| 1.3.1 丙型肝炎病毒的基因组结构 |
| 1.3.2 丙型肝炎病毒的生活周期 |
| 1.4 丙型肝炎病毒的研究模型 |
| 1.4.1 丙型肝炎病毒的假病毒模型 |
| 1.4.2 丙型肝炎病毒的亚基因组复制子模型 |
| 1.4.3 丙型肝炎病毒的细胞感染模型 |
| 1.4.4 丙型肝炎病毒的动物模型 |
| 1.5 丙型肝炎病毒直接抗病毒药物的发展 |
| 1.5.1 丙型肝炎病毒直接抗病毒药物的分类 |
| 1.5.2 直接抗病毒药物相关的耐药突变的总结 |
| 1.6 本课题研究背景 |
| 1.7 本课题研究目标 |
| 第二章 实验材料与试验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 蛋白抗体 |
| 2.3 HCV直接抗病毒药物 |
| 2.4 病人血清的来源及RNA的抽提 |
| 2.5 多规格孔板的细胞实验 |
| 2.6 复制子单克隆的分离 |
| 2.7 PCR体系 |
| 2.8 质粒回收与琼脂糖电泳产物回收 |
| 2.9 大肠杆菌感受态DH5α的制备与转化 |
| 2.10 酿酒酵母感受态W303 的制备与转化 |
| 2.11 质粒构建 |
| 2.12 TA平末端克隆与限制性内切酶 |
| 2.13 RNA抽提与反转录 |
| 2.14 HCV RNA的体外转录与转染 |
| 2.15 直接抗病毒药物敏感性的测试 |
| 2.16 免疫荧光 |
| 2.17 免疫印迹 |
| 2.18 HCV序列的生物信息学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 丙型肝炎病毒亚基因组复制子新型构建方法的建立 |
| 3.1.1 丙型肝炎病毒复制子cDNA文库的构建 |
| 3.1.2 丙型肝炎病毒复制子细胞的建立 |
| 3.1.3 基因1b型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.1.4 基因3a型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.1.5 基因6a型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.2 基因3a型丙型肝炎病毒亚基因组复制子耐药相关的研究 |
| 3.2.1 基因3a型复制子对直接抗病毒药物的敏感性研究 |
| 3.2.2 基因3a型复制子对NS3 抑制剂耐药机制的研究 |
| 3.2.3 基因3a型复制子NS3 抑制剂耐药位点D168Q稳定存在的机制研究 |
| 3.3 基因6a型丙型肝炎病毒对索磷布韦耐药机制的研究 |
| 3.3.1 基因6a型复制子索磷布韦耐药性的诱导 |
| 3.3.2 基因6a型复制子耐药型细胞克隆的特点分析 |
| 3.3.3 基因6a型丙型肝炎病毒索磷布韦耐药位点的鉴定研究 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 作者简历 |
| 专业综述 |
| 参考文献 |
（3）丙型肝炎病毒NS5B区基因耐药多态性研究（论文提纲范文）
| 个人简介 |
| 缩略语中英文对照一览表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）宿主MDR1多态性及HCV基因组变异对慢性丙型肝炎抗病毒治疗复发的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 慢性丙型肝炎干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗失败患者的临床特点研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 宿主MDR1 C3435T多态型对慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的影响 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 抗病毒治疗复发的慢性丙型肝炎患者治疗前后病毒变异情况研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 缩略语词汇表 |
| 攻读硕/博士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
（5）HCV-1b型基因变异与干扰素/利巴韦林疗效的相关性研究（论文提纲范文）
| 资料与方法 |
| 一、研究对象 |
| 二、实验方法与试剂 |
| 三、统计学处理 |
| 结果 |
| 一、HCV-1b型的感染率 |
| 二、NS5A-ISDR区突变与干扰素/利巴韦林疗效的相关性 |
| 三、PKR-BD区和NS5A-V3区突变与干扰素/利巴韦林疗效的相关性 |
| 四、E2-PePHD功能区突变与干扰素/利巴韦林疗效的相关性 |
| 五、治疗前临床及实验室指标与干扰素/利巴韦林治疗疗效的相关性 |
| 讨论 |
（6）HCV 1b亚型NS5A氨基酸变异对慢性丙型肝炎抗病毒治疗的影响（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 前言 研究技术路线图 第一部分 |
| HCV |
| 1B型NS5A全长基因扩增和克隆构建 1. |
| 材料与方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 第二部分 |
| HCV |
| NS5A变异对PEG-IFN/RBV治疗1B亚型CHC疗效的影响 1. |
| 研究对象与方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 第三部分 |
| HCV |
| 1B亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建 1. |
| 材料与方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 第四部分 |
| HCV |
| NS5A变异与以IFN为基础抗病毒治疗应答机理的初步探讨 1. |
| 材料和方法 2. |
| 实验结果 3. |
| 讨论 全文总结 参考文献 缩写词简表 致谢 博士研究生期间发表论文情况 参加国际学术会议和论文交流 附件 |
（7）ISDR变异对聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗1b型慢性丙型病毒性肝炎疗效的影响（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 前言 第一部分 反向点杂交技术检测丙型肝炎基因分型方法的建立 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 主要试剂、材料 |
| 1.3 主要设备 |
| 1.4 方法 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2、结果 |
| 2.1 PCR-IDH法检测结果 |
| 2.2 基因测序分型结果 |
| 2.3 灵敏度、特异性和准确度 |
| 2.4 重复性研究 |
| 3、讨论 第二部分 HCV 1b型ISDR的检测方法的建立 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 标本收集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 引物 |
| 1.5 方法 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2、结果 |
| 2.1 ISDR片段电泳图 |
| 2.2 测序结果图 |
| 2.3 MEGA序列比对结果 |
| 2.4 ISDR氨基酸残基突变情况 |
| 3、讨论 第三部分 ISDR变异对Peg-IFN联合RBV治疗1b亚型CHC疗效的影响 |
| 1、研究对象与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 生化指标检测 |
| 1.3 HCV RNA检测 |
| 1.4 HCV-Ab检测 |
| 1.5 ISDR氨基酸残基突变数目检测 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2、结果 |
| 2.1 入组基线临床资料 |
| 2.2 病毒学应答情况 |
| 2.3 SVR预测因素 |
| 2.4 ISDR与EVR及ETVR的关系 |
| 2.5 ISDR氨基酸残基突变情况 |
| 2.6 SVR影响因素的Logistic回归分析 |
| 3、讨论 全文总结 参考文献 主要英文缩略词表 硕士生期间主要从事的工作 攻读硕士学位期间成果 |
| 发表论文 |
| 会议论文摘要 致谢 统计合格证明 |
（8）丙型肝炎病毒5’非编码区及非结构蛋白5A的基因变异及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 符号说明 第一部分 |
| 基因芯片法检测丙型肝炎病毒的5’非编码区 |
| #13的基因变异及意义 前言 材料和方法 结果 讨论 结论 参考文献 第二部分 |
| 丙型肝炎病毒5’非编码区的基因序列分析及意义 前言 材料和方法 结果 讨论 结论 附图 参考文献 第三部分 |
| 丙型肝炎病毒非结构区5A的基因变异 |
| #75及与干扰素应答的相关性 前言 材料和方法 结果 讨论 结论 附图 参考文献 致谢 攻读博士期间发表的论文 学位论文评阅及答辩情况表 英文文章1 英文文章2 |
（9）HCV准种变异特性及其免疫逃逸机制初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 插图和附表清单 |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丙型肝炎与丙型肝炎病毒 |
| 1.1.1 丙型肝炎的流行与危害 |
| 1.1.2 HCV的发现 |
| 1.1.3 HCV生物学特性 |
| 1.2 |
| 1.2.1 HCV的变异 |
| 1.2.2 HCV基因型和亚型 |
| 1.3 HCV准种 |
| 1.3.1 HCV准种的产生及其特性 |
| 1.3.2 HCV准种的研究方法 |
| 1.3.3 HCV准种特性的临床意义 |
| 1.4 HCV准种变化关键区域——E2区和NS5A区作用及研究现状 |
| 1.4.1 包膜蛋白和NS5A蛋白的结构 |
| 1.4.2 E2蛋白和NS5A蛋白的作用 |
| 1.4.3 E2区和NS5A区准种研究现状 |
| 1.5 HCV变异产生免疫逃逸 |
| 1.5.1 体液免疫 |
| 1.5.2 细胞免疫 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 1.7 实验技术路线图 |
| 第二章 入选病人病程特点与HCV基因型测定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂(试剂盒)及溶液配制 |
| 2.2.3 实验仪器设备 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.2.5 实验方法及主要操作步骤 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 研究样本特征 |
| 2.3.2 逆转录巢氏PCR扩增检测结果 |
| 2.3.3 基于NS5B区和5'NCR区基因分型结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 研究人群临床指标分析 |
| 2.4.2 研究人群基因型分布特点 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 丙型肝炎病毒准种研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要试剂(试剂盒)及溶液配制 |
| 3.2.3 实验仪器设备 |
| 3.2.4 引物设计 |
| 3.2.5 实验方法及主要操作步骤 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 随访期间HCV患者分子及临床指标分析 |
| 3.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果 |
| 3.3.3 随访初期HCV准种变异程度较小者治疗病程转归 |
| 3.3.4 慢性HCV患者E2和NS5A区准种协同进化 |
| 3.3.5 BEAST软件分析HCV准种 |
| 3.3.6 E2区准种参数与临床指标的相关性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 慢性感染及病程转归患者体内HCV准种变化 |
| 3.4.2 慢性感染者体内HCV E2和NS5A区准种表现为协同进化 |
| 3.4.3 HCV准种进化动力学 |
| 3.4.4 HCV准种变化与临床指标之间没有相关性 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 HCV准种变异导致CTL免疫逃逸的初步研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要试剂(试剂盒)及溶液配制 |
| 4.2.3 实验仪器设备 |
| 4.2.4 实验方法及主要操作步骤 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 CTL抗原表位变异 |
| 4.3.2 CTL抗原肽合成 |
| 4.3.3 Elispot结果分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 Elispot检测原理 |
| 4.4.2 CTL免疫逃逸导致慢性感染的机制 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 研究人群的筛选及基因型确定 |
| 5.2 建立了多克隆测序法分析HCV E2和NS5A区准种变异 |
| 5.3 使用BEAST软件估算HCV准种动力学及其起源进化时间 |
| 5.4 初步建立Elispot方法分析HCV准种变异引起的CTL免疫逃逸 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（10）福建省丙型肝炎流行特征及体外细胞培养模型的构建与应用（论文提纲范文）
| 主要英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 福建省丙型肝炎的流行特征 |
| 第一章 自然人群丙型肝炎血清流行病学调查 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 福建省不同人群间 HCV 基因型分布特征 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 2004~2010 年丙型肝炎发病率趋势分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 体外细胞培养模型的构建及初步应用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、丙型肝炎病毒干扰素敏感决定区基因“盒”的研究（论文参考文献）
- [1]住院病人丙型肝炎病毒感染的筛查及快速筛查方法的评价[D]. 刘丽莉. 吉林大学, 2020(08)
- [2]丙型肝炎病毒复制子新型构建方法的建立及基因3a、6a型病毒株耐药性的研究[D]. 郭明哲. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [3]丙型肝炎病毒NS5B区基因耐药多态性研究[D]. 阳光. 广西医科大学, 2019(08)
- [4]宿主MDR1多态性及HCV基因组变异对慢性丙型肝炎抗病毒治疗复发的影响[D]. 王俊洁. 南方医科大学, 2015(01)
- [5]HCV-1b型基因变异与干扰素/利巴韦林疗效的相关性研究[J]. 毛源,苗盛巍,王伟,邱洁,沈传来,沈玲,胡朝晖,谢维. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2013(03)
- [6]HCV 1b亚型NS5A氨基酸变异对慢性丙型肝炎抗病毒治疗的影响[D]. 李京涛. 南方医科大学, 2012(04)
- [7]ISDR变异对聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗1b型慢性丙型病毒性肝炎疗效的影响[D]. 魏君锋. 南方医科大学, 2011(05)
- [8]丙型肝炎病毒5’非编码区及非结构蛋白5A的基因变异及其临床意义[D]. 张立新. 山东大学, 2011(12)
- [9]HCV准种变异特性及其免疫逃逸机制初步研究[D]. 何立华. 昆明理工大学, 2011(06)
- [10]福建省丙型肝炎流行特征及体外细胞培养模型的构建与应用[D]. 叶莺. 福建医科大学, 2011(09)