一、荧光探针定量PCR在检测HBV-DNA的应用（论文文献综述）
李茂仕[1]（2021）在《血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用》文中指出背景及目的:慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题,肝细胞内的共价闭合环状DNA（ccc DNA）是HBV难以彻底清除进而引起不同临床结局的根本原因,但因检测需依赖肝活检而难以临床普及;虽然外周血中无法直接检测ccc DNA,但可通过其他血清指标来反映ccc DNA的变化。目前,核苷（酸）类似物（NAs）是主要的抗HBV治疗手段,但并不能直接清除ccc DNA,绝大部分的慢性HBV感染者均需长期用药。尽管高耐药屏障NAs使用后发生耐药的几率较前大为减少,但因HBV突变的必然性和复杂性,耐药株的出现实际上是NAs长期治疗不可避免的临床问题。不同于乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）和HBV DNA,HBV RNA仅由ccc DNA转录产生且不受NAs治疗的影响,可较为真实反映肝内ccc DNA的表达情况。然而,HBV RNA检测尚无公认的标准化检测方法,其在慢性HBV感染者病情评估以及在NAs治疗耐药监测中的临床价值尚缺乏针对性研究。我们首先使用微滴数字PCR（dd PCR）技术建立了定量检测血清HBV RNA的方法,并使用商业化的实时荧光定量PCR方法进行对比评估以确保检测结果的准确性。然后我们观察了未治的慢性HBV感染者不同临床表型的血清HBV RNA水平,并追踪分析了恩替卡韦初治但在随访过程中发生了基因型耐药（GR）和部分病毒学应答（PVR）患者血清HBV RNA的动力学特征以及耐药突变情况,以期为血清HBV RNA应用于慢性HBV感染者病情评估以及监测耐药突变提供新的依据。方法:1.获取治疗和未治疗的慢性HBV感染者的血清各32例,平行使用dd PCR和商品化的q PCR方法检测血清HBV RNA水平,使用直线回归分析和Bland-Altman分析两种方法的相关性和一致性;以1例高浓度的HBV RNA样本进行梯度稀释,两种检测方法平行进行测定,每个梯度重复5次以明确两种方法的重复性,敏感性。2.根据常见临床指标将149例未治的慢性HBV感染者分为HBe Ag阳性伴ALT正常（EPNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（EPEA）、HBe Ag阴性伴ALT正常（ENNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（ENEA）等4种临床表型。使用q PCR法检测血清HBV RNA水平并在血清HBV DNA或/和HBV RNA阴性的患者中实施肝活检。使用单因素logistics回归分析探讨HBe Ag阴性患者中与ALT升高相关的危险因素。3.以31例HBe Ag阴性、HBV DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2倍正常参考值上限,ULN）的未治慢性HBV感染者为研究对象,检测其血清HBV RNA水平,肝活检Scheuer评分系统对肝脏炎症评分（G）≥2判定为显着性肝炎,以受试者工作曲线（ROC）探讨血清HBV RNA水平在鉴别显着性肝炎中的价值。4.在我院肝炎数据库中筛选出5例ETV初治的慢性乙型肝炎（CHB）患者,其中包含了在持续抗病毒治疗过程中被检出GR的患者3例以及未检出耐药的PVR患者2例。耐药突变的信息是采用一代测序针对血清HBV DNA检测得到。调取生物样本库中该患者从初治到随访终点之间的血清样本,以dd PCR方法检测血清HBV RNA水平,观察其与HBs Ag、HBV DNA动态变化的特征,并使用三代测序技术（TGS）对部分随访点的血清HBV RNA的反转录区进行耐药突变的长期监测。结果1.两种血清HBV RNA检测方法在未治疗组和治疗组中的直线回归系数（R2）分别为0.912和0.874,95%一致性界限分别为（-1.430,1.506）和（-1.533,1.648）。梯度稀释实验显示dd PCR法和商品化的q PCR法在血清HBV RNA≥2.0 log10 copies/m L时检出率均为100%,CV值分别介于2.29%～10.8%和3.11%～7.33%;但在血清HBV RNA<2.0 log10 copies/m L时,随着梯度稀释倍数的增加,检出率逐渐下降,最低检测下限（LLo D）分别约为61 copies/m L和15 copies/m L。dd PCR法和商品化的q PCR法在HBV RNA可测结果和稀释倍数之间存在显着性线性相关,R2分别为0.895和0.938,P<0.0001。2.EPNA、EPEA、ENNA和ENEA四种临床表型的可测血清HBV RNA水平(log10copies/m L)分别为6.02±1.48、6.54±1.27、2.51±0.78和3.54±1.25。HBV RNA低水平(<2.0 log10 copies/m L)中以ENNA表型为主（76.9%）,高水平(>6.0 log10 copies/m L)中以HBe Ag阳性表型（EPNA和EPEA）为主（98.1%）。在EPNA、EPEA和ENEA中,血清HBV RNA与血清HBV DNA显着正相关,相关系数（r）分别为0.868(P=9.480×10-9)、0.687(P=2.621×10-8)、0.769(P=6.686×10-9),但在ENNA表型中,两者没有显着性相关关系（r=0.324,P=0.075）。在EPNA、EPEA表型中,血清HBV RNA与HBs Ag呈现显着正相关,相关系数分别为0.777(P=2.999×10-6)和0.637(P=4.993×10-7),但在HBe Ag阴性表型中则无此显着相关性。血清HBV DNA和HBV RNA水平均是与HBe Ag阴性患者ALT升高相关的独立危险因素,比值比（OR）分别为2.650（1.640～4.282）,P=6.823×10-5和2.570（1.541～4.286）,P=2.971×10-4。血清HBs Ag水平则处于接近于显着性的状态（P=0.053）。7例血清HBV DNA阴性,但RNA阳性的患者肝组织活检均显示为中度或重度肝脏炎症（G≥2）。3.血清HBV RNA水平具有鉴别HBe Ag阴性、DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2×ULN）患者显着性肝炎的能力,受试者工作曲线下面积（AUC）为0.737（0.549,0.925）,P=0.029,而HBV DNA则不具有这种能力（P=0.248）。根据最大优登指数得出HBV RNA用于鉴别肝脏显着性炎症的最佳截断值为2.81 log10 copies/m L,此时敏感度73.7%,特异度66.7%,准确度71.0%。4.患者GR1、GR2和GR3分别在其抗病毒治疗第208、186及142周时检测出了耐药突变,在这时间点之前,3例患者血清HBV RNA持续>4.0 log10 copies/m L。2例PVR患者在我们观测的抗病毒治疗期间HBV RNA持续>6.0 log10 copies/m L。患者GR1和GR2在换用或者加用TDF之后,血清HBV RNA水平分别在此之后的26、22周时下降了1.63 log10和2.58 log10,HBV DNA水平则分别从4.40 log10和3.44 log10均降至LLo D,而HBs Ag则几乎没有变化(分别上升0.03log10和下降0.02log10)。3例GR患者和2例PVR患者的血清HBV RNA的RT区耐药位点突变结果与HBV DNA的耐药位点检测结果是一致的。利用三代测序技术对HBV RNA RT区长期监测发现,患者GR1和GR3在耐药发生之前没有观测到常见耐药位点的突变,而GR2患者则从初治开始就具备rt L180M+M204I突变。结论:1.我们使用dd PCR建立的方法和q PCR方法均是可靠的血清HBV RNA定量检测方法,低浓度血清样本的检出是困难的,但可以增加重复检测次数来改善;2.血清HBV RNA在不同临床表型中的水平存在差异,提示血清HBV RNA可以用于未治慢性HBV感染者病情的评估。血清HBV RNA与血清HBV DNA均是未治HBe Ag阴性患者ALT升高的独立危险因素,因此在血清HBV DNA阴性患者中检测HBV RNA是必要的,血清HBV RNA可补充HBV DNA用于反映肝脏炎症;3.在未经治疗的正常或者轻度ALT异常（ALT<2×ULN）的HBe Ag阴性患者中,血清HBV RNA可以用来判定肝脏炎症程度但HBV DNA不具备这样的能力,因此这部分患者可通过血清HBV RNA水平作为启动抗病毒治疗的依据;4.血清HBV RNA水平以及利用HBV RNA测序分析适合用于长期监测慢性乙型肝炎患者NAs抗病毒疗效和基因耐药突变的发生。总之,血清HBV RNA作为一个病毒学指标,可在血清HBV DNA阴性或者ALT<2×ULN的未治HBe Ag阴性患者中用于肝脏炎症的评估;血清HBV RNA也适合用于持续NAs治疗患者抗病毒疗效的评估以及耐药突变的长期监测,进而帮助临床医师为患者制定个体化管理和治疗策略提供参考依据。
余占娟,李向阳[2]（2020）在《PCR-荧光探针法检测HBsAg低反应性HBV基因型的初步评估》文中研究说明目的分析血清HBs Ag呈低反应性时PCR-荧光探针法检测HBV基因型的能力,比较和评价PCR-荧光探针法和测序法2种HBV基因型分型法。方法采用PCR-荧光探针法对血清HBs Ag定量<1 000 COI以及HBV DNA定量≥103IU/ml的51份患者标本进行HBV基因型检测;选取9份特征性标本,分别采用PCR-荧光探针法和测序法进行HBV基因型分型检测并进行HBV S区/前S区143S、118T、120P、145G位点以及Pre-S1缺失突变位点、Pre-S2ATG突变位点检测。结果 51份HBs Ag低反应性标本,成功分型出B型13份、C型38份。9份特征性标本PCR-荧光探针法成功分型5份,测序法分型8份。其中4份标本2种分型法结果一致,1份PCR法检出C型而测序法B型。未发现HBV S区/前S区变异。结论 PCR-荧光探针法检测HBV基因型基本可以满足临床需求,但当血清中HBs Ag呈极低反应性时,即使HBV DNA定量达到分型要求,也容易出现分型失败的情况,考虑联合测序法对低反应性标本进行HBV基因型检测。
白雪丁[3]（2020）在《重组酶介导的等温扩增技术（RAA）检测乙型肝炎病毒方法的建立与评估》文中认为目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）是一种广泛流行的血液传播病原体,与肝硬化和肝细胞癌的发生有关,尤其是在HBV高度流行且医疗资源有限的东南亚和非洲国家。因此,简单快速和便携式的现场检测方法对于有效监测HBV感染至关重要。研究基于重组酶介导的等温扩增技术（Recombinase-aid amplification,RAA）结合核酸热裂解处理,建立两种可现场应用的HBV-DNA检测方法。一种是使用便携式实时荧光检测设备的含内参的双重实时荧光RAA法,另一种是结合测流层析试纸条的可视化分析的试纸条法（Lateral flow dipstick,LFD-RAA）。对这两种方法进行临床应用评价。方法依据乙型肝炎病毒保守序列,参照设计原则设计引物探针,分别建立含内参的双重实时荧光RAA方法和LFD-RAA法,加以核酸热裂解前处理。以HBV阳性定量标准品为模板进行灵敏度检测;以HBV-DNA阴性的血清样本,巨细胞病毒和EB病毒阳性的血液标本为模板进行特异性检测。对来自河北157份临床样本,分别采用达安公司商业化实时荧光定量PCR试剂盒与双重实时荧光RAA和LFD-RAA方法进行平行检测,运用SPSS 21.0对两方法进行Kappa一致性分析,评估临床应用效能。结果实验已建立的核酸热裂解结合双重实时荧光RAA法和LFD-RAA法最低可检测到病毒载量为10 IU/m L的标准品,与血液中其他DNA病毒并无交叉反应,特异性好。在157份临床样本检测中,与q-PCR相比,检测灵敏度分别为97.18%,95.77%,特异性均为100%。结论研究已建立了双重实时荧光RAA方法和LFD-RAA方法检测乙型肝炎病毒,无需常规核酸提取,以热裂解为原理完成核酸前处理。该方法可在医疗资源有限的情况下进行HBV感染检测,适用于基层及临床快速诊断,在现场及时检测中展现巨大潜力。图8幅;表5个;参47篇。
陈彦猛[4]（2020）在《调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子鉴定及相关机制研究》文中指出目的:乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是一个严重危及人类健康的公共卫生问题,全球大约有2.57亿慢性HBV感染患者,此类患者可进展为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）、肝硬化（liver cirrhosis,LC）和原发性肝细胞癌（hepatocellulor carcinoma,HCC）等相关疾病。我们课题组前期研究发现HBV感染肝细胞后,宿主天然免疫因子APOBEC3B在病毒复制的逆转录环节通过脱氨基作用编辑病毒颗粒中的DNA,通过尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase,UNG）介导的碱基切除修复（base excision repair,BER）途径降解病毒DNA,从而显着抑制HBV复制。但是在此过程中,参与调控APOBEC3B抗病毒功能的宿主因子研究甚少。因此本研究利用蛋白质质谱技术,结合生物信息学分析,筛选了参与调控APOBEC3B抑制病毒复制的关键宿主因子,并阐明了HSP70或DHX9调控APOBEC3B抗病毒的分子机制。研究结果有助于深入阐明宿主因子调控APOBEC3B与病毒相互作用的分子机制,理解病毒持续性感染的机制,同时,细化、区分宿主因子是否通过调控APOBEC3B脱氨酶功能或调控APOBEC3B与病毒核心蛋白/RNAs结合来调控APOBEC3B的抗病毒作用,有助于为新的抗病毒靶点确定提供理论依据。方法:第一部分:筛选参与调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子:首先在HEK293T细胞中分别转染HA-APOBEC3B表达质粒和/或HBV表达质粒,利用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）富集和蛋白质质谱技术鉴定与APOBEC3B相互结合的宿主蛋白,基于GO功能信息构建了蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络,筛选出与APOBEC3B相互作用的蛋白质家族:热休克蛋白（heat shock protein,HSP）家族和RNA解旋酶（DEAD-box RNA helicase,DDX）家族。进一步利用siRNA技术分别沉默内源性HSP家族蛋白（包括HSP70,HSP90和GRP78）和DDX家族蛋白（包括DDX3,DDX5,DHX9）的表达,筛选出参与调控APOBEC3B抑制HBV复制的关键宿主蛋白HSP70和DHX9。第二部分:HSP70促进APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究:首先采用Southern blot检测过表达HSP70对病毒DNA复制的影响;通过定点突变技术构建了HSP70 ATPase酶活性突变体（D10N,K71A,K77A和E175S）,研究了HSP70酶活性对APOBEC3B抗病毒功能的影响;利用HSP70特异性抑制剂VER155008,探索HSP70酶活性抑制后,APOBEC3B抑制病毒复制的变化;利用APOBEC3B催化编辑底物的特异性荧光探针,研究体外HSP70对APOBEC3B的脱氨酶活性的影响;利用3D-PCR和克隆测序在细胞模型上验证了HSP70对APOBEC3B编辑HBV DNA的变化;最后利用co-IP和GST Pulldown技术研究了HSP70与APOBEC3B直接相互作用的区段。第三部分:DHX9拮抗APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究:首先应用co-IP和GST Pulldown技术研究了DHX9与APOBEC3B的直接结合作用;通过siRNA沉默内源性DHX9表达,研究了DHX9对APOBEC3B抗病毒功能的变化;在LPP-APOBEC3B-Huh7稳定表达细胞系和NTCP-HepG2的HBV感染模型中过表达DHX9,研究DHX9对APOBEC3B抗病毒作用的影响;通过荧光底物探针法和3D-PCR技术检测了DHX9在体外对APOBEC3B编辑酶活性的影响;应用co-IP方法检测了DHX9对APOBEC3B与HBc蛋白结合的影响;采用定点突变技术,构建了DHX9的3个区段缺失突变体:DHX9-△N（△3-252aa）,DHX9-△C（△1173-1260 aa）和DHX9-△N△C（△3-252 aa,△1173-1260 aa）,通过co-IP技术筛选出DHX9与APOBEC3B相互作用的关键区段,探索DHX9对APOBEC3B拮抗作用是否依赖于两者结合;通过干扰和过表达DHX9,分别在HEK293T转染-复制模型和HepAD38稳定HBV复制模型中通过RNA-IP和锚定PCR方法探索了DHX9拮抗APOBEC3B与HBV pgRNA的结合。结果:第一部分:筛选参与调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子:蛋白质质谱分析结果表明:HBV感染肝细胞后,有126种宿主蛋白可能与APOBEC3B相互作用。PPI分析表明,与APOBEC3B相互结合的宿主因子主要参与了蛋白质折叠、mRNA代谢和病毒复制等过程。癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库分析表明,HBV感染的HCC样本中,APOBEC3B mRNA表达与HSP70 mRNA表达呈正相关性（r=0.13103,p=0.0075）,但与GRP78（r=-0.1757,p=0.1371）和HSP90（r=0.0212,p=0.8585）的表达均无相关性;特异性干扰HSP70蛋白表达后,APOBEC3B抑制病毒复制的作用减弱;特异性干扰DHX9表达后,APOBEC3B抑制病毒复制的作用增强。第二部分:HSP70促进APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究:过表达HSP70后,HBV DNA水平下降,呈浓度依赖性;HSP70 ATPase酶活性丧失后,不影响APOBEC3B抗病毒作用;随着HSP70特异性抑制剂VER155008浓度逐渐升高,APOBEC3B抗病毒作用逐渐减弱;荧光底物探针法分析显示过表达HSP70后,APOBEC3B对底物探针的编辑作用明显增强,APOBEC3B敲除或加入VER155008后,HSP70丧失对APOBEC3B编辑底物的能力;3D-PCR和克隆测序结果显示,HSP70增强了APOBEC3B对病毒DNA的编辑能力;co-IP和GST Pulldown实验证实了HSP70与APOBEC3B发生了直接结合作用。第三部分:DHX9拮抗APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究:DHX9与APOBEC3B发生直接结合作用,当HBV感染后,DHX9与APOBEC3B结合作用增强;干扰内源性APOBEC3B表达后,DHX9促进HBV复制作用减弱;在LPP-APOBEC3B-Huh7的稳定表达细胞模型和NTCP-HepG2的HBV感染模型中干扰内源性DHX9表达后,APOBEC3B抑制HBV复制作用增强;过表达或干扰DHX9不改变APOBEC3B编辑HBV DNA的作用;DHX9不改变APOBEC3B与HBc的结合作用;DHX9 dsRBDs和RGG区段是其与APOBEC3B相互结合的重要区段,并且DHX9发挥拮抗APOBEC3B的功能需要两者的结合作用;干扰DHX9表达后,APOBEC3B与3.5 kb HBV RNA结合增强,过表达DHX9后,APOBEC3B与3.5 kb HBV RNA结合减弱;锚定PCR结果显示,与APOBEC3B结合的RNA为HBV pgRNA。结论:当HBV感染肝细胞时,APOBEC3B发挥抑制病毒复制的作用。同时宿主因子HSP70通过增强APOBEC3B的脱氨酶活性,正向促进APOBEC3B抗病毒功能;而HBV诱导DHX9表达上调,表达上调的DHX9通过N端dsRBDs区域和C端RGG区域结合APOBEC3B,在肝细胞核内拮抗了APOBEC3B与HBV pgRNA的结合,从而部分减弱了APOBEC3B的抗病毒功能。
韦武均[5]（2020）在《反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究》文中研究指明第一章HBV C编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定目的:针对乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）编码链C基因设计合成反基因锁核酸（locked nucleic acid,LNA）片段,以HBV转基因小鼠为研究对象,筛选出最佳给药剂量、给药途径和给药方式。方法:针对乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点,利用RNAstructure 5.0软件设计合成反基因LNA片段5ˊ-CGA*CGCGGCGA*T*TGA*-3ˊ,设置不同给药剂量组、给药途径组和给药方式组,以阳离子聚合物介导转染HBV转基因小鼠,分别于给药前、给药后1、3、5和7 d,采集眼眶静脉血,采用PCR荧光探针法和磁微粒化学发光法检测血清HBV DNA和HBs Ag、HBe Ag含量。采用单链特异性核酸内切酶酶切实验鉴定LNA片段稳定性。结果:给药后第7d,0.5μg/g剂量组、尾静脉注射组和1次/48h给药组对病毒HBV DNA复制和HBs Ag、HBe Ag表达抑制效果较明显,HBV DNA复制抑制率分别为57.09%、56.61%和57.22%,HBs Ag表达抑制率分别为49.29%、48.65%和48.41%,HBe Ag分别为71.72%、69.95%和69.44%。LNA抗核酸酶降解能力较强。结论:LNA片段5ˊ-CGA*CGCGGCGA*T*TGA*-3ˊ的最佳给药剂量为0.5μg/g,给药途径为尾静脉注射,给药方式为1次/48h。第二章反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达目的:探讨针对乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点的反基因LNA在HBV转基因小鼠体内的抗病毒效果。方法:将30只HBV转基因小鼠完全随机分为5组,每组6只,分别为5%GLU空白对照组、无关序列对照组、拉米夫定对照组、反义LNA对照组和反基因LNA实验组,采用尾静脉注射法对5%GLU空白对照组、无关序列对照组、反义LNA对照组和反基因LNA实验组给药,采用连续灌胃法对拉米夫定对照组给药,分别于给药前、给药后1、3、5和7 d,采集眼眶静脉血,采用PCR荧光探针法和磁微粒化学发光法检测血清HBV DNA和HBs Ag、HBe Ag含量,利用RT-PCR法和免疫组化技术检测肝脏HBV Cm RNA和HBs Ag、HBe Ag表达水平。通过HE染色和血常规、生化指标判断反基因LNA对肝肾细胞结构和功能的改变。结果:给药后第1、3、5和7d,反基因LNA组对HBV DNA复制和HBs Ag、HBe Ag表达均有较明显的抑制效果,HBV DNA复制抑制率分别为20.68%、45.66%、52.33%和55.68%,HBs Ag表达抑制率分别为20.44%、36.17%、44.90%和47.87%,HBe Ag分别为35.65%、54.29%、65.08%和72.67%,与对照组比较,差异有统计学意义,P<0.05;肝脏HBV C m RNA相对表达量和HBs Ag、HBcAg阳性细胞率为0.36和38.20%、32.50%,与对照组比较,差异有统计学意义,P<0.05。HE染色和血常规、生化指标未发现肝肾细胞结构和功能有明显改变。结论:乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点是反基因LNA治疗的有效靶点。
王珊[6]（2019）在《基于CRISPR技术的乙肝病毒DNA及YMDD耐药突变高灵敏检测技术研究》文中认为慢性乙型肝炎（以下简称乙肝）是目前最突出的全球性公共卫生问题之一,严重威胁人类健康。尽管近些年乙肝疫苗的使用有效降低了乙肝的发病率,每年仍有1-3千万人感染乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）,约有1百万人死于HBV感染及其并发症。为了有效地控制HBV的传播,确保HBV感染者得到及时的治疗,对HBV的高效检测尤为重要。而针对HBV DNA的核酸检测技术由于其具有灵敏度高、特异性强等优势,已广泛应用于乙肝的诊断、监测、预后评价和输血筛查等方面。然而,目前临床上仍有部分HBV感染者体内存在现有方法难以检出的低浓度HBV DNA,这不仅增加了由此引发的慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的发病风险,还可能造成输血以及肝移植过程中的HBV感染。此外,对乙肝病毒耐药突变的检测和监测可预防由此引发的抗病毒治疗失败。但由于“准种”的存在,部分患者体内存在难以检出的极低含量的HBV耐药突变株,在某种情况下,如肝移植、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）合并感染等,这些未检出的低含量HBV耐药突变株,可能带来严重的临床后果（如HBV感染、肝衰竭等）。因此,研发一种高灵敏度的HBV DNA和耐药突变检测技术对乙肝的防治具有重大现实意义。近年来,新的RNA靶向系统CRISPR-Cas13a已被开发为一种可检测痕量核酸的高灵敏、高特异检测技术,通过结合RPA等温扩增技术可实现对单拷贝核酸和单碱基突变的准确检测和鉴定。相比检测成本高、稳定性差的等温扩增技术,基于PCR技术的核酸检测方法具有更高的临床实用性。因此,在本研究中,我们首次基于PCR扩增技术和CRISPR-Cas13a系统建立了针对HBV DNA及耐药突变的高灵敏、高特异核酸检测技术（PCR-CRISPR）,可实现对低至单拷贝HBV DNA的高灵敏检测。通过临床样本的验证,该方法对HBV DNA的检测灵敏度高于qPCR,达到甚至超过了数字PCR（ddPCR）的检测灵敏度。同时,我们还基于上述方法建立了针对乙肝YMDD耐药突变的高灵敏检测技术,可以特异性地检测出低至单拷贝耐药突变株,并在极低病毒载量临床样本中,鉴定出了qPCR无法检出的YMDD耐药突变株。1.建立基于PCR-CRISPR技术的高灵敏度HBV DNA检测方法通过LwCas13a蛋白的诱导表达、纯化及活性鉴定,获得了具有良好RNA酶活性的LwCas13a蛋白,纯度可达96%;通过比对不同基因型HBV聚合酶区（P区）的基因序列,我们在保守区设计并筛选出可以高效检测HBV DNA的crRNA。建立了基于PCR扩增、转录、crRNA识别及LwCas13a激活、报告RNA剪切及荧光检测的新型核酸检测技术:PCR-CRISPR。并实现了对低至单拷贝HBV DNA的高灵敏检测。2.利用PCR-CRISPR技术检测血清样本中HBV DNA我们利用PCR-CRISPR方法对32份已知血清样本进行HBV DNA的检测,检测结果（16份阴性,16份阳性）与qPCR一致。通过对280份未知血清样本的检测,进一步探索了该方法对临床样本HBV DNA检测的敏感度和特异性。检测结果显示,90份qPCR检测为HBV DNA阳性的血清样本和180份qPCR检测阴性的血清样本均被PCR-CRISPR成功检出。同时,对于10例qPCR判定为阴性的血清样本,PCR-CRISPR方法和ddPCR均检测出了痕量的HBV DNA（浓度约1.2-5.4拷贝/反应）。随后,我们利用PCR-CRISPR方法和ddPCR对该10例痕量样本分别进行了10次重复检测,结果显示PCR-CRISPR平均检出次数为7次,而ddPCR平均检出次数为3次。通过查阅患者的临床信息我们发现,其中6例患者存在慢性乙肝病史,2例显示为HBV感染者。以上结果表明,新建立的PCR-CRISPR方法对HBV DNA检测的灵敏度明显高于qPCR,达到甚至高于ddPCR的检测灵敏度。3.建立基于PCR-CRISPR技术的乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法通过对HBV YMDD区序列的保守性分析,我们设计并筛选了分别针对YVDD和YIDD耐药突变的crRNAs并建立了针对上述两种耐药突变的PCR-CRISPR检测方法。该技术可在PCR扩增后10 min内检测出低至单个拷贝的YVDD突变株,和100个拷贝的YIDD耐药突变株。该方法还可以通过荧光强度有效区分1 copy的YVDD突变株与106 copy的野生株。在本部分研究表明,新建立的PCR-CRISPR乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法,可以实现对乙肝YMDD耐药突变株的快速、高灵敏检测。4.利用PCR-CRISPR技术检测血清样本中乙肝病毒YMDD耐药突变利用qPCR、直接测序法和PCR-CRISPR方法,我们对424份血清样本进行了YMDD耐药突变的检测,结果显示,3种方法均检测出了27例血清样本（HBV DNA>100 IU/mL）中的YMDD耐药突变（5例YVDD和22例YIDD）;此外,qPCR和PCR-CRISPR 2种方法均检出了18例直接测序法未检出的YMDD耐药突变（5份YVDD和13份YIDD）;值得一提的是,PCR-CRISPR方法还在12例HBV DNA浓度低于100 IU/mL的血清样本中,检测出了qPCR和直接测序法均未检出的YMDD耐药突变（4例YVDD和8例YIDD）。以上结果表明,该技术可用于血清样本中YMDD耐药突变株的高灵敏检测,尤其适用于对低浓度HBV DNA血清样本中耐药突变的检测。综上,本研究首次将PCR扩增技术和CRISPR-Cas13a检测技术结合,建立了基于PCR-CRISPR技术的乙肝病毒DNA和YMDD耐药突变的高灵敏度、高特异性的检测方法。该方法可以用于对血清中低浓度HBV DNA的高灵敏检测,对降低输血和肝移植中HBV感染的风险、减少抗病毒治疗停药后的乙肝复发率,制定合适的抗病毒治疗方案具有重大临床意义。此外,本研究也为将该方法用于对其它病原的高灵敏高特异核酸检测奠定了理论和技术基础。
杨佳佳[7]（2019）在《核酸适配体介导的FRET探针构建及靶向识别效应研究》文中认为实现食品安全及疾病相关生物分子的靶向识别及检测是食品安全控制与疾病精准诊断的首要前提。核酸适配体因易于合成修饰,对靶标具备高度专一亲和识别性能而成为生物分子靶向识别的一种理想载体;量子点、氧化石墨烯等新型纳米光学材料的出现为各种生物识别传感探针的构建提供了全新信号转换基底;基于荧光物质之间纳米尺度距离变化响应的非辐射荧光共振能量转移（FRET）机制为生物分子间靶向识别效应传感及探针构建提供了一种有效模式。论文围绕以提高探针靶向性与灵敏性从而实现与食品安全和疾病诊断密切相关的生物分子的精准检测为目标,基于FRET机制,借助核酸适配体对靶标分子的靶向识别性能,以量子点、氧化石墨烯为能量供受体对,通过对能量供受体对的修饰组装,并以核酸适配体作为能量供受体对之间信号响应调节的关键介导,构建了四种核酸适配体介导的FRET探针,主要内容如下:1.针对细菌内毒素（脂多糖）对食品安全及人体健康的潜在危害及快速检测细菌内毒素的现实需求,采用6-羧基罗丹明标记的脂多糖适配体作为荧光靶向探针,氧化石墨烯作为荧光猝灭剂,基于脂多糖适配体对脂多糖的特异识别性能和氧化石墨烯的荧光猝灭性能,构建了一种可简单、快速靶向识别脂多糖的FRET探针,在优化的实验条件下,所构建的探针对脂多糖具有良好的检测性能,线性范围为25–1600 ng mL-1,检出限为15.7 ng mL-1,可用于果汁、啤酒等饮料中脂多糖含量的定量检测,具备一定的实际应用性能。2.借助量子点优越的光学性能、核酸适配体对目标分子的靶向识别性能及氧化石墨烯的荧光猝灭性能,针对胰岛素常规检测方法操作过程繁琐的不足,构建了一种适配体介导的量子点/氧化石墨烯复合FRET探针,在适配体介导下,胰岛素适配体修饰的量子点可有效吸附于氧化石墨烯表面,量子点荧光被氧化石墨烯猝灭,体系中存在胰岛素时,由于适配体与胰岛素的高亲和识别作用将导致适配体空间构象发生改变,阻止适配体修饰的量子点与氧化石墨烯的有效结合并实现其荧光恢复,在最优实验条件下,所构建探针对胰岛素的检测线性范围为4.3-206.4 nM,检出限为2.74 nM,适用用于医药制剂中胰岛素含量的快速标定,且检测过程操作简单、便捷。3.在通过量子点/氧化石墨烯构建FRET探针实现单一目标物检测的基础上,基于量子点多色荧光性质及氧化石墨烯广谱的荧光猝灭性能可构建多组分生物分子同步检测探针为可能,以实现甲肝、乙肝、丙肝三种肝炎病毒核酸同步检测为目标,采用甲肝、乙肝、丙肝三种病毒核酸互补配体为修饰剂,分别对三种同源激发、发射波长不同的CdSe/ZnS QDs量子点（发射波长分别为525nm,585nm和632nm）进行了修饰,获得了三种核酸配体修饰量子点并作为荧光能量供体,同时以氧化石墨烯为荧光能量受体,通过核酸配体与目标核酸序列靶向识别作用的介导实现了量子点与氧化石墨烯之间的能量转移,实现了三种肝炎标志物的同步检测,构建的探针为肝炎病毒的快速诊断和分型提供了新思路,也为基于多色量子点实现多组分生物分子的同步检测提供了点滴借鉴。4.基于能量供受体的光学性质对FRET探针的检测性能的影响,以提高氧化石墨烯的荧光猝灭性能从而增强FRET探针的信号转导效率,并进一步构建高灵敏FRET探针为目标,在对氧化石墨烯羧基功能化的基础上,选择黑洞荧光猝灭剂BHQ-2为修饰剂,通过共价缩合将BHQ-2交联于羧基化氧化石墨烯表面,制备了一种BHQ-2修饰的氧化石墨烯复合荧光猝灭剂（GO@BHQ-2）;BHQ-2修饰的氧化石墨烯作为一种双重能量受体可高效的猝灭量子点的荧光,相对于单纯的氧化石墨烯而言,GO@BHQ-2对量子点的荧光猝灭效率可提高2.4倍,从而可作为一种荧光超猝灭剂用于荧光探针的构建;在此基础上进一步以蓖麻毒素（RTB）适配体修饰的量子点为荧光供体,GO@BHQ-2为荧光受体,以适配体为介导,构建了一种检测蓖麻毒素的FRET探针,检测蓖麻毒素的线性范围为0.05-3.0μg mL-1,检出限为0.037μg mL-1;通过标准加样回收实验证实所构建的探针可用于实际样品中RTB选择性检测,从而为RTB的快速检测提供一种新的技术方法,也为氧化石墨烯改性修饰提供了一定的思路。总之,本文以荧光能量共振转移为靶向识别探针构建原理,以适配体功能化量子点、氧化石墨烯为能量供受体对,基于核酸适配体对目标分子的靶向识别性能及与氧化石墨烯的独特吸附性能,通过适配体介导调节能量供受体对之间的荧光能量转移效率,构建了与食品安全和疾病诊断密切相关生物分子的FRET探针,为基于功能化量子点及改性氧化石墨烯等构建靶向识别荧光探针提供了一定的依据。
陈朝霞[8]（2019）在《家蝇抗菌肽Cecropin抗HBV作用机制研究》文中提出研究目的:拟根据HBV（Hepatitis B virus,HBV）感染细胞的关键事件,探讨家蝇抗菌肽Cecropin（Musca domestica cecropin,MDC）抗HBV感染作用机制;外泌体作为细胞间交流的新方式,可携带病毒感染相关生物学信息,对病毒感染最终的结局有着重要的影响,本实验旨在探索HepG2.2.15细胞上清来源的外泌体是否介导HBV感染,MDC是否干预外泌体介导的HBV感染过程。研究方法:1.家蝇抗菌肽Cecropin抗HBV作用机制研究:（1）Hi-Trap肝素亲和层析柱法纯化HBV颗粒;电镜负染观察HBV形态。（2）MTT实验检测药物对HepaRG细胞增殖影响;12天感染实验中利用Real-time PCR实验检测MDC对HBV黏附/进入及进入后阶段的影响;激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测HBV黏附细胞阶段加入药物对感染率的影响;MTT实验检测药物对HepG2.2.15细胞毒性作用,Real-time PCR、ELISA、激光共聚焦显微镜及Western blotting检测MDC对HepG2.2.15细胞内HBV复制的影响。（3）激光共聚焦显微镜观察MDC在细胞内分布及定位;Real-time PCR、Western blotting检测MDC对JAK/STAT信号通路的影响。2、家蝇抗菌肽Cecropin抑制外泌体介导的HBV感染作用研究:（1）试剂盒提取HepG2.2.15细胞上清中外泌体（HepG2.2.15-EXO）;电镜负染检测外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径,Western blotting检测外泌体标志性蛋白,PCR技术检测外泌体是否含HBV核酸成分;超高分辨率活细胞3D显微成像仪观察外泌体在细胞内的定位;（2）流式细胞术检测外泌体在细胞中的扩散与传递,ELISA,Real-time PCR,ICC,Western blotting检测HepG2.2.15-EXO是否介导HBV的感染,及探讨MDC是否干预外泌体介导的HBV感染;（3）流式细胞术检测外泌体浓度、共同孵育时间温度、肝素及肝素酶对外泌体在细胞间扩散传递的影响;Real-time PCR检测肝素及肝素酶对细胞内HBV-DNA的表达影响;研究结果:1、家蝇抗菌肽Cecropin抗HBV作用机制研究:（1）电镜观察显示MDC作用后HBV颗粒结构破坏,并发生凝集反应;（2）在HBV攻击细胞前或后加入药物干预,结果显示MDC能使细胞HBV相关指标（细胞内HBV-DNA,HBVcccDNA,pgRNA含量）降低,在HBV的黏附/进入及进入后阶段均发挥了抑制作用;MDC可显着降低HepG2.2.15细胞上清中HBsAg、HBeAg抗原及HBV DNA含量,细胞内HBsAg、HBcAg蛋白含量,具有抑制HBV复制作用。（3）激光共聚焦显微镜观察显示MDC作用位点主要在细胞膜,细胞质及细胞核也有结合;且MDC能激活JAK/STAT抗病毒信号通路,发挥抗病毒作用。2、家蝇抗菌肽Cecropin抑制外泌体介导的HBV感染作用研究:（1）对试剂盒法提取的外泌体,进行电镜形态学检测,纳米颗粒跟踪技术的粒径检测,及外泌体标志性蛋白检测,确定提取的为外泌体,可以进行后续实验;PCR技术核酸检测显示外泌体中存在HBV核酸;（2）流式细胞术、ELISA、ICC、Western blotting及Real-time PCR实验结果显示经外泌体共同孵育的正常肝细胞HBV呈阳性表达,而家蝇抗菌肽Cecropin作用后,上述细胞内HBV相关指标的表达显着降低;（3）外泌体浓度、共同孵育时间、共同孵育温度、肝素、肝素酶对外泌体在细胞间扩散传递有一定影响。结论:家蝇抗菌肽Cecropin可破坏HBV病毒颗粒结构,并使其发生凝聚;此外其对HBV病毒生命周期中的黏附/进入阶段及进入后的复制阶段均有抑制作用;MDC可通过激活抗病毒信号通路,发挥其抗病毒作用;提示MDC抗HBV作用机制复杂,涉及多个靶点;此外HepG2.2.15细胞上清来源的外泌体可介导HBV感染,而MDC对外泌体介导的HBV感染具有显着抑制作用。
杨正南[9]（2018）在《乙型肝炎病毒表面抗原低水平阳性与乙肝病毒核酸载量的相关性》文中指出目的 :探究血清中乙型肝炎病毒表面抗原（HBs Ag）低水平阳性与乙肝病毒核酸载量之间的关系。方法 :选取2014年6月至2016年5月期间江苏省南京鼓楼医院集团仪征医院收治的80例疑似HBs Ag低水平阳性患者作为研究对象。采用磁微粒化学发光法对这些患者进行HBs Ag检测。然后,再采用PCR-荧光探针法对被诊断为HBs Ag低水平阳性的患者进行HBV-DNA（乙肝病毒-DNA）载量检测。结果 :采用磁微粒化学发光法对这80例患者进行HBs Ag检测的结果显示,在这80例患者中,仅有23例患者的HBs Ag呈低水平阳性（占28.75%）。然后,再采用PCR-荧光探针法对上述23例患者进行HBV-DNA载量检测。结果显示,在这23例患者中,只有15例患者的血清中含有HBV-DNA（占65.22%）,其HBV-DNA的平均核酸载量值为7.306。结论 :当患者的HBs Ag呈低水平阳性时,并不能表明其已感染了HBV,只能推断出其体内含有HBV的外壳,而HBV外壳的核心内是否具有HBV-DNA,还需要结合血清病毒核酸载量检测来判断。因此,只有患者HBs Ag呈低水平阳性或阳性,且合并病毒核酸载量值异常时,才可诊断其患上了乙型病毒性肝炎。
陈朝霞,刘阿龙,唐亚男,汪洁,朱家勇,卢雪梅[10]（2017）在《SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响》文中指出目的建立SYBR GreenⅠReal-time PCR检测HBV-DNA方法,并检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响。方法提取HepG2.2.15细胞DNA,PCR扩增后纯化,PCR纯化产物梯度稀释作为标准品,采用SYBR GreenⅠReal-time PCR检测,建立标准曲线,并分析方法的特异性、灵敏度、重复性和稳定性。运用建立的SYBR GreenⅠ方法检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响,并与Taqman方法进行比较。结果 SYBR GreenⅠReal-time PCR方法特异性、重复性及稳定性均较好,线性范围为107102copies,检测灵敏度可达102copies。IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA具有抑制效果,且呈剂量依赖性。SYBR GreenⅠ方法与Taqman商业试剂盒检测结果差异无统计学意义。结论 SYBR GreenⅠReal-time PCR方法简便快速、结果准确、价格低廉,可以满足HBV-DNA拷贝数检测的需要。
二、荧光探针定量PCR在检测HBV-DNA的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、荧光探针定量PCR在检测HBV-DNA的应用（论文提纲范文）
（1）血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 微滴数字PCR用于血清HBVRNA定量方法的建立及与实时荧光定量PCR方法的对比评价 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 血清HBV RNA在未治慢性HBV感染者中的分布特点及其临床意义 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 恩替卡韦耐药及部分病毒学应答患者血清HBV RNA动力学特征以及用于长期监测耐药突变的初步研究 |
| 4.1 研究对象和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结与研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性乙型肝炎血清学标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（2）PCR-荧光探针法检测HBsAg低反应性HBV基因型的初步评估（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2仪器与试剂 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 PCR-荧光探针法 |
| 1.3.2 Sanger测序法 |
| 1.3.3 HBV S区/前S区变异检测 |
| 1.3.4 结果计算 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR-荧光探针法HBV基因型检出结果 |
| 2.2 巢式PCR结合Sanger法测序HBV基因型检出结果 |
| 2.3 2种方法检测结果一致性 |
| 2.4 HBV S区/前S区变异检测结果 |
| 3 讨论 |
（3）重组酶介导的等温扩增技术（RAA）检测乙型肝炎病毒方法的建立与评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 含内参的双重实时荧光重组酶介导的等温扩增技术检测乙型肝炎病毒方法的建立与评估 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 临床样本 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物、探针设计原则 |
| 1.2.2 引物、探针设计与合成 |
| 1.2.3 内参质粒的制备 |
| 1.2.4 阳性质控品的制备 |
| 1.2.5 核酸提取 |
| 1.2.6 单重实时荧光RAA法建立与灵敏度分析 |
| 1.2.7 双重实时荧光RAA法建立与内参浓度优化 |
| 1.2.8 双重实时荧光RAA方法灵敏度和特异性检测 |
| 1.2.9 临床样本检测 |
| 1.2.10 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 单重实时荧光RAA法灵敏度 |
| 1.3.2 双重实时荧光RAA法内参质粒浓度优化 |
| 1.3.3 双重实时荧光RAA法灵敏度与特异性 |
| 1.3.4 临床样本检测 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 乙型肝炎病毒核酸热裂解与双重重组酶介导的等温扩增检测方法的建立及初步应用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 HBV阳性标准品及临床样本 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物和探针设计及合成 |
| 2.2.2 核酸热裂解 |
| 2.2.3 核酸热裂解结合双重实时荧光RAA扩增方法的建立 |
| 2.2.4 核酸热裂解结合双重实时荧光RAA扩增方法灵敏度和特异性检测 |
| 2.2.5 临床样本检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 核酸热裂解结合双重实时荧光RAA扩增方法灵敏度和特异性检测 |
| 2.3.2 临床样本检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第3章 侧流层析试纸条结合重组酶介导的等温扩增技术对乙型肝炎病毒核酸粗提取检测方法的建立及初步应用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 HBV阳性标准品及临床样本 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物和探针设计及合成 |
| 3.2.2 核酸热裂解 |
| 3.2.3 核酸热裂解结合LFD-RAA扩增方法的建立及反应条件优化 |
| 3.2.4 核酸热裂解结合LFD-RAA扩增方法灵敏度与特异性检测 |
| 3.2.5 临床样本检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 反应条件优化 |
| 3.3.2 核酸热裂解结合LFD-RAA扩增方法灵敏度与特异性检测 |
| 3.3.3 临床样本检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第4章 综述 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 HBV病原学及流行病学特征 |
| 4.3 变温核酸检测 |
| 4.3.1 聚合酶链反应 |
| 4.3.2 连接酶链反应 |
| 4.4 等温核酸检测 |
| 4.4.1 环介导等温扩增技术 |
| 4.4.2 依赖核酸序列的扩增技术 |
| 4.4.3 滚环扩增技术 |
| 4.4.4 转录介导扩增 |
| 4.4.5 重组酶介导的等温扩增 |
| 4.5 基因测序 |
| 4.6 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（4）调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子鉴定及相关机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 :筛选参与调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 :HSP70 促进APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 :DHX9 拮抗APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间撰写和发表的论文 |
（5）反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一章 HBVC编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HBV转基因小鼠体内病毒活性与亚型检测结果 |
| 2.2 LNA稳定性鉴定结果 |
| 2.3 给药剂量对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 2.4 给药途径对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 2.5 给药方式对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 3 讨论 |
| 第二章 反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 反基因LNA对 HBV病毒DNA复制的影响 |
| 2.2 反基因LNA对 HBV病毒C-m RNA表达的影响 |
| 2.3 反基因LNA对 HBV病毒HBs Ag、HBe Ag表达的影响 |
| 2.4 反基因LNA对 HBV病毒HBcAg表达的影响 |
| 2.5 反基因LNA对肝肾脏细胞结构和功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 抗乙型肝炎病毒免疫治疗研究新进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（6）基于CRISPR技术的乙肝病毒DNA及YMDD耐药突变高灵敏检测技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、研发针对乙肝病毒DNA的高灵敏检测技术对乙肝的防治至关重要 |
| 1.1 乙肝的流行概况 |
| 1.2 高灵敏HBV DNA检测的临床意义 |
| 1.3 现有HBV DNA检测技术仍存在诸多不足 |
| 二、研发针对乙肝病毒耐药突变的早期检测技术是实现精准治疗的关键 |
| 2.1 乙肝病毒耐药概述 |
| 2.2 高灵敏检测乙肝耐药突变的重要性 |
| 2.3 现有的乙肝病毒耐药突变检测技术仍存在诸多不足 |
| 三、CRISPR-Cas13a系统可用于核酸的高灵敏、高特异性检测 |
| 3.1 CRISPR-Cas13a系统简介 |
| 3.2 CRISPR-Cas13a系统在核酸检测技术中的应用 |
| 3.3 本文研究 |
| 第一章 基于CRISPR-Cas13a系统的高灵敏度HBV DNA检测方法的建立 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒载体与细胞系 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Lw Cas13a蛋白的诱导表达 |
| 1.2.2 Lw Cas13a蛋白的纯化 |
| 1.2.3 Lw Cas13a蛋白的Western Blot鉴定 |
| 1.2.4 Lw Cas13a蛋白的活性检测 |
| 1.2.5 基于PCR和 CRISPR的HBV DNA检测方法的建立 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 Lw Cas13a蛋白电泳鉴定 |
| 1.3.2 Lw Cas13a蛋白的Western Blot检测 |
| 1.3.3 Lw Cas13a蛋白活性检测 |
| 1.3.4 CRSPR-LwCas13a结合PCR的PCR-CRISPR检测方法的建立 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 基于PCR-CRISPR方法的血清样本HBV DNA的高灵敏检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 血清样本 |
| 2.1.2 质粒及引物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血清样本核酸提取 |
| 2.2.2 血清样本HBV DNA的PCR-CRISPR检测 |
| 2.2.3 血清样本HBV DNA的qPCR检测 |
| 2.2.4 血清样本HBV DNA的ddPCR检测 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 临床信息已知的血清样本HBV DNA的检测 |
| 2.3.2 临床信息未知的血清样本HBV DNA的检测及与qPCR的比较 |
| 2.3.3 血清样本HBV DNA的ddPCR验证 |
| 2.3.4 PCR-CRISPR与ddPCR检测HBV DNA的结果比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于CRISPR-Cas13a系统的乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法的设计 |
| 3.2.2 YMDD区基因序列分析及耐药突变质粒的构建 |
| 3.2.3 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的设计 |
| 3.2.4 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的特异性检测 |
| 3.2.5 YMDD耐药突变的灵敏度检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 .YMDD突变区序列的保守性分析 |
| 3.3.2 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的设计效果 |
| 3.3.3 YMDD突变检测的灵敏度 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于PCR-CRISPR方法的血清样本乙肝病毒YMDD耐药突变的检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 血清样本 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 血清样本核酸提取 |
| 4.2.2 直接测序法检测血清样本中的YMDD突变 |
| 4.2.3 qPCR法检测血清样本中的YMDD突变 |
| 4.2.4 PCR-CRISPR检测血清样本中的YMDD突变 |
| 4.2.5 PCR-CRISPR检测血清样本YMDD突变的效果评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 血清样本YVDD突变检测 |
| 4.3.2 血清样本YIDD突变检测 |
| 4.3.4 血清样本YMDD突变的测序验证 |
| 4.3.5 PCR-CRISPR检测血清样本YMDD突变的效果评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A HBV DNA靶点序列保守性分析结果 |
| 附录B 280份血清样本基本信息 |
| 附录C 用于突变检测的144份血清样本基本信息 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（7）核酸适配体介导的FRET探针构建及靶向识别效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 石墨烯类材料简介 |
| 1.2 氧化石墨烯基生物传感器在生物检测中的应用 |
| 1.3 核酸适配体的研究进展 |
| 1.4 氧化石墨烯功能化改性及在生物传感领域中的应用 |
| 1.5 论文研究内容及意义 |
| 2 核酸适配体功能化荧光识别探针对食品中细菌内毒素的检测 |
| 引言 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 GO的表征 |
| 2.2.2 靶向识别探针构建可行性分析 |
| 2.2.3 检测条件的优化 |
| 2.2.4 探针检测细菌内毒素灵敏性分析 |
| 2.2.5 探针靶向识别细菌内毒素性能分析 |
| 2.2.6 探针实际应用性能分析 |
| 2.3 小结 |
| 3 适配体介导的Cd Se/ZnS QDs@GO复合荧光探针对胰岛素的靶向检测 |
| 引言 |
| 3.1 实验部分 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 适配体功能化量子点(QDs-IBA)和氧化石墨烯的表征 |
| 3.2.2 靶向识别探针构建可行性分析 |
| 3.2.3 检测条件的优化 |
| 3.2.4 探针检测胰岛素灵敏性分析 |
| 3.2.5 探针靶向识别胰岛素性能分析 |
| 3.2.6 探针实际应用性能分析 |
| 3.4 小结 |
| 4 QDs/GO多色荧光探针的构建及在三种病毒性肝炎标志物同步检测中的应用 |
| 引言 |
| 4.1 实验部分 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 同步靶向检测肝炎病毒核酸探针构建可行性分析 |
| 4.2.2 同步检测肝炎病毒核酸条件的优化 |
| 4.2.3 探针同步检测肝炎病毒核酸灵敏性分析 |
| 4.2.4 探针靶向识别三种肝炎病毒核酸性能分析 |
| 4.2.5 探针实际应用性能分析 |
| 4.3 小结 |
| 5 黑洞猝灭剂/GO复合荧光超猝灭剂的制备及在蓖麻毒素靶向识别探针构建中的应用 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 GO@BHQ-2和QDs@Apt的表征 |
| 5.2.2 GO@BHQ-2 的荧光超猝灭性能分析及靶向识别探针构建 |
| 5.2.3 检测条件的优化 |
| 5.2.4 探针检测蓖麻毒素灵敏性分析 |
| 5.2.5 探针靶向识别蓖麻毒素性能分析 |
| 5.2.6 探针实际应用性能分析 |
| 5.3 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）家蝇抗菌肽Cecropin抗HBV作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1.2 外泌体 |
| 1.1.3 外泌体与病毒的关系 |
| 1.1.4 家蝇抗菌肽Cecropin |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究思路 |
| 第二章 家蝇抗菌肽Cecropin抗 HBV作用机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞株及药物 |
| 2.2.2 主要试剂与耗材 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要溶液配制 |
| 2.2.5 引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 Hi-Trap肝素亲和层析柱法纯化HepG2.2.15 细胞上清中HBV颗粒. |
| 2.3.3 电镜负染观察HBV形态 |
| 2.3.4 MTT检测药物对HepaRG细胞增殖影响 |
| 2.3.5 12天细胞感染实验检测药物对HBV感染影响 |
| 2.3.6 激光共聚焦显微镜检测MDC对细胞内HBsAg的表达 |
| 2.3.7 流式细胞术检测MDC对细胞内HBsAg表达影响 |
| 2.3.8 MTT检测药物对HepG2.2.15 细胞增殖影响 |
| 2.3.9 Real-time PCR检测Hep G2.2.15 细胞HBV-DNA含量 |
| 2.3.10 ELISA法检测HepG2.2.15 细胞上清中HBsAg和 HBeAg含量 |
| 2.3.11 激光共聚焦显微镜检测HepG2.2.15 细胞内HBc Ag表达 |
| 2.3.12 Western blotting检测HepG2.2.15 细胞内HBsAg、HBcAg表达量 |
| 2.3.13 激光共聚焦显微镜观察MDC在细胞内分布及定位 |
| 2.3.14 Real-time PCR测定MDC对细胞内抗病毒相关基因表达影响 |
| 2.3.15 Western bloting检测MDC对细胞内抗病毒相关蛋白表达影响 |
| 2.3.16 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 家蝇抗菌肽Cecropin直接作用于病毒颗粒 |
| 2.4.2 家蝇抗菌肽Cecropin对 HBV生命周期中具体阶段的影响 |
| 2.4.3 家蝇抗菌肽Cecropin对 HBV黏附/进入细胞阶段的影响 |
| 2.4.4 家蝇抗菌肽Cecropin对 HBV复制的影响 |
| 2.4.5 家蝇抗菌肽Cecropin直接作用于宿主细胞 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 家蝇抗菌肽Cecropin抑制外泌体介导的HBV感染作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂配置 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 试剂盒法提取HepG2.2.15 细胞上清外泌体 |
| 3.3.3 电镜负染检测HepG2.2.15 细胞上清来源外泌体形态 |
| 3.3.4 纳米颗粒跟踪分析仪(Nanoparticle tracking analysis,NTA)检测HepG2.2.15细胞上清来源外泌体粒径 |
| 3.3.5 Western blotting检测HepG2.2.15 细胞上清来源外泌体标志性蛋白 |
| 3.3.6 PCR技术检测HepG2.2.15 细胞上清来源外泌体内HBV核酸 |
| 3.3.7 超高分辨率活细胞3D显微成像仪观察外泌体在细胞内定位 |
| 3.3.8 流式细胞术检测外泌体在细胞中的扩散与传递 |
| 3.3.9 外泌体介导的HBV感染实验分组 |
| 3.3.10 ELISA实验检测细胞上清中HBV抗原表达 |
| 3.3.11 Real-time PCR实验检测细胞内HBV相关指标表达 |
| 3.3.12 ICC检测细胞内HBsAg表达 |
| 3.3.13 Western blotting检测细胞内HBsAg、HBcAg蛋白表达 |
| 3.3.14 流式细胞术检测外泌体在细胞间扩散传递的影响因素 |
| 3.3.15 Real-time PCR检测肝素、肝素酶对细胞内HBV相关指标表达的影响 |
| 3.3.16 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HepG2.2.15 细胞上清来源外泌体提取及鉴定 |
| 3.4.2 超高分辨率活细胞3D显微成像仪观察外泌体在细胞内定位 |
| 3.4.3 家蝇抗菌肽Cecropin影响外泌体的扩散传递 |
| 3.4.4 家蝇抗菌肽Cecropin影响外泌体介导的HBV感染 |
| 3.4.5 外泌体在细胞间扩散传递的影响因素 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ:英文缩写语中文对照 |
| 致谢 |
| 成果 |
（9）乙型肝炎病毒表面抗原低水平阳性与乙肝病毒核酸载量的相关性（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 进行血清HBs Ag检测的方法 |
| 1.2.2 进行血清HBV-DNA载量检测 |
| 1.3 统计学方法[3] |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（10）SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响（论文提纲范文）
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 细胞株及药物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 细胞培养及药物处理 |
| 2.3 DNA提取及PCR标准品制备 |
| 2.4 建立HBV-DNA标准曲线 |
| 2.5 特异性分析 |
| 2.6 重复性实验与稳定性分析 |
| 2.7 灵敏度分析 |
| 2.8 SYBR GreenⅠReal-time PCR检测IFN-CSP对HBV-DNA影响 |
| 2.9 Taqman Real-time PCR法检测IFN-CSP对HBV-DNA的影响 |
| 2.1 0 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 标准品的制备 |
| 3.2 标准曲线建立 |
| 3.3 Real-time PCR特异性分析 |
| 3.4 重复性实验与稳定性分析 |
| 3.5 灵敏度分析 |
| 3.6 IFN-CSP对Hep G2.2.15细胞内HBV-DNA复制的抑制作用 |
| 4 讨论 |
四、荧光探针定量PCR在检测HBV-DNA的应用（论文参考文献）
- [1]血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用[D]. 李茂仕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]PCR-荧光探针法检测HBsAg低反应性HBV基因型的初步评估[J]. 余占娟,李向阳. 中国卫生检验杂志, 2020(17)
- [3]重组酶介导的等温扩增技术（RAA）检测乙型肝炎病毒方法的建立与评估[D]. 白雪丁. 华北理工大学, 2020(02)
- [4]调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子鉴定及相关机制研究[D]. 陈彦猛. 重庆医科大学, 2020(01)
- [5]反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究[D]. 韦武均. 右江民族医学院, 2020
- [6]基于CRISPR技术的乙肝病毒DNA及YMDD耐药突变高灵敏检测技术研究[D]. 王珊. 军事科学院, 2019(09)
- [7]核酸适配体介导的FRET探针构建及靶向识别效应研究[D]. 杨佳佳. 山西师范大学, 2019(05)
- [8]家蝇抗菌肽Cecropin抗HBV作用机制研究[D]. 陈朝霞. 广东药科大学, 2019(02)
- [9]乙型肝炎病毒表面抗原低水平阳性与乙肝病毒核酸载量的相关性[J]. 杨正南. 当代医药论丛, 2018(02)
- [10]SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响[J]. 陈朝霞,刘阿龙,唐亚男,汪洁,朱家勇,卢雪梅. 广东药科大学学报, 2017(03)