一、细胞因子体外扩增脐血CD_(34)~+细胞移植SCID鼠人类免疫功能的建立(论文文献综述)
尹肖肖[1](2020)在《人脐带血CD133+细胞构建人源化小鼠模型效果评价及小檗碱对其体外扩增的影响》文中研究表明背景人源化小鼠模型被认为是目前用于疾病发生发展过程中免疫基础研究和临床前药物评估的最佳工具。然而,该模型的构建效果受细胞来源、植入途径、免疫缺陷小鼠品系和预处理方式等多种因素的影响。目前,建立人源化小鼠模型通常是通过辐照预处理新生免疫缺陷小鼠后,再将人脐带血(UCB)CD34+造血干细胞(HSCs)经尾静脉注射到体内的方法。但据报道,人UCB-CD133+HSCs移植后在分化数量和质量上均优于CD34+HSCs,骨髓腔内注射(IBMI)更适合HSCs发育分化,NOG(NOD Shi-SCID IL-2Rγcnull)小鼠是目前HSCs移植的最佳受体。此外,NOG小鼠对辐射敏感且辐射处理需专用设备和人员,而临床移植常用的预处理药物白消安(Busulfan)是一个较为理想的替代。人源化小鼠免疫系统重建效果依赖于所植入HSCs的数量,更多的HSCs往往能够获得更高的重建水平。但单份UCB中可分离的HSCs数量有限,不能大量构建人源化小鼠模型。若将多份UCB-HSCs构建的人源化小鼠用于同一实验,则很难控制个体差异对实验结果的影响。因此如何通过体外扩增获得大量均质的人HSCs是目前亟待解决的问题。目的通过骨髓注射将人UCB-CD133+HSCs植入经白消安预处理的NOG小鼠体内,构建具有人免疫系统的人源化小鼠模型;检测小檗碱(Berberine)对人UCB-CD133+HSCs体外扩增的影响。方法1.将人UCB-CD133+HSCs植入经白消安预处理的NOG小鼠骨髓腔,构建免疫系统人源化小鼠模型,并评估构建效果;1.1采用Ficoll密度梯度离心法从健康孕妇UCB中分离单个核细胞(MNCs)后,再用磁珠分选法从MNCs中分选CD133+HSCs。1.2采用流式法检测MNCs中CD133+HSCs百分比及磁珠分选出的CD133+HSCs纯度。1.3使用白消安预处理或生理盐水预处理(对照)NOG小鼠,24后将CD133+HSCs植入小鼠骨髓腔。移植后每周观察记录小鼠行为学变化及存活情况。1.4移植后每隔4周采集NOG小鼠外周血,用流式法检测人免疫细胞分化情况。2.以白藜芦醇(Resveratrol)为阳性对照检测小檗碱对人UCB-CD133+HSCs体外扩增的影响。2.1使用(0-50)μM白藜芦醇体外扩增CD133+HSCs 8天,采用MTS法检测细胞增殖活性。2.2使用10μM白藜芦醇体外扩增CD133+HSCs 0-14天,采用流式法检测扩增前后CD34+CD133+细胞比例。2.3使用(0-20)μM小檗碱体外扩增CD133+HSCs 8天,采用MTS法检测细胞增殖活性。2.4使用(0-20)μM小檗碱体外扩增CD133+HSCs 8天,采用流式法检测扩增前后CD34+CD133+细胞比例。2.5使用(0-10)μM小檗碱体外扩增CD133+HSCs 6-10天,采用MTS法检测细胞增殖活性。2.6使用(1.25、2.5、5)μM小檗碱与(5、10)μM白藜芦醇联合培养CD133+HSCs8-10天,采用MTS法检测细胞增殖活性。2.7经(5、10)μM小檗碱、10μM白藜芦醇,(5、10)μM小檗碱与10μM白藜芦醇联合培养CD133+HSCs 6-8天,采用流式法检测扩增前后CD34+CD133+细胞比例。2.8经5μM小檗碱+10μM白藜芦醇、5μM小檗碱及10μM白藜芦醇分别培养CD133+HSCs 6-8天,采用Q-PCR法检测干细胞转录因子NANOG和SOX-2的相对表达量。结果1.将人UCB-CD133+HSCs植入经白消安预处理的NOG小鼠骨髓腔,构建免疫系统人源化小鼠模型,评估构建效果。1.1一份人UCB-MNCs中CD133+细胞百分比为40.7±0.11%,磁珠分选出的CD133+细胞纯度达93.5±2.12%。1.2移植1周后(1 wpt),白消安预处理组中1只小鼠出现毛发皱褶、驼背、活动逐渐减少及全身触诊强度增加等行为学变化,在4 wpt时死亡。生存分析显示,对照组小鼠存活率(100%)略高于白消安预处理组(83%),但无统计学差异(P>0.05)。1.3在4 wpt时,在NOG小鼠外周血中检测到CD45+CD19+细胞和CD45+CD3-细胞。白消安预处理组上述B淋巴细胞分化数量及h-CD45+与m-CD45+的比值显着高于对照组(P<0.01)。1.4在16 wpt时,检测到人CD3-、CD19+、CD3+、CD4+和CD8+细胞。白消安预处理组上述人淋巴细胞分化数量及人CD4+与人CD8+细胞的比值均显着高于对照组(P<0.01)。1.5在16 wpt时,还检测到人CD3-CD19-CD14-HLA-DR+树突状细胞(DCs)和CD3-CD19-CD14+单核细胞。白消安预处理组DCs和单核细胞分化数量分别是对照组的7倍和3倍。2.以白藜芦醇为阳性对照检测小檗碱对人UCB-CD133+HSCs体外扩增的影响。2.1与对照组相比,10μM白藜芦醇能促进CD133+HSCs增殖活性(P<0.05),但对CD133+细胞比例的维持作用显着低于CD34+细胞(P<0.0001)。2.2与10μM白藜芦醇组相比,高浓度小檗碱(1020)μM可显着提高CD133+细胞比例(P<0.0001),但不能提高细胞增殖活性。2.3与10μM白藜芦醇组相比,小檗碱5μM为最佳扩增浓度(P<0.01),5μM小檗碱+10μM白藜芦醇为最佳联合培养浓度(P<0.01),两组均可在提高CD133+细胞比例的同时促进细胞增殖。而8天为最佳培养周期。2.4与对照组相比,5μM小檗碱在CD133+HSCs体外扩增8天时显着增加了NANOG及SOX-2基因的相对表达量(P<0.0001),5μM小檗碱和10μM白藜芦醇联合用药效果次之(P<0.05),而10μM白藜芦醇仅在培养8天时可促进SOX-2基因的表达(P<0.05)。结论1.人UCB-CD133+HSCs可作为建立免疫系统人源化小鼠模型的良好来源,而白消安预处理联合骨髓内注射的方式有利于促进CD133+HSCs在NOG小鼠体内的分化。2.小檗碱联合SCF、TPO及FLT-3L细胞因子能作为人UCB-CD133+HSCs体外扩增的有效试剂组合,其最佳浓度为5μM,扩增最大周期为8天。
曲琦[2](2016)在《脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究》文中研究指明一.脐血源内皮祖细胞(cord blood derived endothelial progenitorcell,CB-EPC)的体外分离、培养及鉴定目的:探讨体外分离及扩大培养CB-EPC的方法,在本实验室建立稳定的CB-EPC培养体系。方法:以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),将MNCs接种于纤连蛋白(Fibronectin,Fn)包被的培养瓶中,培养基为endothelial growth medium-2(EGM-2),其中添加recombinant human fibroblast growth factor-β(rh FGF-β),recombinant human epidermal growth factor(rh EGF),R3-insulin-like growth factor(IGF)-1,vascular endothelial growth factor(VEGF),ascorbic acid and GA-100)及10%FBS。采用贴壁培养培养72小时(hour,h)后弃未贴壁细胞的培养方式。2-3天半量换液一次并观察贴壁细胞生长状况。待细胞出现EPC形态特征并达到80%以上融合后,可传代培养。以流式细胞术检测所分离培养细胞表面CD34,CD45,CD133,CD31,KDR,及CD14抗原表达情况,鉴定是否为EPC表型。用CCK8法分析实验所选用的Passage(P)1-P5之间EPC的体外增殖能力,以成熟内皮细胞株人脐静脉内皮细胞(human umbilical veins endothelial cells,HUVECs)为对照。以Matrigel胶铺板,HUVEC为对照,分析EPC各代细胞之间体外成管能力及差异。采用Transwell小室,分析观察各代EPC细胞的迁移能力及与HUVEC迁移能力的差异。进一步通过荧光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)方法分析所培养细胞的内皮相关基因表达,确定其内皮系属性。结果:在特殊内皮系培养基的培养条件下,72h后去除未贴壁细胞继续培养,可于体外分离培养后约21-28天时出现典型EPC表现的克隆细胞团;继续培养,细胞团分裂增殖、克隆增大并逐渐融合;细胞生长速度较快,可经胰酶消化传代培养,约4-5天可传代一次,并可稳定传代约10代左右。流式细胞技术分析所分离培养细胞表面抗原的表达,和HUVECs相比,所培养EPC均不表达或极弱表达CD45(EPC vs.HUVEC,2.32%±1.56%vs.0.92%±0.77%,P=0.236)及CD14(EPC vs.HUVEC,3.44%±1.27%vs.1.29%±0.54%,P=0.054);EPC上有干祖细胞标志的CD133阳性表达(26.12%±4.56%),而HUVEC无此抗原表达(0.13%±0.11%)(P=0.001);CD31(EPC vs.HUVEC,98.82%±1.33%vs.97.90%±1.50%,P=0.472)和KDR(EPC vs.HUVEC,34.21%±6.44%vs.30.78%±5.60%,P=0.524),在脐血EPC及HUVEC上均有阳性表达,表达量相当;CD34在脐血EPC及HUVEC上均有表达,但在脐血EPC表面表达阳性率更高(EPC s.HUVEC,45.66%±6.81%vs.26.89%±4.91%,P=0.018)。以CCK8法对脐血EPC体外增殖能力分析,和HUVEC相比,脐血EPCs在体外培养第4天后增殖更为迅速,在P1,P3及P5之间,脐血EPC体外扩增趋势相当,无明显增殖差异,均较HUVEC扩增迅速。脐血EPC可于体外形成管腔样结构,成管能力较HUVEC弱,在40×镜下观察视野内脐血EPC成管数为P1,28.67±4.51个;P3,29.33±4.51个;P5,31.33±4.04个,而HUVEC为71.67±7.64个,各代脐血EPC和HUVEC成管数差异均具有统计学意义(P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000),而各代EPC之间成管数无明显差异(P=0.749)。在细胞迁移能力上,于×100视野下,随机计数三个不同视野,脐血EPC细胞数为P1,208.67±13.05个;P3,204.33±16.17个;P5,203.00±16.37个,而HUVEC细胞计数为71.67±3.79,两两比较有统计学意义(P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000),而各代之间迁移能力无统计学差异(P=0.925)。选取内皮细胞相关基因CDH5,VWF,VEGF,TIE1,TIE2,及SELE,通过RT-q PCR方法,进一步确认所培养细胞的内皮源性质,以HUVEC为对照,脐血EPC中基因转录水平CDH5增高1.64±0.32倍(P=0.025),VWF增高4.49±0.50倍(P=0.000),VEGF增高1.76±0.12倍(P=0.008),TIE1增高2.08±0.28倍(P=0.021),TIE2增高2.25±0.26倍(P=0.014),SELE增高7.34±0.61倍(P=0.000)。结论:通过体外分离脐血MNCs,以特殊培养基贴壁、黏附蛋白包被培养器皿,培养72h弃未贴壁细胞进一步培养的方法,可于培养的21-28天获得典型EPC形态表现的细胞群。经流式鉴定该细胞群非造血系细胞,并带有部分阳性的祖细胞标记区别于成熟内皮细胞,表达内皮相关基因,符合目前对EPC的表型认知。实验中所用细胞,各代表型特征、基因表达及内皮功能稳定。从脐血中分离培养的细胞具备目前所知关于EPC的大部分特点,在本实验室已建立CB-EPC的分离、有效扩增体系,可进一步应用于后续实验。二.脐血源内皮祖细胞为基质对体外扩增造血干细胞的作用及机制探究目的:探究CB-EPC在脐血造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)体外扩增中的作用。分析以CB-EPC为基质细胞,体外扩增脐血HSPC数量的有效性,干祖细胞数量及比例,并分析扩增后的脐血HSPC体内长期造血重建的作用及相应机制。为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法,为克服脐血造血干细胞移植(hematiopoietic stem cell transplantation,HSCT)因有核细胞数不足的临床应用限制提供一有效途径。方法:CB-EPC为常规分离、培养。用于HSPC获取的脐血标本,其来源与EPC分离所用脐血标本非同一供体。分离脐血MNCs后,以CD34+磁珠阳性分选法,分选其中的HSPCs并以流式分析CD34+细胞阳性率。脐血HSPC与EPC直接接触共培养或以Transwell小室的间接接触共培养,以不加EPC单纯培养的HSPC为对照,培养7天后计数扩增的细胞总数,结合流式术计数CD34+细胞数,及更原始祖细胞CD34+CD38-细胞数,各系祖细胞CD34+CD33+、CD34+CD19+、CD34+CD61+细胞数。流式细胞术检测扩增后HSPC的细胞周期,分析分裂各期细胞比例。比较扩增前后脐血HSPC的集落形成能力,行HSPC扩增后的功能学分析。建立人-非肥胖糖尿病、重症联合免疫缺陷小鼠(non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice)NOD/SCID鼠异种移植模型,移植分组包括:经MACS后CD34+干细胞组;单纯培养7天后干细胞组;共培养7天后干细胞组及照射组;分析移植后小鼠的生存状况、外周血象的恢复及移植后的人类HSPC嵌合。以RT-q PCR方法分析EPC扩增脐血HSPC的分子机制,并取具有体外扩增HSPC作用的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)为对照。结果:在培养7天后,直接接触共培养HSPC扩增6.75±0.84倍,单纯HSPC培养扩增3.76±0.60,二者之间存在统计学差异(P=0.003);间接接触共培养体外扩增HSPC 7.56±0.80倍,较单纯HSPC培养扩增倍数存在显着性优势(P=0.001);但直接接触共培养与间接接触共培养在HSPC的扩增倍数上,无明显差异(P=0.239)。直接接触共培养可扩增CD34+细胞5.38±0.61倍,单纯体外扩增培养有3.25±0.59倍CD34+细胞扩增,二者相比较具统计学差异(P=0.003);间接接触共培养同样可有效扩增CD34+细胞,扩增倍数为4.06±0.43倍,较单纯培养具统计学差异(P=0.025),与直接接触共培养之间无统计学差异(P=0.124),表明EPC的体外支持脐血HSPC扩增作用主要来源于细胞因子的分泌,而细胞间的直接生理性接触对HSPC扩增作用有限;在单纯培养条件下,CD34+CD38-细胞群扩增79.12±19.77倍,与EPC的直接接触共培养后,该群细胞扩增倍数可达156.17±21.32倍,明显较单纯培养时扩增倍数增高(P=0.010);在间接接触共培养条件时,该群细胞可获95.43±33.00倍扩增,亦较单纯培养时升高(P=0.026);接种0天时,脐血HSPC中CD34+CD38-的细胞比例为2.13%±0.58%,经单纯共培养7天后该比例达到44.29%±7.30%;经直接接触共培养可将该群细胞比例升高至48.38%±5.07%,与单纯培养下该细胞群比例无明显统计学差异(P=0.392);而间接接触共培养情况下CD34+CD38-群比例为24.58%±3.02%,较单纯培养(P=0.004)及直接接触共培养(P=0.002)条件下细胞比例均低;该部分结果显示,尽管EPC支持脐血HSPC体外扩增主要依靠EPC细胞因子的分泌,但是EPC与HSPC的细胞间直接接触有利于维持更原始造血细胞的比例。在直接接触共培养条件下,CD34+CD33+及CD34+CD61+细胞群较单纯培养或间接接触共培养均有更多倍数的扩增,而淋系CD33+CD19+在三种培养条件下扩增倍数相当。细胞周期结果显示,单纯培养后较培养前HSPC有G0/G1期细胞比例的下降(60.67%±1.68%,P=0.000),S期细胞比例的升高(31.40%±3.50%,P=0.000),而G2/M期细胞比例相当(5.94%±0.17%,P=0.120);经接触共培养7天后的细胞群,也存在G0/G1期比例下降(59.77%±1.94%,P=0.000),S期细胞比例上升(35.17%±2.75%,P=0.000),但有相当的G2/M期细胞比例(5.62%±0.39%,P=0.851),尽管以EPC为基质的体外共培养体系可较单纯培养提供更高倍数的HSPC扩增,却仍保证了足够的细胞处于分裂前期,有助于维持其干细胞特性;以EPC为基质共培养后的HSPC形成的CFU总数不仅比新鲜分离的HSPC多(446.33±6.66 vs.124.67±9.71,P=0.000),且比单纯培养后的HSPC总数多(446.33±6.66 vs.257.33±6.67,P=0.000)。就CFU的种类而言,与EPC共培养后的HSPC形成的各类CFU,在CFU-GM,BFU-E以及CFU-E数量上均较新鲜分离后的HSPC和单纯培养后的HSPC所形成的CFU数量多。人-NOD/SCID小鼠移植实验中,可观察到EPC扩增培养HSPC移植组与未经培养组有相似的白细胞、血红蛋白及血小板的各系血细胞恢复趋势;在移植后5周内,EPC扩增培养HSPC移植组小鼠的血红蛋白及血小板水平较未经培养HSPC组小鼠更高;单纯培养HSPC移植组小鼠多在移植后5周内死亡,未到达观察终点,未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组到观察终点分别有50%,60%小鼠存活,在生存时间上经统计分析无明显统计学差异(P=0.892)。在移植后8周未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组小鼠中均有人CD45的成功植入,平均嵌合率分别为16.0%±14.3%,13.3%±11.0%(P=0.750)。分析其机制,RT-q PCR结果显示EPC中的造血相关细胞因子基因IL6(4.24±1.42倍,P=0.017)、ANGPT1(7.75±0.90倍,P=0.000)及CXCL12(8.25±2.03倍,P=0.025)基因的转录水平均较MSC高;信号通路相关分子基因WNT5A转录水平在EPC中有明显升高(11.76±2.11倍,P=0.013);且经过体外共培养后的HSPC中,其WNT5A基因转录水平较培养前明显上调(3.49±0.54倍,P=0.001)。结论:人脐血源EPC可在体外有效扩增HSPC,提高细胞总数及具有原始造血、长期始动能力的细胞数量比例,提高各系祖细胞数量,并可保证一定数量处于静息期的HSPC数量,维持干细胞特性。经EPC为基质细胞扩增后的脐血HSPC具有良好的干细胞功能,可于体内植入及重建造血,在移植早期促进造血恢复。相关机制可能与EPC分泌多种造血相关因子及激活Wnt信号通路有关。脐血源EPC是良好的体外扩增HSPC的基质细胞,可为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法。三.脐血源内皮祖细胞联合造血干细胞移植在造血重建和移植物抗宿主病中的作用初探目的:通过联合脐血源EPC及HSC共移植的方式,分析其是否可通过修复移植过程中的内皮损伤,达到促进移植后的造血重建和减轻移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的作用。方法:建立人-NOD/SCID鼠共移植(EPC+HSC)模型,以单纯移植HSC小鼠为对照,观察移植后的生存状况、造血重建及体内植入,观察移植后小鼠有无GVHD相关症状并记录评分,以病理实验进行GVHD的验证;以CD31免疫组化病理实验分析共移植EPC组小鼠的骨髓微血管恢复情况,并与单纯移植小鼠比较;以慢病毒转染的方式转染绿色荧光蛋白EGFP入EPC,并建立小鼠移植模型,分析移植后EGFP-EPC的归巢及分布,是否直接参与骨髓的微血管恢复。以MSC为对照,流式细胞术分析EPC的表面人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)抗原表达及行混合淋巴细胞实验对EPC免疫原性进行分析。结果:经单纯移植小鼠(n=10)的中位生存时间为51天,长期存活率为60%;经脐血EPC联合HSC共移植组小鼠(n=10)的中位生存时间为54天,长期存活率为70%;EPC联合HSC共移植组较单纯移植组在生存时间上有提高的趋势,但统计学比较无明显差异(P=0.314)。两移植处理组均随着时间延长有血细胞恢复趋势,在观察的各时间点可发现共移植组较单纯移植组在WBC、HBG及PLT上均恢复值高。单纯移植组骨髓中人CD45嵌合比例为(13.27%±6.36%),共移植组骨髓中人CD45比例为(18.21%±10.57%),无统计学差异(P=0.308);在单纯移植组脾脏中的嵌合比为(4.91%±7.56%),共移植组中该比例为(5.14%±2.97%),无统计学差异(P=0.840)。单纯移植组中共有3只小鼠出现GVHD症状,主要表现为体重下降和(或)弓背姿势和(或)活动度下降和(或)耸毛,评分分别为2分、2分、6分;在共移植组中共观察到2只小鼠出现GVHD症状,该组的主要表现是体重下降和(或)轻中度活动度下降,评分分别为2分,1分;存在GVHD表现的小鼠存在不同程度的小肠和骨髓损伤,主要表现为腺体轻中度破坏和或骨髓增生度减低、骨小梁连续性差。EPC共移植组小鼠在观察终点时骨髓中有明显的、连续的CD31阳性染色,骨髓血管窦结构显示完整,提示其微血管恢复良好,而经单纯移植的小鼠骨髓血管内皮细胞有部分恢复但总体骨髓微血管恢复情况较共移植组为差。在将EPC转染EGFP并行移植实验后24h,骨髓中可检测到一定的呈聚集的染色阳性细胞,平均阳性比例占所有有核细胞比约为2.3%;移植后72h及7天,仍可见少量的阳性染色细胞分布于骨髓。实验中所用的EPC的免疫原性均较低,其表面HLA-I类抗原(HLA-ABC)的阳性率为(27.97%±3.60%),MSC的HLA-I类抗原阳性率为(44.46%±7.18%)(P=0.024);EPC表面HLAⅡ类抗原(HLA-DR)的阳性率为(6.37%±2.73%),同样较MSC该类抗原(14.77%±1.96%)表达低(P=0.012);与人淋巴细胞行混合淋巴细胞实验,以CFSE染色后未发现淋巴细胞过度增殖的现象。结论:本部分实验揭示了脐血EPC联合造血干细胞移植具有一定的促进移植后造血重建、减轻GVHD、延长生存时间的趋势,但因受样本量所限,仍需进一步扩大样本量进一步验证。修复骨髓微环境的髓窦内皮细胞损伤,可能是脐血源EPC促进移植后造血重建、减轻GVHD的机制之一。
马坤,姚慧[3](2012)在《脐血造血干细胞体外扩增方法学研究》文中研究指明近30年来,在儿童白血病治疗方法中,联合化疗方案的疗效有了显着提高,尤其是在急性淋巴细胞白血病(ALL)中5年无病生存率达到80%以上,但是仍不能避免有20%~25%的患者会出现复发,而这种复发正是ALL儿童死亡的重要原因,面对反复化疗失败和复发后病情严重的儿童,造血干细胞(HSC)移植就成为了他们生存的希望。脐血作为一种新的造血干/祖细胞(HSC/HPC)来源,具有自我更新和增殖能力强、免疫原性弱、来源广泛且无肿瘤细胞污染等优点,目前已广泛地应用于临床。然而,由于脐
苏约翰[4](2014)在《骨形成蛋白对造血干细胞体外扩增特性和生理功能的影响》文中进行了进一步梳理造血干细胞体外培养是解决造血干细胞临床移植中数量不足的主要途径,但由于体外培养条件与体内造血微环境存在很大差异,扩增后造血干细胞不仅在数量上无法充分满足临床需求,而且其生理功能也可能受到一定的影响。研究造血微环境中的调控因子对造血干细胞生长发育的影响能够为优化体外培养条件提供重要的依据。骨形成蛋白(BMPs)表达于骨髓造血微环境,在造血调控中发挥重要作用。本文以新鲜分离的脐血CD34+细胞为起始,使用含干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和Flt-3配体(FL)的无血清培养基,考察了BMP蛋白亚型和浓度对造血干/祖细胞体外扩增特性的影响,并进一步通过NOD/SCID小鼠移植实验,考察了BMPs对扩增后造血细胞生理功能的影响。结果如下:(1)在本文考察的浓度范围内BMP2对总细胞和造血干/祖细胞的扩增倍数、扩增后造血干/祖细胞的集落形成能力以及培养物中各系血细胞的组成均没有影响;(2)在培养体系中添加25ng/ml BMP4和5ng/ml BMP7,对提高总细胞和造血干/祖细胞的扩增倍数有一定的促进作用;(3)采用NOD/SCID小鼠模型评价了培养体系中添加5ng/ml BMP2或BMP7扩增后细胞的生理功能,发现添加5ng/ml BMP7对培养物的体内植入能力和造血重建功能均有促进作用,而添加5ng/ml BMP2对扩增后细胞的生理功能没有影响。以上研究结果为优化脐血造血干细胞体外培养环境,实现干细胞有效扩增,促进其临床应用提供了依据。
吴泽霖[5](2010)在《急性白血病儿童骨髓间充质干细胞与脐血来源NK细胞的相互作用体内外初步实验研究》文中提出骨髓间充质干细胞(bone marrow messenchymal stem cells, MSCs)是骨髓中除了造血干细胞外的另一种成体干细胞。MSCs不仅在体外可培养无限扩增而不丧失其多向分化潜能[1],并且具有支持造血及免疫调节的功能[2],被越来越多地应用于血液肿瘤等恶性疾病的治疗,同时在再生医学及组织工程中也有广泛应用前景。目前应用于临床的或者进行临床试验的骨髓MSCs包括异基因骨髓MSCs及自体骨髓MSCs。然而,研究发现异基因骨髓MSCs归巢困难[3],而自体的MSCs可有效归巢且自体的MSCs安全性高[4],经自体MSCs输注感染传染病的机会少,因此人们也把更多的注意力放在自体的骨髓MSCs身上。对于白血病儿童来说,临床应用的自体MSCs都是在白血病状态下采集,这种异常状态下的骨髓MSCs回输是否安全呢?吴丽萍等人的研究结果表明[5],白血病患儿的骨髓MSCs在生物学特性方面与其他来源的骨髓MSCs无明显差异。但是白血病儿童骨髓MSCs在分子水平及功能学上是否有改变是值得深入研究的。尤其是在功能学上的研究不可忽视,例如:白血病儿童骨髓MSCs是否会有恶性选择及促进白血病复发的作用呢?是否会减弱NK、T细胞等免疫因子的GVL效应及清除MRD的能力而增加白血病的复发率?这些疑问的解决是白血病儿童自体骨髓MSCs安全应用的前提。NK细胞作为机体天然免疫的重要组成部分,是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。随着对NK细胞生物功能及活化机制的了解,NK细胞在造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过继性免疫治疗方面的作用倍受关注。然而,原始来源的NK细胞含量少(外周血约占淋巴细胞的5%-7%),且目前尚缺乏有效的体外扩增体系,所以NK细胞的广泛临床应用受到了限制。因此,探索NK细胞的体外高效扩增体系具有重要意义。目前研究认为,MSCs细胞具有免疫调节功能;有研究[6-8]发现MSCs细胞能够抑制异体抗原或丝裂原刺激的T淋巴细胞的增殖。但MSCs对T细胞的这种免疫抑制作用机制仍然未明。NK细胞是固有免疫的主要效应细胞,在抗肿瘤抗病毒感染中也同T细胞一样发挥着举足轻重的作用。目前研究认为MSCs对异体抗原或丝裂原刺激的T淋巴细胞起到免疫抑制的作用,那么,MSCs对NK细胞是否也有相似的影响呢?如果不是,MSCs对NK细胞的作用又如何呢?目前这方面的研究相关文献的报道不多,尤其是有关白血病儿童骨髓MSCs更鲜有报道。因此,带着这些疑问,我们在本课题组之前对白血病儿童骨髓MSCs细胞的生物学特性初步研究的基础上,分离纯化扩增脐血NK细胞,并采用NOD/SCID小鼠建立白血病模型,对白血病儿童骨髓MSCs与NK细胞的相互作用及对白血病细胞K562的影响进行体内外的初步研究,为急性白血病儿童骨髓MSCs及脐血NK细胞在白血病免疫治疗中应用的后续研究做前哨性的探索。目的:探讨从人脐血中分选及扩增高纯度NK细胞的优化技术、扩增前后其功能的变化;以及在本课题组前期研究急性白血病儿童骨髓MSCs的生物学特性的基础上,探讨急性白血病儿童骨髓MSCs与脐血NK细胞在体外的可能相互作用。同时采用NOD/SCID小鼠建立荷K562白血病模型,探索急性白血病儿童骨髓MSCs在体内对K562肿瘤细胞生长的影响及对NK细胞抗瘤作用的影响。本研究旨在为儿童白血病综合治疗中应用自体MSCs或者联合应用NK细胞清除MRD的潜在应用价值做基础性的探索。方法:先用miniMACS及阳性免疫磁珠分选方法,从脐血单个核细胞(CB-MNCs)得到纯化的NK细胞,随后通过IL-2、IL-12和IL-15三个细胞因子的不同组合将培养体系分为IL-2组、IL-2+IL-l2组、IL-2+IL-l5组、IL-12+IL-l5组、IL-2+IL-l5+Il-l2组及对照组(不加任何细胞因子),分别培养15天,每3天半量换液并补充细胞因子;检测分选及扩增前后CD3-CD56++16+NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组NK细胞对K562杀伤率的变化。参照吴丽萍等人[5]的方法,通过Ficoll-Hypaque梯度密度离心法结合贴壁培养法体外纯化扩增急性白血病儿童骨髓MSCs,并进行形态学、免疫表型及多向分化能力的鉴定;取P3细胞用于后续研究。随后按照不同的MSCs︰NK比例,采用直接接触共培养及Transwell培养两种体系进行急性白血病儿童骨髓MSCs与脐血NK细胞的相互作用体外研究。出于偶然的发现,其中在MSCs︰NK比例相同的条件下,均设置了对应的IL2预先处理MSCs的实验组。两者相互作用7天后的检测指标有:细胞形态、NK细胞增殖率、对K562细胞的杀伤活性及细胞因子分泌水平,检测方法主要采用CCK-8试剂盒及ELISA。最后,采用NOD/SCID小鼠,先腹腔注射环磷酰胺预处理24小时后,尾静脉输注K562细胞或同时K562细胞与MSCs联合输注建立白血病模型;2周左右白血病小鼠出现症状后给予尾静脉输注NK细胞或者联合输注MSCs与NK细胞;从生存期分析、病理检查等方面研究急性白血病儿童骨髓MSCs在实验动物体内对K562肿瘤细胞生长的影响及对脐血NK细胞抗瘤作用的影响。结果:纯化前,流式细胞术检测CB-MNC中CD3-CD56++16+细胞含量为14.85±9.1,免疫磁珠纯化后,CD3-CD56++16+细胞含量为92.1±1.1;脐血中的NK细胞含量由纯化前的14.85±9.1%提高到92.1±1.1%,每份标本分离得到的NK细胞纯度均>90%。扩增培养期内台盼蓝染色示细胞存活率均为95%以上。培养前5天,各组细胞增殖均较缓慢;最快增殖时间出现在培养第2周,即第7-15天,此阶段各组培养条件下NK细胞均较培养初期显着扩增。培养至第15天IL-2组、IL-2+IL-12组、IL-2+IL-15组、IL-15+IL-l2组、IL-2+IL-15+IL-l2组NK细胞的扩增倍数分别为15.51±1.09,24.01±3.81,51.45±4.36,20.01±3.88及53.34±6.76,均显着高于对照组的1.64±1.0(p﹤0.01),IL-2+IL-15组、IL-2+IL-15+IL-l2组细胞的扩增倍数显着高于IL-2组、IL-15+IL-l2组及IL-2+IL-12组(p﹤0.01)。其中对照组NK细胞在培养第15天细胞数较前下降,显微镜下观察可见细胞状态差,死亡细胞增多。各细胞因子组NK细胞杀伤活性均较扩增前明显增强(p<0.01),NK细胞对K562杀伤活性呈IL-2+IL-15组>IL-2+IL-12组>IL-15+IL-l2组>IL-2组,且IL-2+IL-15组与IL-2+IL-15+IL-l2组差异无统计学意义(p>0.05)。。随着效靶比从1︰1、5︰1到10︰1,各组NK细胞对K562细胞的杀伤率均逐步提高(p<0.01)。培养的白血病儿童BM-MSCs在光镜下观察,呈梭形,平行排列漩涡状生长;不表达造血细胞相关抗原CD34、CD45,而CD29、CD105及CD13则阳性表达;在相应的诱导体系下,该MSCs可以向脂肪及骨细胞分化,油红O染色及西素红染色阳性。MSCs与NK细胞共培养的实验结果显示,MSCs抑制NK细胞的增殖,其抑制作用呈剂量依赖性,但IL2预先刺激24小时的MSCs细胞对NK细胞增殖的抑制作用明显减低,当MSCs︰NK比例为1︰100时,这种抑制作用基本消失;在直接相互接触共培养及Transwell培养体系中均观察到这种相同现象,但Transwell培养体系的抑制作用明显减低,这提示MSCs对NK细胞增殖的抑制作用可能需要MSCs与NK细胞的相互直接接触而实现。与IL-2培养体系单独培养的NK细胞相比,与MSCs共培养的NK细胞的杀伤活性受到了抑制,但是在对应的IL-2预先处理的MSCs共培养组,这种抑制作用明显减弱。实验显示,MSCs对NK细胞杀伤活性的抑制作用呈剂量相关。直接相互接触共培养与Transwell培养组的结果无明显差异,这在一定程度上提示MSCs对NK细胞杀伤活性的抑制可能是通过可溶性因子介导的。MSCs可以抑制NK细胞分泌IFN-γ、perforin ( p< 0. 05) ,且抑制作用呈剂量依赖性( p< 0. 05) ,直接相互接触共培养与Transwell培养的结果无明显区别,但是,IL-2预先处理过的MSCs组NK细胞的IFN-γ、perforin分泌水平相对高于未处理组( p< 0. 05);由此可以看出,MSCs对免疫细胞的抑制作用是可调控的。利用K562细胞建立的NOD/SCID小鼠白血病模型中,可以看到,输注MSCs的小鼠在体重变化、生长迟缓、生存期及病理改变方面与对照组小鼠比较无差异;输注NK细胞组与未输注NK细胞的对照组相比,上述指标存在不同,差异具有统计学意义;NK细胞联合MSCs输注与单纯输注NK细胞组小鼠相比,上述指标无明显差异。全文结论:1.利用miniMACS免疫磁珠阳性分选可从人脐血中获得高纯度NK细胞;在细胞因子存在的合适培养体系中可进行有效扩增。联合应用IL-2+IL-15两种细胞因子的培养体系,可有效的扩增NK细胞,增强NK细胞的细胞毒活性及细胞因子分泌水平。2.急性白血病儿童骨髓MSCs对脐血NK细胞增殖具有抑制作用,呈剂量依赖性,且细胞间的相互接触是参与这种抑制作用的主要机制之一。3.急性白血病儿童骨髓MSCs对脐血NK细胞细胞毒活性具有抑制作用,呈剂量依赖性,且这种抑制作用主要通过可溶性因子介导。4.急性白血病儿童骨髓MSCs对脐血NK细胞细胞因子分泌具有抑制作用,呈剂量依赖性,且这种抑制作用主要通过可溶性因子介导。5.急性白血病儿童骨髓MSCs对脐血NK细胞的免疫调节作用是可调控的,可受到IL-2或其它因素的影响而改变。6.采用NOD/SCID小鼠,环磷酰胺2mg/只腹腔注射预处理后尾静脉移植K562肿瘤细胞可成功建立白血病动物模型。7.急性白血病儿童骨髓MSCs与K562肿瘤细胞共移植至NOD/SCID小鼠,其在体内未发现有促进肿瘤细胞生长的现象。8.急性白血病儿童骨髓MSCs与脐血NK细胞联合输注至NOD/SCID荷K562白血病小鼠,MSCs在体内没有对脐血NK细胞的抗肿瘤效应有明显的抑制作用。
井莹莹[6](2009)在《hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响》文中研究说明目的:分别建立逆转录病毒载体和腺病毒载体介导的转人白血病抑制因子(human leukemia inhibitory factor,hLIF)基因饲养层细胞,体外观察转基因细胞对CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响,体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果。方法:将本科室构建和保存的hLIF基因重组逆转录病毒载体经鉴定正确后转染293T人胚肾成纤维细胞,经抗生素Zeocin筛选后获得稳定的转基因饲养层细胞,采用RT-PCR法和ELISA法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测hLIF基因在饲养层细胞中的转录和翻译;将本科室保存的重组腺病毒Ad-hLIF感染WI-38人胚肺成纤维细胞建立饲养层细胞,同样采用RT-PCR法和ELISA法检测hLIF基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测其纯度;将CD34+造血干/祖细胞分别与上述饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果;扩增后的造血细胞经CFDA SE(Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester,)荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内,通过细胞荧光标记法和RT-PCR法检测小鼠骨髓内含Alu基因人源细胞的归巢情况。结果:建立的逆转录病毒载体介导转hLIF基因饲养层细胞经Zeocin筛选后均带有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法鉴定hLIF基因可以在293T细胞中有效表达;50MOI的重组腺病毒Ad-hLIF感染WI-38细胞48h后,可见95%以上的细胞均有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法鉴定转基因细胞中有hLIF基因的表达;免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95.6±2.58%,与逆转录病毒载体介导的转hLIF基因饲养层细胞共培养7d后,细胞总数最高可扩增12.6±1.32倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量分别为55.0%、59.3%;而Ad-hLIF转基因饲养层细胞可使CD34+造血干/祖细胞7d内扩增18.45±1.24倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量分别为57.2%、59.8%,继续培养28d后,细胞总数扩增了356.95±0.87倍,其中CD34+细胞的数量出现了动态变化,在014d能维持较高水平,最高可扩增52.11±1.13倍,以后逐渐降低,共培养28d时,CD34+细胞数量仍比共培养前有较大升高,可扩增13.92±0.85。将扩增后的造血细胞移植辐射损伤SCID小鼠后,可明显提高小鼠存活率,4周内小鼠骨髓中不仅可观察到CFDA SE荧光标记的细胞,而且经RT-PCR法鉴定后,还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞。结论:成功建立了逆转录病毒载体介导的转hLIF基因饲养层细胞和Ad-hLIF转基因饲养层细胞,不仅体外可以有效的扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化,而且扩增的CD34+细胞对辐射损伤SCID小鼠具有一定的造血恢复功能。
胡嘉波[7](2008)在《脐血造血干/祖细胞分离、纯化、生物学特性及B细胞分化发育研究》文中进行了进一步梳理研究目的:探讨密度分离脐血造血干/祖细胞体外扩增和体内重建造血的潜能;胎儿骨髓间质干细胞对CD34+细胞体外扩增的造血支持作用;体外诱导脐血造血干/祖细胞向B细胞分化发育的规律。研究内容:(1)利用造血干/祖细胞培养、体外扩增、移植动物模型等技术,研究不同比密Ficoll-泛影葡胺分离液分离脐血造血干/祖细胞的造血活性。(2)体外分离、纯化胎儿骨髓间质干细胞;Mini-MACS免疫磁珠分离脐血CD34+细胞;建立胎儿骨髓间质干细胞、细胞因子与CD34+细胞共培养体系,用液体培养方法扩增细胞;实时定量RT-PCR技术分析培养细胞的nucleostemin基因表达。(3)体外免疫磁珠分离纯化脐血造血干/祖细胞;在小鼠S-17基质细胞支持下,脐血造血干/祖细胞、T3、IL7共培养建立体外B细胞分化发育培养体系,诱导脐血造血干/祖细胞B细胞分化;用流式细胞仪、PCR、RT-PCR技术检测不同培养时间分化的B细胞。研究方法:(1)密度分离脐血细胞配制不同密度Ficoll-泛影葡胺细胞分离液,分别应用密度为1.054 g/ml、1.064g/ml、1.072g/ml、1.077g/ml、1.084g/mlFicoll-泛影葡胺不连续密度梯度离心分离脐血有核细胞成分。(2)造血祖细胞集落培养五种不同比密Ficoll-泛影葡胺分离液分离的脐血细胞,在甲基纤维素体系中培养测定其集落形成能力。CFU-GM体系含有细胞2×105/ml,20%FBS,20ng/ml GM-CSF,0.9%甲基纤维素。BFU-E体系含有细胞2×105/ml,10-5M 2-巯基乙醇,3mM L-谷氨酰胺,马血清25%,白细胞条件培养液20%,EPO 2U/ml,0.9%甲基纤维素。充分混匀以每孔0.25ml加入24孔培养板中,重复2孔,置37℃,5%CO2培养箱培养,CFU-GM培养7天,BFU-E培养14天,倒置显微镜下观察计数CFU-GM,BFU-E。鉴别标准:CFU-GM每个集落至少含有40个细胞;BFU-E集落呈多中心状,橘红色,至少含有100个细胞。(3)密度分离细胞的生物学特性分析BALB/c照射小鼠体内输注不同比密Ficoll-泛影葡胺分离液分离的脐血细胞,观察其造血潜能。Ficoll-泛影葡胺分离液分离的细胞,用无菌生理盐水洗涤二次后,计数并调整细胞浓度为2×106/ml,小鼠经致死剂量(8.5Gy)照射后随机分为3组,照射后2小时完成输注。Ⅰ组6只,输注无菌生理盐水0.2ml;Ⅱ组6只,输注经1.077g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离洗涤后的脐血MNC(1.077细胞)0.2ml;Ⅲ组6只,输注经1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离洗涤后的脐血MNC(1.064细胞)0.2ml。所有小鼠均采用尾静脉输注。(4)脐血造血干/祖细胞体外扩增取经鉴定的MSCs接种于24孔板中,当细胞生长达80%汇合度时,接种MiniMACS分选的CD34+细胞(4000/孔),总体积为1ml,共分4组(每组3孔):①CD34+细胞组;②胎儿骨髓MSCs+CD34+细胞组;③细胞因子+CD34+细胞组,细胞因子浓度为50ng/ml SCF、50ng/ml IL-3、50ng/ml FL、50ng/ml TPO;④胎儿骨髓MSCs+细胞因子+CD34+细胞组。培养体系为含10%FBS的DMEM,置5%CO2、饱和湿度37℃培养。每7天半量换液1次并补充新的细胞因子,浓度同前。(5)脐血造血干/祖细胞B细胞分化培养接种Dynal beads分选的CD34+CD19-细胞或细胞仪分选的CD34+CD19-CD38-细胞于预铺S-17基质细胞的96孔培养板中。培养体系为α-MEM培养液,含3%FBS,50μM2-巯基乙醇,1%L-谷氨酰胺、T3及细胞因子组合,每孔总体积100μl。置5%CO2,饱和湿度,37℃培养。每7天半量换液1次并补充新的细胞因子,浓度同前。(6)流式细胞分析术分选或培养的1×106细胞标记前用含1%牛血清白蛋白(HAS)的PBS洗涤1次,用荧光标记小鼠抗人单克隆抗体标记,置4℃条件下30 min,用含1%HAS的PBS洗涤1次,加0.4 ml含0.1%叠氮钠的PBS,流式细胞仪检测。分析软件为Cellquest。(7) CD34+细胞nucleostemin基因表达的分析定量PCR反应用于nucleostemin基因分析。反应体系为25μl,包括:1μlcDNA模板和24μl反应混合液[其中含2.5mM MgCl2,20pmol引物,0.1μl Syber greenⅠ(1:1000)]。PCR循环参数为:95℃预变性2min,(94℃30s;58℃30s,72℃30s),40个循环。以GAPDH为内参照,扩增长度为205 bp,GAPDH基因连于pMD-18T载体定量稀释,作为标准曲线的模板。每个DNA样品做2个平行管,重复3次实验,反应结束后使用定量PCR仪的分析软件对实验结果进行分析,计算各样本基因的原始拷贝数,单位为拷贝/μlcDNA。Nucleostemin PCR扩增产物与相应GAPDH的扩增产物原始拷贝数的比值能反映转录水平的差异。此外,采取上述方法(PCR或RT-PCR)分析T3Rα1、T3Rα2、hT3Rβ1、Iμ、Cμ、IgLL、DQ52(D7-27)、DXP1(D3-9)、DQ52/DXP1等基因的表达、重组情况。研究结果:(1) 1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离脐血细胞中,CFU-GM集落数为373±289/1×105MNC,BFU-E为121±70/1×105MNC;在细胞因子刺激下,1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离脐血MNC在体外扩增14天时CFU-GM的扩增倍数达52.2倍;1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离的造血干/祖细胞可在8.5Gy致死剂量照射小鼠体内植入,输注1.064g/ml Ficoll分离脐血MNC产生的脾结节数是输注1.077g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离脐血MNC的2.2倍。(2)胎儿骨髓间质干细胞表达CD29、CD44;免疫磁珠分选CD34+细胞的平均纯度为97.4%;胎儿骨髓间质干细胞+CD34+细胞共培养28天,CD34+细胞仍占有核细胞的6.43%;CD34+细胞在胎儿骨髓间质干细胞、细胞因子作用下培养28天,有核细胞总数、CD34+细胞数分别被扩增1.65×105倍、788倍。(3) T3诱导脐血造血干/祖细胞B细胞分化,在我们选用的实验条件下,T3、IL-7与小鼠S-17基质细胞共培养是诱导CD34+CD19-造血干/祖细胞向B细胞分化的最佳条件,诱导的CD19+B部分细胞表达CD21,还表达CD10、CD20、CD24抗原,弱表达CD23抗原、HSL11、HSL96,不表达CD3、CD33、CD34、IgM抗原,B细胞向成熟方向发育;在小鼠S-17基质细胞支持下,单纯T3诱导的CD19+B细胞大多数体积较小,CD19+B细胞几乎不表达CD21,B细胞发育停留在较原始阶段;34+CD19-CD38-造血干/祖细胞B细胞分化的扩增倍数明显高于34+CD19-造血干/祖细胞,持续扩增的时间也延长;新鲜脐血与冻存脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞B细胞分化的纯度、扩增倍数无明显差异;小鼠S-17基质细胞高表达T3Rα1,传代20代以上小鼠S-17基质细胞,失去支持脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞B细胞分化的能力。(4)纯化的脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞检测到胚系DQ52基因,未发生DH-JH基因重排;诱导分化的B细胞优先选择DQ52-JH4、DQ52-JH3、DQ52-JH5基因重排,未检测到DQ52-JH1、DQ52-JH2、DQ52-JH6基因重排;在整个B细胞分化发育过程中,我们检测到持续的Iμ、Cμ、IgLL转录。研究结论:(1) 1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分离的造血干/祖细胞在体外具有较高的增殖、持续造血的能力及较强的体内造血重建潜能。(2)胎儿骨髓间质干细胞可有效扩增脐血造血干/祖细胞。(3) T3、IL7与小鼠S-17基质细胞体外能诱导脐血造血干/祖细胞B细胞分化,免疫球蛋白重链基因优势选择DH-JH4、DH-JH3、DH-JH5重排。脐血冻存三年对造血干/祖细胞活性、B细胞分化能力无影响。
李玉艳[8](2008)在《携带HBB基因shRNA的人脐血CD34+细胞构建及其应用基础研究》文中进行了进一步梳理β-血红蛋白病是一组多相群的单基因疾病,重型可致死。为了探讨其基因治疗的可行性及潜在价值。本课题拟选择对β-珠蛋白基因具有靶向RNAi的特异序列,并构建慢病毒载体,采用体外筛选法获得目的序列及质粒,以期能与β-珠蛋白等位基因特异性结合抑制RNA的表达,并了解感染细胞的体内植入和增殖情况,以期在以后试验中与其它基因表达载体组合共同用于治疗β-血红蛋白病。内容和方法1.从GeneBank查找HBB mRNA序列,设计挑选3个RNAi靶点,每个合成两条单寡核苷酸链,退火后连入酶切的pGCL-GFP载体,将连接产物转染感受态细菌,对长出的克隆进行PCR鉴定,测序比对。对阳性克隆进行质粒抽提。2.用PCR方法从模板钓取相应的HBB序列片段,将片段与pdsRED2-N1载体进行双酶切后定向连接,转染感受态细菌,长出的克隆进行PCR鉴定,测序和比对分析后,对阳性克隆进行质粒抽提。3.HBB-RNAi-LV质粒和HBB过表达质粒,按低浓度组(0.5:1)和高浓度组(1:1)用Lipofectamine2000共转染293T细胞,48h后FM观察GFP表达,Western Blot检测FLAG-HBB融合蛋白表达。4.将HBB-RNAi-LV质粒和慢病毒包装载体pHelper 1.0及pHelper 2.0载体按4:3:2比例添加,转染293T细胞,培养48小时后收集培养上清,利用Plus-20离心超滤装置对病毒上清进行离心超浓缩。5.人脐血MACS法分离的CD34+细胞,加入细胞因子进行无血清无基质预培养,慢病毒感染,48h后FM观察感染率,Real-Time PCR检测感染2、4、5天的HBBHBG基因表达情况,Western Blot检测感染7天的HBB蛋白表达。6.人脐血CD34+细胞,体外用高浓度细胞因子预刺激培养过夜后感染慢病毒24小时,经皮注射入SCID新生小鼠腹腔,密切观察小鼠存活情况。7.移植后3周,用FM和FCM检测小鼠外周血中人HbF细胞和成人红细胞,外周血有核细胞中的GFP阳性细胞;骨髓细胞中的GFP阳性细胞,并观察小鼠肝、脾、肾脏、小肠等组织中的GFP阳性细胞分布。结果1.构建了3个HBB基因的RNAi-LV载体(PSC1、PSC2、PSC3)及一个对照质粒PSCNC。2.构建了含有相应HBB基因片段的过表达载体HBB- pdsRED2-N1-3Flag质粒。3.外源筛靶试验中PSC1、PSC3对HBB融合蛋白有明显敲减作用,随着浓度增加敲减作用增强,其中PSC1靶点的敲减效果最好。4.包装并获得高滴度的PSC1、PSC3和PSCNC慢病毒。5.慢病毒在CD34+细胞中的感染率为1530%,病毒感染明显激活细胞中的HBB和HBG基因表达,PSC1促进HBB珠蛋白表达,PSC3则显着抑制HBB和HBG珠蛋白表达,其抑制效果与感染率有关。6.移植CD34+细胞后,小鼠外周血中人HbF细胞及成人红细胞为0.11.2%;有核细胞中GFP细胞,PSCNC组为3.210.2%, PSC3组为4.48.8%;骨髓细胞中GFP细胞PSCNC组为1.55.5%, PSC3组为1.36.2%,各组间均无统计学意义。肝、脾、肾和小肠等组织均未见明显的GFP阳性细胞。结论1.系统建立了完整的人脐带血CD34+细胞分离、无血清无基质培养和慢病毒感染的实验方法。2.成功构建了3个β-珠蛋白基因shRNA的慢病毒载体,通过外源筛靶方法初筛出2个有效序列,经慢病毒包装获得了高滴度的病毒颗粒。3.成功筛选到一条对HBB基因有抑制作用的RNAi序列。4.人脐血CD34+细胞移植入未骨髓抑制的免疫缺陷病新生小鼠腹腔,可成功归巢、增殖,主要增殖为自身缺陷的淋巴系统,红系缺乏表达优势。
于文俊,杨文华,史哲新,杨向东,王慧娟[9](2008)在《NOD/SCID小鼠模型在实验血液学研究中的应用》文中研究表明NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠是在SCID(重症联合免疫缺陷)小鼠的基础上与非肥胖性糖尿病小鼠(NOD/Lt)品系回交的免疫缺陷鼠。NOD/SCID小鼠既有先天免疫缺陷,又有T和B淋巴细胞缺乏,各种肿瘤细胞可以植入,且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD),所以NOD/SCID小鼠逐渐成为血液学实验研究的有用工具。本文从NOD/SCID小鼠的生物学特性、建立人类白血病模型、干细胞移植、药物研究及NOD/SCID小鼠应用中存在的不足和改良等方面综合述评。
于文俊,杨文华,史哲新,杨向东,王慧娟[10](2008)在《NOD/SCID小鼠在实验血液学研究中的应用》文中认为NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠是在SCID(重症联合免疫缺陷)小鼠的基础上与非肥胖性糖尿病小鼠(NOD/Lt)品系回交的免疫缺陷鼠。NOD/SCID小鼠既有先天免疫缺陷,又有T和B淋巴细胞缺乏,各种肿瘤细胞可以植入,且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD),所以NOD/SCID小鼠逐渐成为血液学实验研究的有用工具。本文从NOD/SCID小鼠的生物学特性及其在建立人类白血病模型、干细胞移植、药物研究及NOD/SCID小鼠应用中存在的不足和改良等方面综合述评。
二、细胞因子体外扩增脐血CD_(34)~+细胞移植SCID鼠人类免疫功能的建立(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞因子体外扩增脐血CD_(34)~+细胞移植SCID鼠人类免疫功能的建立(论文提纲范文)
(1)人脐带血CD133+细胞构建人源化小鼠模型效果评价及小檗碱对其体外扩增的影响(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第一部分 人脐血CD133~+细胞构建人源化小鼠模型的效果 |
材料与方法 |
实验方法 |
实验结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
第二部分 小檗碱对人脐血CD133~+细胞体外扩增的影响 |
材料与方法 |
实验结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
附录 |
攻读学位期间发表文章情况 |
致谢 |
个人简历 |
(2)脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
参考文献 |
技术路线 |
第一部分:脐血源内皮祖细胞的体外分离、培养及鉴定 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第二部分 脐血源内皮祖细胞为基质对体外扩增造血干细胞的作用及机制探究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第三部分 脐血源内皮祖细胞联合造血干细胞移植在造血重建和移植物抗宿主病中的作用初探 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
结论 |
综述:内皮细胞损伤在造血干细胞移植后移植物抗宿主病中的研究现状 |
参考文献 |
攻读学位期间公开发表的论文 |
攻读学位期间科研立项及所获奖项 |
课题基金资助 |
缩略词表 |
致谢 |
(3)脐血造血干细胞体外扩增方法学研究(论文提纲范文)
1 细胞因子组合法 |
2 模拟骨髓微环境法 |
2.1 共培养法 |
2.2 细胞三维培养法 |
3 基因调控表达技术法 |
4 总结 |
(4)骨形成蛋白对造血干细胞体外扩增特性和生理功能的影响(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第1章 文献综述 |
1.1 造血干细胞和造血调控 |
1.1.1 造血干细胞和造血 |
1.1.2 造血调控和体外扩增 |
1.2 骨形成蛋白(BMPs)的作用机制 |
1.2.1 BMPs作用途径 |
1.2.2 BMP信号的强度及持续 |
1.2.3 Smad1/Smad5补偿机制 |
1.2.4 BMP信号与其他信号之间的关联 |
1.3 BMPs对造血干细胞的体内外调控 |
1.3.1 BMPs促进胚胎干细胞的造血分化 |
1.3.2 BMPs在体外培养中对造血干细胞的影响 |
1.3.3 体内实验中BMPs对造血的影响 |
1.4 造血干细胞生理功能的检测 |
1.4.1 造血干细胞生理功能的体外检测 |
1.4.2 造血干细胞生理功能的体内评价 |
1.5 实验意义和研究内容 |
第2章 材料与方法 |
2.1 实验仪器与设备 |
2.2 实验材料与试剂 |
2.2.1 脐血与脐血细胞分离 |
2.2.2 培养基 |
2.2.3 细胞因子 |
2.2.4 免疫荧光抗体 |
2.2.5 NOD/SCID小鼠 |
2.2.6 其他试剂 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 脐血造血干/祖细胞的分离 |
2.3.2 脐血造血干/祖细胞的体外培养 |
2.3.3 细胞计数 |
2.3.4 细胞表型分析 |
2.3.5 集落形成细胞分析 |
2.3.6 NOD/SCID小鼠移植实验 |
2.3.7 NOD/SCID小鼠骨髓和脾脏人源细胞检测 |
2.3.8 数据分析 |
第3章 骨形成蛋白对造血干细胞体外扩增特性的影响 |
3.1. BMP2对脐血造血干/祖细胞扩增特性的影响 |
3.1.1 BMP2对总细胞扩增的影响 |
3.1.2 BMP2对CD34~+细胞和CD34~+CD38~-细胞扩增的影响 |
3.1.3 BMP2对CD34~+细胞集落形成能力的影响 |
3.1.4 BMP2对扩增后培养物中各系血细胞组成的影响 |
3.2 BMP4对脐血造血干/祖细胞扩增特性的影响 |
3.2.1 BMP4对总细胞扩增的影响 |
3.2.2 BMP4对CD34~+细胞和CD34~+CD38~-细胞扩增的影响 |
3.2.3 BMP4对CD34~+细胞集落形成能力的影响 |
3.2.4 BMP4对扩增后培养物中各系血细胞组成的影响 |
3.3 BMP7对脐血造血干/祖细胞扩增特性的影响 |
3.3.1 BMP7对总细胞扩增的影响 |
3.3.2 BMP7对CD34~+细胞和CD34~+CD38~-细胞扩增的影响 |
3.3.3 BMP7对CD34~+细胞集落形成能力的影响 |
3.3.4 BMP7对扩增后培养物中各系血细胞组成的影响 |
3.4 本章小结 |
第4章 骨形成蛋白对造血干细胞生理功能的影响 |
4.1 第1批NOD/SCID小鼠体内移植实验结果 |
4.1.1 脐血CD34~+细胞体外扩增情况 |
4.1.2 扩增后造血细胞对NOD/SCID小鼠存活率的影响 |
4.1.3 BMP蛋白对造血细胞在NOD/SCID小鼠体内植入能力的影响 |
4.1.4 BMP蛋白对造血细胞在NOD/SCID小鼠体内造血重建功能的影响 |
4.2 第2批NOD/SCID小鼠体内移植实验结果 |
4.2.1 脐血CD34~+细胞的体外扩增情况 |
4.2.2 扩增后造血细胞对NOD/SCID小鼠存活率的影响 |
4.2.3 BMP蛋白对造血细胞在NOD/SCID小鼠体内植入能力的影响 |
4.2.4 BMP蛋白对造血细胞在NOD/SCID小鼠体内造血重建功能的影响 |
4.3 本章小结 |
第5章 全文总结和展望 |
5.1 全文总结 |
5.2 结果讨论 |
5.3 展望 |
参考文献 |
致谢 |
(5)急性白血病儿童骨髓间充质干细胞与脐血来源NK细胞的相互作用体内外初步实验研究(论文提纲范文)
中英文对照缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
第一部分 脐血NK 细胞的分离扩增及其与急性白血病儿童BM-MSCs的相互作用的体外实验研究 |
1. 材料与方法 |
2. 结果 |
3. 讨论 |
4. 结论 |
第二部分 急性白血病儿童骨髓MSCs 联合脐血NK 细胞输注在NOD/SCID荷瘤小鼠体内的抗瘤作用初步实验研究 |
1. 材料和方法 |
2. 结果 |
3. 讨论 |
4. 结论 |
参考文献 |
附图 |
综述 |
参考文献 |
致谢 |
(6)hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
第一部分 逆转录病毒载体介导的转 hLIF 基因饲养层 细胞对脐血 CD34~+造血干/祖细胞的扩增作用 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
第二部分 Ad-hLIF 转基因饲养层细胞对脐血 CD34~+ 造血干/祖细胞增殖和分化的影响 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
第三部分 扩增后脐血 CD34~+细胞移植亚致死剂量辐 照的 SCID 小鼠的研究 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述:造血干/祖细胞移植研究新进展 |
发表和待发表的论文 |
本论文受下列课题资助 |
缩略词表 |
致谢 |
(7)脐血造血干/祖细胞分离、纯化、生物学特性及B细胞分化发育研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 绪论 |
1.1 胚胎干细胞 |
1.2 成体干细胞 |
1.3 造血干细胞 |
1.3.1 自我复制或自我更新 |
1.3.2 多向分化潜能 |
1.3.3 表面标志 |
1.4 脐血造血干细胞 |
1.4.1 脐血造血干细胞的特点 |
1.4.2 脐血造血干细胞的保存 |
1.5 造血微环境 |
1.6 造血干细胞B细胞分化 |
1.6.1 造血干细胞分化为祖B细胞 |
1.6.2 从祖B细胞到前B细胞 |
1.6.3 从前B细胞到未成熟B细胞 |
1.6.4 从未成熟B细胞到成熟B细胞 |
1.7 立题依据及主要研究内容 |
参考文献 |
第二章 脐血造血干/祖细胞密度分离及生物学活性实验研究 |
2.1 实验仪器和材料 |
2.1.1 实验动物 |
2.1.2 实验试剂 |
2.1.3 实验耗材 |
2.1.4 实验仪器 |
2.1.5 试剂配制 |
2.2 方法 |
2.2.1 脐血采集 |
2.2.2 不同比密Ficoll-泛影葡胺分离液分离脐血单个核细胞制备 |
2.2.3 脐血细胞成分测定 |
2.2.4 流式细胞仪测定 |
2.2.5 造血祖细胞集落培养 |
2.2.6 脐血MNC体外扩增 |
2.2.7 BALB/c小鼠照射 |
2.2.8 供体细胞制备及输注 |
2.2.9 受体小鼠脾CFU-S检测 |
2.2.10 实验数据的统计学处理 |
2.3 结果 |
2.3.1 不同比密Ficoll-泛影葡胺分离脐血细胞效果 |
2.3.2 不同比密Ficoll-泛影葡胺分离脐血造血干/祖细胞 |
2.3.3 造血祖细胞培养 |
2.3.4 1.064g/ml和1.077g/ml Ficoll-泛影葡胺分离脐血细胞的造血活性的比较 |
2.4 讨论 |
参考文献 |
第三章 脐血CD34+细胞扩增及nucleostemin基因表达研究 |
3.1 实验仪器和材料 |
3.1.1 实验试剂 |
3.1.2 实验耗材 |
3.1.3 实验仪器 |
3.2 方法 |
3.2.1 脐血采集 |
3.2.2 胎儿骨髓间质干细胞的纯化 |
3.2.3 CD34+细胞的分离纯化 |
3.2.4 CD34+细胞的体外培养 |
3.2.5 流式细胞分析 |
3.2.6 总RNA提取 |
3.2.7 逆转录合成cDNA |
3.2.8 引物设计 |
3.2.9 Nucleostemin长片段PCR扩增 |
3.2.10 T-A克隆 |
3.2.11 定量PCR标准曲线绘制 |
3.2.12 定量PCR反应 |
3.2.13 统计学处理 |
3.3 结果 |
3.3.1 胎儿骨髓间质干细胞分离纯化 |
3.3.2 CD34+细胞分离纯化 |
3.3.3 CD34+细胞的扩增 |
3.3.4 Nucleostemin基因表达 |
3.4 讨论 |
参考文献 |
第四章 脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞体外B细胞分化发育 |
4.1 实验仪器和材料 |
4.1.1 实验试剂 |
4.1.2 实验耗材 |
4.1.3 实验仪器 |
4.1.4 试剂配制 |
4.2 方法 |
4.2.1 脐血采集 |
4.2.2 新鲜脐血单个核细胞分离 |
4.2.3 新鲜脐血单个核细胞冷冻保存 |
4.2.4 脐血单个核细胞冷冻复苏 |
4.2.5 台盼蓝拒染实验 |
4.2.6 免疫磁珠分离脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞 |
4.2.7 免疫磁珠分离脐血CD19+细胞 |
4.2.8 流式细胞仪分选脐血CD34+CD19-CD38-细胞 |
4.2.9 S-17基质细胞传代培养 |
4.2.10 S-17基质细胞支持体系建立 |
4.2.11 脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞的体外B细胞分化 |
4.2.12 流式细胞分析细胞表面标记 |
4.2.13 基因组DNA提取 |
4.2.14 总RNA提取和逆转录 |
4.2.15 引物设计 |
4.2.16 PCR、RT-PCR检测目的基因 |
4.2.17 统计学处理 |
4.3 结果 |
4.3.1 脐血单个核细胞免疫标记分析 |
4.3.2 新鲜脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞分离 |
4.3.3 冷冻脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞分离 |
4.3.4 甲状腺素3(T3)促进脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞B细胞分化 |
4.3.5 细胞因子对脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞B细胞分化作用 |
4.3.6 B细胞分化表面标记 |
4.3.7 小鼠S-17基质细胞传代生物学变化 |
4.3.8 甲状腺素3受体(T3R)基因的表达 |
4.3.9 体外B细胞分化发育免疫球蛋白重链基因重排 |
4.3.10 免疫球蛋白重链Iμ和Cμ转录 |
4.3.11 λ样免疫球蛋白基因表达 |
4.4 讨论 |
参考文献 |
第五章 结论与展望 |
致谢 |
攻读学位期间发表的学术论文、参加课题、获奖 |
(8)携带HBB基因shRNA的人脐血CD34+细胞构建及其应用基础研究(论文提纲范文)
英文缩写一览表 |
英文摘要 |
中文摘要 |
正文 携带 HBB 基因 shRNA 的人脐血 CD34~+细胞构建及其应用基础研究shRNA |
前言 |
第一部分 HBB 基因 RNAi-LV 载体的构建、筛选和慢病毒包装 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
第二部分 人 CD34~+细胞的分离培养及 RNAi 转染及效果观察 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
第三部分 携带 HBB-RNAi 基因的人脐血 CD34~+细胞在 SCID新生鼠移植后的再殖情况 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
全文总结 |
致谢 |
参考文献 |
文献综述一 造血干细胞基因转染研究进展 |
参考文献 |
文献综述二 β-地中海贫血和镰形细胞病基因治疗进展 |
参考文献 |
攻读博士期间发表论文情况 |
英文论着 |
(9)NOD/SCID小鼠模型在实验血液学研究中的应用(论文提纲范文)
1 NOD/SCID小鼠的生物学特性 |
2 在人白血病细胞研究中的应用 |
3 在人脐血细胞体外扩增后移植研究中的应用 |
4 在促进造血干祖细胞归巢和造血及免疫重建研究中的应用 |
5 在抗血液病药物筛选和基因治疗研究中的应用 |
6 NOD/SCID小鼠模型的不足和新改良品种 |
(10)NOD/SCID小鼠在实验血液学研究中的应用(论文提纲范文)
NOD/SCID小鼠的生物学特性 |
NOD/SCID小鼠在建立白血病小鼠模 |
型中的应用 |
NOD/SCID小鼠在白血病干细胞研究中的应用 |
NOD/SCID小鼠模型的不足和新改良品种 |
四、细胞因子体外扩增脐血CD_(34)~+细胞移植SCID鼠人类免疫功能的建立(论文参考文献)
- [1]人脐带血CD133+细胞构建人源化小鼠模型效果评价及小檗碱对其体外扩增的影响[D]. 尹肖肖. 新乡医学院, 2020(12)
- [2]脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究[D]. 曲琦. 苏州大学, 2016(11)
- [3]脐血造血干细胞体外扩增方法学研究[J]. 马坤,姚慧. 中国实用儿科杂志, 2012(06)
- [4]骨形成蛋白对造血干细胞体外扩增特性和生理功能的影响[D]. 苏约翰. 华东理工大学, 2014(05)
- [5]急性白血病儿童骨髓间充质干细胞与脐血来源NK细胞的相互作用体内外初步实验研究[D]. 吴泽霖. 广州医学院, 2010(02)
- [6]hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响[D]. 井莹莹. 苏州大学, 2009(09)
- [7]脐血造血干/祖细胞分离、纯化、生物学特性及B细胞分化发育研究[D]. 胡嘉波. 江苏大学, 2008(07)
- [8]携带HBB基因shRNA的人脐血CD34+细胞构建及其应用基础研究[D]. 李玉艳. 第三军医大学, 2008(05)
- [9]NOD/SCID小鼠模型在实验血液学研究中的应用[J]. 于文俊,杨文华,史哲新,杨向东,王慧娟. 中国实验动物学报, 2008(05)
- [10]NOD/SCID小鼠在实验血液学研究中的应用[J]. 于文俊,杨文华,史哲新,杨向东,王慧娟. 中国实验血液学杂志, 2008(04)