一、银杏第1染色体DNA文库的构建（论文文献综述）
王波[1]（2018）在《巴西橡胶树热研7-33-97五条染色体文库构建及其序列分析》文中进行了进一步梳理巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是大戟科（Euphorbiaceae）、橡胶树属（Hevea）热带雨林乔木中唯一的栽培种,也是世界上广泛种植的产胶树种,其树皮所产胶乳是天然橡胶的原材料,具有很高经济和战略意义。目前国内外在橡胶树cDNA文库和蛋白组水平上开展了系列分子生物研究,取得了一定的进展,而有关橡胶树全基因组测序的相关研究起步较晚,仅于2013、2016和2017年完成对RRIM600、热研7-33-97和BPM 24三个橡胶树品种的全基因组测序,但也仅组装到Scaffold水平,尚未达到染色体水平。本研究在染色体水平上构建橡胶树单染色体文库,并对其进行测序,通过序列分析对单染色体的一些序列进行功能注释,旨在从单染色体水平上为橡胶树基因组研究提供新思路、新方法,为橡胶树分子辅助育种提供基础,研究取得了如下结果:（1）以巴西橡胶树’热研7-33-97’古铜期的嫩叶为材料,经酶解低渗去壁后制备染色体标本,通过微细玻璃针法从橡胶树中期细胞中共分离出40条单染色体。采用LA-PCR法随机对分离出的18条单染色体进行体外扩增,电泳检测后均有条带,条带大小范围在200～4000bp之间,从中随机选取5条染色体通过Southern杂交检测验证其来源,结果表明该5条染色体均来自橡胶树;将这5条单染色体进行荧光原位杂交验证并结合核型分析,确定其分别是热研7-33-97的第5、6、11、13和14号染色体。（2）对上述5条单染色体的第二轮LA-PCR产物进行纯化,并将纯化后的产物连接、转化、克隆最终构建出热研7-33-97第5、6、11、13和14号染色体文库,其克隆子数目分别是4.5×105个、5.11×105个、3.32×105个、3.01×105个、4.41×105个,插入片段大小范围分别在250～1100bp、250～1200bp、300～1100bp、300～950bp、200～1100bp,平均长度分别为 536 bp、481bp、388 bp、401bp、485 bp,文库的覆盖率分别为2.7倍、3.2倍、1.9倍、3.8倍、2.2倍,空载率分别为2%、3%、3%、1%、2%。（3）从热研7-33-97的第5、6、11、13和14号染色体的文库中,每个随机挑出100～140个左右的阳性克隆子进行测序,并将测序信息与NCBI中的巴西橡胶树RRIM600全基因组数据库（GCA001907995.1）、热研7-33-97全基因组数据库（GCA001654055.1）、EST数据库进行在线比对。比对结果表明,五条染色体文库序列中与橡胶树热研7-33-97全基因组数据库（GCA001654055.1）的高同源性分别有23、30、21、21、18条;与RRIM600全基因组数据库（GCA001907995.1）高同源性分别有23、28、22、20、18条;与橡胶树EST文库比较同源性大于90%的有20、74、40、38、57条,通过功能分析后多数单染色体序列主要与橡胶树耐盐性、耐割性、割面干涸病和抗冻性等有关。（4）对五个染色体文库中与橡胶树的全基因组数据库和EST数据库高同源的19条序列进行了 Blast2GO软件分析,通过比对发现有高同源性的序列有17条。对这17条序列用Blast2GO软件进行GO MAP比对,均得到了 GO术语注释结果,共获得23个GO ID,其中生物学途径10个、细胞组分6个和分子功能7个;对注释结果进行GO分级,共分为5级,有不同的功能,在生物学途径方面主要参与细胞过程、代谢过程、单有机体过程、生物体调控、生物合成过程、初级代谢等;在分子功能方面,主要参与催化活性、运输活性和转移酶活性等;在细胞组件部分主要是参与细胞部分、细胞、细胞器的组成。对经过GO注释后的序列进行Enzyme Code和KEGG代谢途径分析,除了第11号染色体文库序列未能注释到相关酶的功能,在5号、6号、13号及14号染色体文库均得到Enzyme Code 注释,其中 L-5Chr-5、L-5Chr-91 和 L-6Chr-48 序列上都得到一个Enzyme Code注释,所得注释的酶的ID均为2.7.7.49,为RNA-引导的DNA聚合酶;L-13Chr-25序列上都得到一个Enzyme Code注释,所得注释的酶的ID是2.3.1.12,为二氢硫辛酰赖氨酸残留乙酰转移酶;L-14Chr-73所得注释的酶的ID为3.6.1.15,为三磷酸核苷磷酸酶。但进行KEGG代谢途径分析,并未获得代谢途径。
张志丹[2]（2018）在《巴西橡胶树热研7-33-97六条染色体文库的构建及序列分析》文中进行了进一步梳理巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是重要的产胶植物,具有寿命长、产量高及采胶容易等优点。目前,分子标记广泛应用于橡胶树遗传图谱的构建、品种鉴定、辅助育种和遗传多样性分析中,但构建的遗传图谱不多,存在着连锁不稳定、丰度小、分布不均等缺点。巴西橡胶树热研7-33-97、RRIM600和BPM24三个橡胶树品种已完成全基因组测序,但只组装到Scaffold水平,未达到染色体水平。本研究采用微细玻璃针法,从巴西橡胶树单染色体着手,构建单染色体微克隆文库,并对文库的部分序列进行比对、基因注释等分析,旨在为橡胶树基因组研究提供新的辅助方法,为橡胶树分子辅肋育种提供依据。（1）以巴西橡胶树热研7-33-97古铜期幼叶为材料,对酶解去壁低渗法进行改良,结果发现:在37℃下,采用磷酸盐缓冲液（NaH2PO4·2H20,29.18 g/L;Na2HPO4·12H2O,4.66 g/L;NaCl,8g/L;pH=5.5）作为溶剂,配制终浓度为 5%纤维素酶、4%果胶酶混合液时,酿解时间为1.0～1.5h。（2）采用玻璃针显微分离法成功的获得了 7条单染色体,经LA-PCR扩增、Southern杂交、FISH杂交验证并结合核型分析确定了其中六条染色体的来源,分别为热研7-33-97的第1、2、3、5、13及16号染色体。（3）构建了热研7-33-97第1、2、3、5、13及16号染色体的微克隆文库,分别获得了 2.9×105个、3.0×105个、4.1×105个、3.1×105个、3.2×105个、3.2×105个克隆子,插入片段范围为200～1100bp、300～1000bp、200～1000bp、200～1000bp、250～1000bp、250～1000bp,平均插入片段约为 398bp、396bp、451bp、455bp、447bp、493bp,文库的覆盖率约为1.0倍、1.2倍、1.9倍、1.5倍、1.9倍、2.6倍,空载率分别为 2%、2%、1%、3%、2%、3%。（4）随机获得了热研7-33-97的第1、2、3、5、13、16号染色体文库中的部分阳性克隆子测序序列,分别为172、166、114、106、83、89条,将测序结果与NCBI上热研7-33-97全基因组数据库（GCA001654055.1）、RRIM600全基因组数据库（GCA001907995.1）、EST数据库进行在线同源比对及基因功能分析,其中与热研7-33-97全基因组数据库（GCA001654055.1）有高同源性的为23、45、45、53、25、28条,与橡胶树EST文库同源性大于90%的为18、50、29、34、42、20条,经功能分析后多数与橡胶树耐割性、抗寒性、死皮病、耐盐性及胶乳形成相关。（5）利用Blast2GO软件在线将这六条染色体中与橡胶树的全基因组数据库高同源的28条序列进行基因功能注释,其中15条序列得到了 GO术语注释结果,共得到50个GO ID,包括生物学途径18个、细胞组分14个和分子功能18个,而且在生物学途径中主要参与细胞过程、代谢过程、单有机体过程、生物体调控、生物合成过程等方面;在分子功能方面,主要参与催化活性、运输活性和转移酶活性等;在细胞组件方面主要参与细胞组分、细胞、细胞器的组成。对经过GO注释后的序列进行Enzyme Code和KEGG代谢途径分析,发现,在第1、2号染色体文库中,L-1Chr-57、L-1Chr-79、L-2Chr-169三个序列获得了酶注释,注释分别为多肽酶、核糖核酸聚合酶、半乳糖苷酶,酶ID分别为3.4.23、2.7.7.49、3.2.1.23,但均未获得代谢途径。
马梦晨[3]（2017）在《巴西橡胶树热研7-33-97五条染色体文库的构建及序列分析》文中指出巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是重要的热带作物,是我国特种经济作物。目前包括RFLP、AFLP、RAPD、SSR、SNP等十多种分子标记已在橡胶树上得到应用,主要集中在橡胶树连锁遗传图谱的构建、品种鉴定、分子标记辅助育种和遗传多样性研究中。巴西橡胶树的全基因组测序开展的较晚,于2013、2016和2017年分别完成对RRIM600、热研7-33-97和BPM 24三个橡胶树品种的全基因组测序,但也仅组装到Scaffold水平,尚未达到染色体水平,因此本研究从单条染色体入手,构建巴西橡胶树单染色体文库,对单染色体文库部分序列进行基因功能注释,旨在为橡胶树基因组研究提供新的思路与方法,为分子辅助育种提供基础。具体研究结果如下:（1）以巴西橡胶树热研7-33-97古铜期幼叶为材料制备染色体制片,从其中期分裂相中分离出32条染色体,并将分离出的单染色体用LA-PCR法扩增,其中有24条染色体检测有条带,条带大小多为300-4000 bp,对24条检测有条带的单染色体进行Dot-blot杂交验证其扩增来源,其中有22条杂交成功,证明其来自巴西橡胶树。随机选取5条斑点杂交成功的染色体进行Southern杂交,进一步证明了其来源于巴西橡胶树基因组,进而对这5条染色体进行荧光原位杂交验证并结合核型分析确定其分别为热研7-33-97的第3、7、13、15及16号染色体。（2）对已构建的单染色体文库连接转化与培养体系步骤进行了优化,优化后震荡培养时间为45 min,涂平板时菌液涂布体积确定为20μl/板,37℃倒置培养16 h。利用此体系本试验成功构建了巴西橡胶树热研7-33-97的第3、7、13、15及16号染色体微克隆文库,分别获得了 4.26×105个、3.6×105个、4.97×105个、2.83×105个、2.91×105个克隆子,插入片段范围依次为250～850bp、150～800bp、250～1200 bp、250～800 bp、250～1000 bp,平均插入片段依次为 437 bp、382 bp、491 bp、460 bp、456 bp,文库的覆盖率依次为2.1倍、1.6倍、3.6倍、2.1倍、2.3倍,空载率分别为3%、7%、2%、1%、2%。（3）随机获得了热研7-33-97的第3、7、13、15、16号染色体文库中的部分阳性克隆子测序序列,分别为80、88、83、81、111条,将测序结果与NCBI上巴西橡胶树热研7-33-97全基因组数据库（GCA001654055.1）、RRIM600全基因组数据库（GCA001907995.1）、EST数据库、巴西橡胶树18个分子标记的遗传图谱进行在线比对。该五条染色体文库中与热研7-33-97全基因组数据库（GCA001654055.1）有高同源性的分别为19、40、15、14、18条;与橡胶树EST文库同源性大于90%的依次为20、42、16、29、21条,经功能分析后多数与橡胶树耐割性、抗冻性、割面干涸病（死皮病）、耐盐性及胶乳形成相关。其中L-7Chr-4与橡胶树胶乳形成相关,还与EST序列GenBank: JZ378253.1的同源相似性为97%,经功能注释该编号与陆地棉苗根系抗盐胁迫相关。（4）对五个染色体文库中与橡胶树全基因组数据库和EST数据库有高同源性的21条序列进行了 Blast2GO软件分析,比对上有高同源性的序列有14条,对这14条序列用Blast2GO软件进行GO MAP比对,其中8条序列得到了 GO术语注释结果,共得到41个GO ID,其中生物学途径（P） 22个、细胞组分（C） 12个和分子功能（F） 7个,对41个注释结果进行GO分级,共分为5级,有不同的功能,在生物学途径方面主要参与细胞过程、代谢过程、单有机体过程、生物体调控、生物合成过程、初级代谢等方面;在分子功能方面,主要参与催化活性、运输活性和转移酶活性等;在细胞组件部分主要是参与细胞部分、细胞、细胞器的组成。对经过GO注释后的序列进行Enzyme Code和KEGG代谢途径分析,在3号染色体文库的L-3Chr-3序列上得到一个酶注释,ID为2.7.7.49,为谷氨酰胺腺苷转移酶,但并未获得代谢途径。
马梦茹[4]（2017）在《巴西橡胶树热研7-33-97第4，12，17和18号染色体文库的构建及序列分析》文中研究指明橡胶树是天然橡胶的主要来源。巴西橡胶树（Heveabrasiliensis）是目前国内外产生胶乳的重要物种。对巴西橡胶树进行深入的分子细胞学研究在橡胶树的育种上具有重要意义。近年来,研究者们先后在2013、2016和2017年采用高通量测序技术完成了 RRIM600、热研7-33-97、BPM24等巴西橡胶树品种的全基因组测序,但拼接水平仅达到scaffold水平。其遗传图谱、连锁群等信息并没有与染色体进行对应,功能基因在染色体组上位置和连锁关系尚未完全确定。目前的研究结果直接应用于橡胶树育种的难度较大,本研究构建了巴西橡胶树单染色体文库,可在一定程度上解决此问题。本课题组成员在国内从2013年率先开启了巴西橡胶树单染色体文库的构建工作,其他有关此方面的研究尚未见报道。故本研究从其单染色体入手,运用单染色体显微分离、LA-PCR法扩增单条染色体技术,构建了 4条巴西橡胶树单染色体文库,旨在为橡胶树的分子辅助育种提供理论基础。研究结果如下:（1）本研究采用微细玻璃针法成功地从巴西橡胶树热研7-33-97多个中期分裂相细胞中分离出31条单染色体。挑选出其中4条,用LA-PCR法对单染色体进行两轮体外扩增,通过Dot-blot杂交证实扩增产物来自巴西橡胶树基因组;将此4条染色体LA-PCR二轮扩增产物用DIG或BIO标记成探针,经荧光原位杂交（FISH）验证结合核型分析确定出4条染色体分别来自于热研7-33-97的第4、12、17和18号染色体。并成功构建了其微克隆文库,依次获得了 2.11×105、2.75×105、2.77×105、1.32×105个克隆子,其插入片段范围分别为250～1100bp、250～1200bp、300～1400bp,300～1100 bp,平均插入片段分别约为450 bp、500 bp、500 bp、550 bp。四条染色体文库的覆盖率依次约为1.1倍、1.9倍、2.4倍、1.4倍,空载率分别为0%、0%、1%、1%。（2）在热研7-33-97的第4、12、17、18号染色体文库中分别随机取100个左右阳性克隆子进行了测序,测序后分别得到100、100、101、99条序列,去除重复序列后依次有87、83、91、87条。将这些序列进行BLAST在线同源比对,与巴西橡胶树RRIM600全基因组数据库同源性大于90%的各为13、11、20、11条;与巴西橡胶树热研7-33-97全基因组数据库同源性大于90%的各为17、15、23、13条;与橡胶树EST文库同源性大于90%的分别为18、19、19、14条。EST注释的功能多数与橡胶树抗冻性、胶乳合成、耐割性、死皮病等功能相关,也有参与氨基酸前体和LCR69前体、defensin蛋白质前体的合成。（3）对四个染色体文库中与橡胶树的全基因组数据库和EST数据库高同源的序列共27条序列进行了 Blast2GO软件分析。第4号染色体构建的文库中的8条序列共得到了 9个术语注释结果:5个有关分子途径（P）,3个有关细胞组件（C）,1个有关分子功能（F）;第12号染色体构建的文库中的7条序列中共得到9个GO术语注释结果4个有关分子途径（P）, 3个有关细胞组件（C）,2个有关分子功能（F）;第17号染色体构建的文库6条序列共得到了 8个GO术语注释结果,3个有关分子途径（P）,4个有关细胞组件（C）, 1个有关分子功能（F）;第18号染色体构建的文库中2条序列获得了 2个GO术语注释结果,1个有关分子途径（P）,1个有关细胞组件（C）,未获得有关分子功能方面的注释。这些获得注释的序列在生物学途径中参与细胞增殖、负调控的生物过程、细胞调控的过程、生物合成、N代谢等过程;在分子功能方面,有些序列影响到了转化酶的活性;在细胞组件方面,这些序列主要是参与细胞器组成、细胞固有成分组成等。第4号、12号、17号染色体文库中L-4Chr-25、L-12Chr-59、L-17Chr-4均获得了同一个酶注释:谷氨酰胺腺苷转移酶（EC 2.7.7.49）,进行KEGG代谢途径分析,未获得代谢途径。
殷卉[5]（2016）在《巴西橡胶树热研7-33-97三条染色体文库的构建及第4号染色体高通量测序初步分析》文中研究表明巴西橡胶树（Hevea brasiiensis）属大戟科植物,是一种天然的产胶植物和重要的经济作物。目前分子标记技术应用在橡胶树研究方面已取得一定进展,但关于橡胶树分子生物学研究还很欠缺。已构建的橡胶树连锁遗传图饱和度不够,许多功能基因在染色体组上位置和连锁关系尚未确定,直接应用于橡胶树育种难度较大。而从单条染色体入手,构建单条染色体文库,对单条染色体进行高通量测序和基因功能注释,可有效解决上述问题。在目前国内外有关橡胶树文库构建的研究仅在全基因组文库或cDNA文库方面,除了本课题组成员从2013年开启橡胶树单染色体文库构建工作外,与橡胶树单染色体文库构建方面相关的研究所见较少。而在橡胶树高通量测序方面,目前仅在RRIM品种全基因组测序草图和其他品种的转录组方面的测序,单条染色体高通量测序报道罕见。本研究采用巴西橡胶树单染色体显微分离体系分离热研7-33-97单染色体,一方面利用LA-PCR法扩增单条染色体后构建单染色体微克隆文库;另一方面,利用单细胞全基因组扩增法扩增单条染色体后进行Illumina高通量测序。旨在为橡胶树基因组研究提供新的思路与方法,为分子辅助育种提供理论基础。具体研究结果如下:（1）以巴西橡胶树热研7-33-97幼叶为材料,采用酶解去壁低渗法制备染色体标本,选择酶解时间为7h40min,后低渗时间为30min,可获得高质量的染色体标本。采用实验室自建的橡胶树玻璃针显微分离技术体系,成功地从橡胶树中期分裂相细胞中分离出29条单染色体。随机挑选出3条,采用LA-PCR法对单染色体进行体外扩增,通过Southern杂交证实扩增产物来自巴西橡胶树基因组;将这3条染色体的LA-PCR二轮扩增产物用DIG标记成探针,经荧光原位杂交（FISH）验证并结合核型分析确定出这三条染色体的序号分别为热研7-33-97的第10、11及14号染色体。（2）构建了巴西橡胶树热研7-33-97的第10、11及14号染色体的微克隆文库,分别获得了 1.8×105个、2.4×105个、1.5×105个克隆子,插入片段范围为200-1100bp、200-1100bp、300-1100bp,平均插入片段分别约为400bp、450bp、450bp,文库的覆盖率依次约为7倍、5倍、5倍,空载率分别为5%、4%、5%。（3）分别随机对热研7-33-97的第10、11、14号染色体文库中的各100个阳性克隆子进行了测序,测序后分别得到100、100、94条序列,去除重复序列后依次有有93、91、86条。将这些序列进行BLAST在线同源比对,与橡胶树（RRIM600）WGS文库同源性大于90%的各为1、3、3条,与橡胶树EST文库同源性大于90%的分别为1、3、4条。（4）将三个染色体文库与橡胶树的全基因组数据库和EST数据库高同源的序列进行Blast2GO软件分析。第10号染色体文库中的有2条序列用Blast2GO软件分析后,共计获得了7个GO术语注释结果,其中2个有关生物学途径方面,5个有关分子功能方面,进而对序列进行Enzyme Code和KEGG代谢途径的分析,获得2个酶注释,酶ID号为EC3.6.1、EC3.6.15,参与嘌呤代谢、硫胺素代谢KEGG两条代谢途径;第11号染色体文库中有6条序列用Blast2GO软件分析后,未获得GO术语注释结果,只获得了 2条序列有8个GO MAP结果,表明这两条序列与这些GO序列有一定的同源性,这些GO中,3个有关生物学途径（P）方面,3个有关细胞组件（C）方面,2个有关分子功能方面;第14号染色体文库中的有7条序列用Blast2GO软件分析后,共计获得11个GO术语注释结果,有关分子途径（P）方面的有5个,有关细胞组件（C）的有5个,有关分子功能（F）的有1个,进而对序列进行Enzyme Code和KEGG代谢途径的分析,获得2个酶注释,酶ID号均为EC2.7.7.49,但未获得代谢途径结果。（5）从分离的染色体中随机选择一条单染色体,用单细胞全基因组扩增（MALBAC）法对其进行体外扩增。Southern杂交证实其扩增产物来自于巴西橡胶树基因组,经荧光原位杂交（FISH）和核型分析确定出这条染色体为热研7-33-97的第4号染色体。（6）对热研7-33-97的第4号染色体二轮扩增产物进行Illumina平台高通量测序。测序结果双重过滤后进行分析统计,得到与橡胶树基因组匹配上的Reads为100 bp的有效序列770470条,又经变异检测得到SNP位点共8019个,InDel位点82个,SV位点184个。（7）本研究从热研7-33-97的第4号染色体三重过滤后的clean reads中随机挑选出2000条与橡胶树（RRIM600）基因组数据库进行在线比对,同源性达90%以上的序列有1846条。随机挑选3000条序列与在库的EST序列同源性达90%以上的序列有25条,进而对与在库的EST序列高同源性的24条序列用Blast2GO软件分析后,共计获得5个GO注释结果,其中属于生物学途径（P）方面的有1个,细胞组件（C）方面的有1个,分子功能（F）方面的有3个,进而对序列进行Enzyme Code和KEGG代谢途径的分析,未有序列注释到相关酶功能和KEGG代谢途径。
姚宇飞[6]（2015）在《巴西橡胶树单染色体显微分离及其8号染色体高通量测序的初步研究》文中研究表明橡胶是我国的战略物资。因具有胶乳产量高、质量优、经济寿命长和采胶容易等特点,巴西橡胶树（Hevea basiliensis）已成为全世界天然橡胶的唯一商业来源。因此对巴西橡胶树进行深入的基因组研究具有重要意义。目前研究者们已从橡胶树中克隆出420多种重要基因或cDNA,但这些基因都是从橡胶树基因组或cDNA文库中获得,不仅工作量大而且也无法确定它们在染色体上的位置及连锁关系。利用各种分子标记构建的橡胶树连锁遗传图饱和度也不够,直接用于育种研究难度较大,若能从单染色体入手进行研究,势必会降低难度及工作量,加快研究进程。但在目前国内外有关橡胶树的研究中,有关橡胶树单染色体高通量测序方面的研究尚未见报道。本研究拟从巴西橡胶树的单染色体入手,利用课题组已所建立并完善的巴西橡胶树单染色体微分离体系进行染色体分离,使用单细胞全基因组扩增方法来代替原有的LA-PCR体外扩增方法,对染色体进行体外扩增,并进行高通量测序,旨在为橡胶树基因组研究提供新的思路与方法,为更好的开展橡胶树分子辅助育种奠定基础。具体研究结果如下:（1）以巴西橡胶树热研7-33-97（2n=36）幼叶为材料,采用酶解去壁低渗法制片。对前人所建立的适宜巴西橡胶树单染色体显微分离的染色体标本制备方法进行优化,将前低渗时间优化为40 min,酶解时间优化为7 h 20 min,后低渗时间优化为30 min。（2）采用微细玻璃针法,成功的从巴西橡胶树热研7-33-97的中期细胞中随机分离出32条染色体（部分染色体被重复分离）,其中有7条来自于同一中期细胞内。（3）对单染色体体外单细胞全基因组扩增试剂盒进行了优化,将一轮指数式扩增循环数由17次优化为21次,二轮指数式扩增模板量优化至2μg,循环数由17次优化至10次。优化后所得扩增产物效果较好。（4）用单细胞全基因组扩增法（MALBAC）对从热研7-33-97品种中随机分离出的1条染色体进行了单染色体体外扩增。经Southern杂交证实其扩增产物来自于巴西橡胶树基因组,经荧光原位杂交（FISH）验证并结合核型分析确定出这1条染色体的序号为热研7-33-97的第8号染色体。证明了采用单细胞全基因组扩增法对巴西橡胶树单染色体进行体外扩增的可行性。（5）热研7-33-97第8号染色体经Illumina平台高通量测序并过滤测序结果后进行分析统计,共得到Reads为100 bp的有效序列33887084条,其中可与橡胶树基因组（RRIM600）比对上的Reads为5262483,比对率为15.53%,又经变异检测得到SNP位点112616个,InDel位点724个,SV位点20个。这些结果可为该物种的突变模式、进化历程研究及丰富基因组遗传图谱提供基础性资料。（6）本研究将热研7-33-97的8号染色体的双重过滤后的clean reads中随机选取5000条序列,又从其中随机选取500条序列与WGS数据库进行了比对,其中有30条与橡胶树的全基因组（RRIM600）序列同源性大于90%;又将上述的500条序列在线与NCBI网站上EST数据库进行比对,结果显示只有4条序列与数据库中的EST序列有高度同源性,更多有价值的信息有待进一步的挖掘。
陈学俊[7]（2014）在《巴西橡胶树热研7-33-97第1，5和9号染色体的分离及文库的构建》文中进行了进一步梳理橡胶是我国的战略物资。因具有胶乳产量高、质量优、经济寿命长和采胶容易等特点,巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）已成为全世界天然橡胶的唯一商业来源。因此对巴西橡胶树进行深入的基因组研究具有重要意义。目前研究者们已从橡胶树中克隆出420多种重要基因或cDNA,但这些基因都是从橡胶树基因组或cDNA文库中获得,不仅工作量大而且也无法确定它们在染色体上的位置及连锁关系。利用各种分子标记构建的橡胶树连锁遗传图饱和度也不够,直接用于育种研究难度较大。构建橡胶树单染色体文库,可以有效的解决上述问题。在目前国内外有关橡胶树文库构建的研究中,仅限在全基因组文库或cDNA文库方面,而有关橡胶树单染色体文库构建方面的研究尚未见报道。本研究从巴西橡胶树单染色体入手,运用单染色体微分离、微克隆技术,构建了巴西橡胶树单染色体微分离、微克隆技术体系,旨在为橡胶树基因组研究提供新的思路与方法,为更好的开展橡胶树分子辅助育种奠定基础。具体研究结果如下：（1）以巴西橡胶树热研7-33-97（2n=36）幼叶为材料,采用酶解去壁低渗法制片。对制片方法进行了优化,建立了适于巴西橡胶树单染色体显微分离的制片技术体系,制备出优质的染色体标本。（2）采用微细玻璃针法,通过对拉针、显微操作等关键步骤的摸索,初步建成了一整套适合于巴西橡胶树单染色体显微分离的技术体系。并利用这套体系成功的从巴西橡胶树热研7-33-97的中期细胞中分离出57条染色体（部分染色体被重复分离）,其中有18条来自于同一中期细胞内。（3）采用LA-PCR法对已分离出的3条巴西橡胶树染色体进行了单染色体体外扩增。经Southern杂交证实其扩增产物来自于巴西橡胶树基因组,经荧光原位杂交（FISH）验证并结合核型分析确定出这三条染色体的序号分别为热研7-33-97的第1、5及9号染色体。建立了从橡胶树单染色体分离、扩增再到后期验证的完整的试验技术体系。（4）利用热研7-33-97的第1、5及9号染色体的LA-PCR第二轮扩增产物经PCR介导克隆后,成功的构建出这3条染色体相应的微克隆文库。其中第1号染色体文库中包含9.6x104个克隆子,PCR检测显示插入片段的大小分布在300-1200bp之间,平均长度为600bp,文库覆盖率达到了1.3倍；第5号染色体文库中包含6.3×104个克隆子,PCR检测显示插入片段的大小分布在250-1100bp之间,平均长度为600bp,文库覆盖率达到了1.1倍；第9号染色体文库中包含4.9×104个克隆子,PCR检测显示插入片段的大小分布在250-1150bp之间,平均长度为650bp,文库覆盖率达到了1倍左右。（5）随机对巴西橡胶树热研7-33-97的第5号染色体文库中的100个阳性克隆子进行了测序,共得到78条序列片段,去除重复后还有66条,其片段大小分布在196-1030bp范围内。将这66条序列进行BLAST在线同源比对,结果显示其中有15条序列与WGS数据库中巴西橡胶树（RRIM600）全基因组片段的同源性大于90%,共有L-5Chr-16、L-5Chr-88以及L-5Chr-57等3个序列与EST数据库中的多条表达序列标签同源性大于90%。这些结果可为该条染色体分子标记的筛选、重要基因克隆和定位及丰富基因组遗传图谱的饱和度提供基础性资料。
王英,李国丽,汪激扬,庄南生,李维国[8]（2012）在《植物单染色体微分离技术研究进展》文中提出首先介绍了单染色体微分离技术的意义,然后综述了微细玻璃针分离法、显微激光分离法、流式细胞分类仪法、显微激光切割与微细玻璃针结合等4种染色体微分离方法在植物目标染色体分离、文库构建、特异性探针筛选、高密度分子标记连锁图谱构建等方面的研究情况,最后对其应用前景进行了展望。
肖青苹[9]（2012）在《银杏单染色体文库的建立与鉴定》文中研究指明银杏（Ginkgo biloba L.）是现存裸子植物中最古老的孑遗植物之一,人称“活化石”。银杏全身是宝,是我国特有而丰富的经济植物资源。由于银杏实生树20-30年才能看出结果,而雌雄树用途不同,因此银杏的早期性别鉴定不但具有重要的理论意义,还有重要的经济效益。但到目前为止,银杏的性别决定机制还不清楚。本试验运用单染色体微分离、微克隆技术,建立了银杏的四十二条单染色体文库：设计引物从银杏基因组中克隆了6个银杏性别相关的分子标记基因（雌雄各3个）,利用|dot（?）杂交技术,在DNA水平上鉴定出与银杏性别有关的单染色体文库,对银杏的早期性别区分、遗传育种以及基因的定位和克隆具有重要意义。
王发明[10]（2010）在《柚（citrus grandis Osbeck）单染色体AFLP分子标记体系及文库的建立》文中研究指明柚是我国重要的水果。柚遗传背景较复杂,生产周期长,一直以来难以建立精确的物理图谱,这为进行柚基因组学的研究、分子标记辅助育种以及克隆一些重要的园艺性状基因造成了困难,染色体微分离和微克隆技术的应用为柚类遗传学的研究提供了新的思路。针对柚单染色体极小,形态辨别和微分离困难,本试验采用随机微分离的方法,通过LA-PCR-AFLP技术对染色体进行同源划分,并使用Southern杂交技术对单染色体微克隆质量和同源划分的正确性进行鉴定和验证。最后将各同源单染色体文库合并,能大大提高同源染色体文库的覆盖度,如果将各类同源染色体文库合并,则建立了整个柚染色体文库。1、对柚染色体的制片和微分离技术进行了研究。比较了压片-液氮速冻揭片法和悬液法制片的优劣；优化了纤维素果胶酶的浓度比例和酶解时间：2%纤维素酶和1%果胶酶,酶解1 h；比较了卡宝品红和铁钒苏木精两种染色方法,并最终选用了卡宝品红染色法；对玻璃针的制备、分离方法进行了选择和改进。良好的制片效果大大提高了单染色体显微分离的质量和效率。2、针对柚单染色体微克隆受外源污染干扰严重的情况,通过对比试验,对柚单染色体LA-PCR-AFLP技术体系中外源DNA污染问题中不同试验用水、加接头连接前后步骤对水污染的敏感度以及LA-PCR形成的非特异性亮带现象进行了研究。结果表明：8种试验用水中BT水（Bioteke, RNase-free and DNase-free Water）最佳；水的质量对LA-PCR过程中接头连接之前的步骤影响最大,对加接头之后的步骤也有一定的影响；非特异性亮带为引物自连形成的多聚体,与外源污染无关。同时试验了Southern杂交对柚单染色体LA-PCR过程中外源污染程度的检测,及细胞质污染的影响等。本试验通过对外源污染的来源和关键步骤实施严格防控,经过dot blot验证,使外源污染能够得到有效控制。这为建立高质量的柚单染色体文库奠定了基础。3、针对柚叶片多糖的情况,通过3种基因组DNA提取方法比较,最终选用SDS-KAC法并获得了较高质量的柚基因组DNA；对酶切时间和ATP浓度对连接反应的影响进行了研究,证明1-5 h均能满足单染色体的酶切需要,但是为保证不同单染色体扩增结果的一致性,最后选择较长的酶切时间4-5 h；ATP连接终浓度在大于5mM的时候可能抑制连接反应,而在制接头的时候不额外添加ATP也不会对实验结果造成太大影响；显微分离了166个柚单染色体,并通过dot-blot杂交和Southern印迹杂交进行了验证,从中筛选出信号较强的55个单染色体用于进一步试验。对柚单染色体LA-PCR-AFLP技术体系中的关键参数进行了优化,结果表明：退火温度较高的程序TD3（退火梯度：72℃→65℃30 s（-0.5℃/cyc））扩增效果较好；稀释100倍（10 ng）为最适模板量；筛选出了扩增多态性较好的10组引物对；最终建立了5张不同引物对组合扩增的柚不同单染色体的AFLP-SDS-PAGE指纹图谱。4、获得了高质量的官溪蜜柚总RNA,逆转录合成双链cDNA,经LA-PCR过程,获得cDNA扩增产物。获得的产物经纯化后与pMD18-T-vector载体连接,进行T-A克隆,获得大量cDNA文库片段的克隆子。从其中随机选择134个克隆子经纯化后用于后续试验。5、建立了适用于柚单染色体同源鉴定的dot-blot杂交体系：1)探针制备时DIG-High Prime （vial 1）的用量可减少为2.5μL；2)单染色体严格纯化后制作探针,探针制成后不用再纯化；3)使用柚单染色体第一轮LA-PCR产物制作探针效果较好；4)柚单染色体差异片段和柚cDNA扩增文库片段必须经纯化后作为模板；5)当使用柚单染色体探针进行dot-blot杂交时,柚单染色体文库、差异片段、柚cDNA扩增文库片段模板的上样量应小于1 ng。6、对5对引物扩增的AFLP-SDS-PAGE指纹图谱多态性片段的聚类分析,初步把55条单染色体体划分为10类；将这10类染色体分别与134个cDNA扩增文库克隆子进行dot-blot杂交,验证了不同单染色体筛选cDNA克隆文库进行同源性划分的可行性。通过进一步的Southern杂交验证,确保了同源划分的正确性。本试验对柚单染色体进行了初步的同源划分和建立了同源染色体文库,并经过Southern杂交验证和鉴定。但染色体文库的完整性和质量可能仍然不够高,需要不断的进行修弥补和修正。若要建立比较完整和高质量的文库，还要做大量的补充和验证工作。单染色体文库的建立为以后建立柚精确物理图谱奠定了基础,对于进一步进行柚基因组学和遗传学研究具有重要的理论和现实意义。同时为柚分子遗传育种和优良基因的定位和克隆提供了更加方便、准确、快捷的方法。
二、银杏第1染色体DNA文库的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、银杏第1染色体DNA文库的构建（论文提纲范文）
（1）巴西橡胶树热研7-33-97五条染色体文库构建及其序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 橡胶树的研究概况 |
| 1.1.1 橡胶树蛋白组学的研究进展 |
| 1.1.2 橡胶树抗寒性的研究进展 |
| 1.1.3 分子标记技术在橡胶树中的研究 |
| 1.2 染色体显微分离及体外扩增 |
| 1.2.1 染色体显微分离定义 |
| 1.2.2 染色体显微分离 |
| 1.2.3 植物染色体体外扩增方法 |
| 1.3 单染色体的鉴定 |
| 1.3.1 Southern杂交鉴定 |
| 1.3.2 FISH杂交鉴定 |
| 1.3.3 核型分析 |
| 1.4 单染色体文库的构建与文库的应用进展 |
| 1.4.1 单染色体文库的构建 |
| 1.4.2 单染色体文库的鉴定 |
| 1.4.3 热带作物单染色体文库构建研究进展 |
| 1.4.4 橡胶树单染色体文库构建研究进展 |
| 1.5 序列分析及基因功能注释 |
| 1.5.1 序列比对 |
| 1.5.2 基因功能注释 |
| 1.5.3 Blast2GO |
| 1.5.4 Blast2GO的应用 |
| 1.6 本研究的目的意义及技术路线 |
| 1.6.1 研究的目的意义 |
| 1.6.2 本研究的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验的主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 染色体标本的制备 |
| 2.2.2 染色体的显微分离 |
| 2.2.3 单染色体的体外扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.2.5 巴西橡胶树基因组DNA的提取与检测 |
| 2.2.6 Southern blot验证 |
| 2.2.7 FISH验证 |
| 2.2.8 单染色体微克隆文库的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 巴西橡胶树热研7-33-97单染色体显微分离 |
| 3.2 巴西橡胶树热研7-33-97单染色体DNA体外扩增及检测 |
| 3.3 巴西橡胶树热研7-33-97单染色体扩增产物的鉴定 |
| 3.3.1 热研7-33-97基因组DNA检测及酶切检测 |
| 3.3.2 热研7-33-97五条单染色体扩增产物的Southern杂交验证 |
| 3.3.3 热研7-33-97单染色体扩增产物的FISH杂交验证 |
| 3.4 巴西橡胶树热研7-33-97的第5、6、11、13和14号染色体文库的构建与初步分析 |
| 3.4.1 巴西橡胶树热研7-33-97的第5、6、11、13和14号染色体文库的构建 |
| 3.4.2 阳性克隆子插入片段大小检测 |
| 3.4.3 阳性克隆子测序后经Blast分析及序列注释 |
| 3.4.4 巴西橡胶树热研7-33-97五条染色体文库序列Blast2GO软件分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 巴西橡胶树染色体标本制备方法的选择 |
| 4.2 目标单染色体分离及有关污染的防控 |
| 4.3 巴西橡胶树单染色体体外扩增的方法 |
| 4.4 巴西橡胶树单染色体文库的构建及文库质量鉴定 |
| 4.5 单染色体文库部分克隆子BLAST2GO分析 |
| 4.6 巴西橡胶树单染色体文库的构建及文库信息丰富 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 附录Ⅳ |
| 试剂的配制 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（2）巴西橡胶树热研7-33-97六条染色体文库的构建及序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 巴西橡胶树的研究概况 |
| 1.1.1 巴西橡胶树胶乳和死皮病相关的基因研究进展 |
| 1.1.2 巴西橡胶树胶乳生物合成中相关的关键酶及相关基因研究进展 |
| 1.1.3 分子标记在橡胶树研究中的进展 |
| 1.2 染色体显微分离和微克隆技术研究概况 |
| 1.2.1 染色体显微分离和微克隆技术定义 |
| 1.2.2 染色体显微分离方法 |
| 1.2.3 染色体体外扩增方法 |
| 1.2.4 染色体验证 |
| 1.3 染色体文库的构建及进展 |
| 1.3.1 质粒文库及其在植物染色体文库应用进展 |
| 1.3.2 热带植物单染色体文库构建研究情况 |
| 1.3.3 橡胶树单染色体分离及文库构建情况 |
| 1.4 测序技术的发展及序列分析 |
| 1.4.1 DNA测序技术 |
| 1.4.2 序列比对 |
| 1.4.3 基因功能注释与Blast2GO |
| 1.4.4 Blast2GO软件在橡胶树基因注释方面的应用 |
| 1.5 本研究的目的意义及技术路线 |
| 1.5.1 研究的目的意义 |
| 1.5.2 本研究的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验试剂 |
| 2.1.2 试验的主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 染色体标本的制备 |
| 2.2.2 染色体的显微分离 |
| 2.2.3 单染色体的体外扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.2.5 巴西橡胶树基因组DNA的提取 |
| 2.2.6 Dot-blot验证 |
| 2.2.7 Southern blot验证 |
| 2.2.8 FISH验证 |
| 2.2.9 巴西橡胶树单染色体微克隆文库的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 巴西橡胶树染色体标本制备的改良 |
| 3.2 单染色体显微分离过程 |
| 3.3 巴西橡胶树热研7-33-97基因组DNA检测 |
| 3.4 单染色体DNA体外扩增及检测 |
| 3.4.1 单条染色体体外LA-PCR扩增结果 |
| 3.4.2 单染色体第二轮LA-PCR扩增产物的双色FISH杂交验证 |
| 3.5 巴西橡胶树热研7-33-97的第1、2、3、5、13及16号染色体文库的构建与初步分析 |
| 3.5.1 巴西橡胶树热研7-33-97的第1、2、3、5、13及16号染色体文库的构建 |
| 3.5.2 阳性克隆子插入片段大小检测 |
| 3.5.3 阳性克隆子测序后分析及序列注释 |
| 3.5.4 热研7-33-97六条染色体文库序列Blas2GO软件分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 橡胶树染色体标本制备方法的选择及改进 |
| 4.2 目标单染色体分离及有关污染的防控 |
| 4.3 单染色体外扩增方法的选择与鉴定 |
| 4.4 巴西橡胶树热研7-33-97文库构建分析 |
| 4.5 测序序列Blast2GO分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 附录Ⅳ |
| 附录Ⅴ |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）巴西橡胶树热研7-33-97五条染色体文库的构建及序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 巴西橡胶树的研究概况 |
| 1.1.1 巴西橡胶树种质资源概况 |
| 1.1.2 巴西橡胶树抗病性和抗寒性研究进展 |
| 1.1.3 分子标记技术在橡胶树研究中的进展 |
| 1.1.4 巴西橡胶树基因组测序进展 |
| 1.2 染色体显微分离和微克隆技术 |
| 1.2.1 染色体显微分离和微克隆技术定义 |
| 1.2.2 染色体显微分离方法 |
| 1.2.3 植物染色体体外扩增方法 |
| 1.3 染色体的鉴定 |
| 1.3.1 Dot-blot杂交鉴定 |
| 1.3.2 Southen blot杂交鉴定 |
| 1.3.3 FISH杂交鉴定 |
| 1.3.4 核型分析鉴定 |
| 1.4 染色体文库的构建与鉴定 |
| 1.4.1 染色体文库的构建方法 |
| 1.4.2 文库的鉴定 |
| 1.4.3 质粒文库在植物染色体文库构建中的应用进展 |
| 1.4.4 热带植物单染色体文库构建研究进展 |
| 1.4.5 橡胶树单染色体文库构建研究进展 |
| 1.5 序列分析及基因功能注释 |
| 1.5.1 序列比对 |
| 1.5.2 基因功能注释 |
| 1.5.3 基因本体论与Blast2GO |
| 1.6 本研究的目的意义及技术路线 |
| 1.6.1 研究的目的意义 |
| 1.6.2 本研究的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验的主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 染色体标本的制备 |
| 2.2.2 染色体的显微分离 |
| 2.2.3 单染色体的体外扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.2.5 巴西橡胶树基因组DNA的提取与检测 |
| 2.2.6 Dot-blot验证 |
| 2.2.7 Southern blot验证 |
| 2.2.8 FISH验证 |
| 2.2.9 单染色体微克隆文库的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 巴西橡胶树热研7-33-97单染色体显微分离过程 |
| 3.2 巴西橡胶树热研7-33-97单染色体DNA体外扩增及检测 |
| 3.3 巴西橡胶树热研7-33-97单染色体扩增产物的鉴定 |
| 3.3.1 热研7-33-97基因组DNA检测及酶切检测 |
| 3.3.2 热研7-33-97单染色体扩增产物的Dot-blot杂交分析 |
| 3.3.3 热研7-33-97五条单染色体扩增产物的Southern blot杂交验证 |
| 3.3.4 热研7-33-97单染色体扩增产物的FISH杂交验证 |
| 3.4 巴西橡胶树热研7-33-97的第3、7、13、15及16号染色体文库的构建与初步分析 |
| 3.4.1 巴西橡胶树单染色体文库构建体系的优化 |
| 3.4.2 巴西橡胶树热研7-33-97的第3、7、13、15及16号染色体文库的构建 |
| 3.4.3 阳性克隆子插入片段大小检测 |
| 3.4.4 阳性克隆子测序后blast分析及序列注释 |
| 3.4.5 巴西橡胶树热研7-33-97五条染色体文库序列Blast2GO软件分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 巴西橡胶树染色体标本制备方法的选择 |
| 4.2 目标单染色体分离及有关污染的防控 |
| 4.3 巴西橡胶树单染色体体外扩增的方法及扩增产物的鉴定 |
| 4.3.1 单染色体体外扩增方法的选择 |
| 4.3.2 单染色体扩增产物的鉴定 |
| 4.4 巴西橡胶树单染色体文库的构建及文库质量鉴定 |
| 4.5 单染色体文库部分克隆子BLAST2GO分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 附录Ⅳ |
| 本研究资金来源 |
| 硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）巴西橡胶树热研7-33-97第4，12，17和18号染色体文库的构建及序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 巴西橡胶树研究概况 |
| 1.1.1 巴西橡胶树种质资源现状 |
| 1.1.2 巴西橡胶树重要栽培品种热研7-33-97品种概况 |
| 1.1.3 巴西橡胶树细胞学研究进展 |
| 1.1.4 巴西橡胶树分子生物学研究进展 |
| 1.2 染色体微分离和微克隆技术的研究进展 |
| 1.2.1 染色体微分离、微克隆技术的发展概况 |
| 1.2.2 植物单染色体微分离及微克隆技术的方法 |
| 1.2.3 单染色体微分离及微克隆技术在植物中的应用 |
| 1.2.4 单染色体微克隆文库构建的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的意义及技术路线 |
| 1.3.1 研究的目的意义 |
| 1.3.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验的主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 染色体标本的制备 |
| 2.2.3 单染色体的显微分离 |
| 2.2.4 单染色体的体外扩增 |
| 2.2.5 单染色体扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.2.6 单染色体扩增产物的Dot-blot杂交验证 |
| 2.2.7 单染色体扩增产物的FISH检测及分析 |
| 2.2.8 单染色体微克隆文库的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 巴西橡胶树热研7-33-97中期细胞染色体标本的制备 |
| 3.2 巴西橡胶树热研7-33-97单染色体的显微分离 |
| 3.3 巴西橡胶树热研7-33-97单染色体的LA-PCR体外扩增结果 |
| 3.4 巴西橡胶树热研7-33-97单染色体LA-PCR扩增产物的鉴定 |
| 3.4.1 基因组DNA提取和酶切 |
| 3.4.2 Dot-blot探针效率评估结果 |
| 3.4.3 单染色体第二轮LA-PCR扩增产物的Dot-blot杂交验证 |
| 3.4.4 单染色体第二轮LA-PCR扩增产物的FISH杂交检测 |
| 3.5 巴西橡胶树热研7-33-97第4、12、17及18号染色体文库的构建与初步分析 |
| 3.5.1 第4、12、17及18号染色体文库的构建 |
| 3.5.2 插入片段的PCR检测结果 |
| 3.5.3 单染色体文库部分阳性克隆子序列的Blast分析及注释 |
| 3.5.4 第4、12、17和18号染色体文库序列的Blast2GO分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于制备染色体标本的讨论 |
| 4.2 关于染色体微分离和微克隆问题的讨论 |
| 4.2.1 关于染色体微分离的问题讨论 |
| 4.2.2 关于染色体微克隆的问题讨论 |
| 4.2.3 关于外源污染的防控问题讨论 |
| 4.3 关于扩增产物的验证问题的讨论 |
| 4.3.1 关于Dot-blot验证的讨论 |
| 4.3.2 关于FISH验证中关键步骤的讨论 |
| 4.4 关于文库质量的讨论 |
| 4.5 关于部分测序序列的Blast2GO分析讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 项目资金来源与论文发表情况 |
| 致谢 |
（5）巴西橡胶树热研7-33-97三条染色体文库的构建及第4号染色体高通量测序初步分析（论文提纲范文）
| 基金来源 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 巴西橡胶树的研究概况 |
| 1.1.1 巴西橡胶树胶乳和死皮病相关的基因研究进展 |
| 1.1.2 巴西橡胶树胶乳生物合成中相关的关键酶及相关基因研究进展 |
| 1.1.3 分子标记在橡胶树研究中的进展 |
| 1.1.4 新一代测序技术在橡胶树上的研究进展 |
| 1.2 染色体显微分离和微克隆技术研究概况 |
| 1.2.1 染色体显微分离和微克隆技术定义 |
| 1.2.2 常用的染色体显微分离方法 |
| 1.2.3 染色体体外扩增方法的进展 |
| 1.2.4 染色体扩增产物的验证及微克隆技术的应用 |
| 1.3 植物单染色体文库的构建研究进展 |
| 1.3.1 质粒文库及其在植物染色体文库应用进展 |
| 1.3.2 热带植物单染色体分离及文库构建研究进展 |
| 1.4 高通量测序技术的研究进展 |
| 1.4.1 测序平台的技术原理 |
| 1.4.2 高通量测序技术在植物分子生物学研究方面的应用情况 |
| 1.4.2.1 高通量测序技术在植物全基因组测序中的应用 |
| 1.4.2.2 高通量测序技术在植物重测序中的应用 |
| 1.4.2.3 高通量测序技术在植物转录组测序中的应用 |
| 1.4.2.4 高通量测序技术在植物表观遗传学中的应用 |
| 1.4.3 高通量测序技术在热带林木植物中的应用 |
| 1.5 本研究的目的意义及技术路线 |
| 1.5.1 研究的目的意义 |
| 1.5.2 本研究的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验试剂 |
| 2.1.2 试验的主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 染色体标本的制备 |
| 2.2.2 染色体的显微分离 |
| 2.2.3 单染色体的体外扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.2.5 巴西橡胶树基因组DNA的提取 |
| 2.2.6 Southernblot验证 |
| 2.2.7 FISH验证 |
| 2.2.8 巴西橡胶树单染色体微克隆文库的构建 |
| 2.2.9 高通量测序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 巴西橡胶树染色体标本的制备的优化 |
| 3.2 单染色体显微分离过程 |
| 3.3 巴西橡胶树热研7-33-97基因组DNA检测 |
| 3.4 单染色体DNA体外扩增及检测 |
| 3.4.1 单条染色体体外LA-PCR扩增结果 |
| 3.4.2 单染色体体外MALBAC-PCR扩增结果 |
| 3.5 单染色体扩增产物的鉴定 |
| 3.5.1 两种扩增方法Southern杂交验证 |
| 3.5.2 单染色体第二轮LA-PCR扩增产物的FISH杂交验证 |
| 3.5.3 单染色体MALBAC-PCR第二轮扩增产物的FISH杂交验证 |
| 3.6 巴西橡胶树热研7-33-97的第10、11及14号染色体文库的构建与初步分析 |
| 3.6.1 巴西橡胶树热研7-33-97的第10、11及14号染色体文库的构建 |
| 3.6.2 阳性克隆子插入片段大小检测 |
| 3.6.3 阳性克隆子测序后分析及序列注释 |
| 3.7 巴西橡胶树热研7-33-97的第4号染色体高通量测序及初步分析 |
| 3.7.1 第4号染色体高通量测序样品检测结果 |
| 3.7.2 热研7-33-97第4号染色体高通量测序结果数据过滤处理与质控 |
| 3.7.3 热研7-33-97第4号染色体变异检测 |
| 3.7.4 热研7-33-97第4号染色体高通量测序结果与橡胶树基因组数据库比对 |
| 3.7.5 热研7-33-97第4号染色体高通量测序结果与橡胶树EST数据库比对 |
| 3.7.6 热研7-33-97第4号染色体高通量测序结果Blsat2GO软件分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 橡胶树染色体标本制备方法的选择及改进 |
| 4.2 目标单染色体分离及有关污染的防控 |
| 4.3 单染色体外扩增方法的选择 |
| 4.4 文库的构建及测序序列Blast2GO分析 |
| 4.5 高通量测序序列分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 致谢 |
（6）巴西橡胶树单染色体显微分离及其8号染色体高通量测序的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 染色体显微分离克隆技术 |
| 1.1.1 染色体显微分离克隆技术的概念及意义 |
| 1.1.2 染色体显微分离克隆技术的方法及特点 |
| 1.1.3 染色体显微分离克隆技术的发展及应用 |
| 1.2 染色体体外扩增的方法 |
| 1.2.1 接头引物PCR法(LA-PCR) |
| 1.2.2 简并寡聚核苷酸引物PCR法(DOP-PCR) |
| 1.2.3 单细胞全基因组扩增(SWGA) |
| 1.3 染色体鉴定 |
| 1.3.1 southern杂交鉴定 |
| 1.3.2 FISH杂交鉴定 |
| 1.3.3 核型分析鉴定 |
| 1.4 高通量测序研究进展 |
| 1.5 林木植物及热带植物单染色体研究现状 |
| 1.6 本研究的目的意义及技术路线 |
| 1.6.1 研究的目的意义 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验的主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 染色体标本的制备 |
| 2.2.2 染色体的显微分离 |
| 2.2.3 单染色体的体外扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.2.5 巴西橡胶树基因组DNA的提取 |
| 2.2.6 Southern杂交验证 |
| 2.2.7 FISH验证 |
| 2.2.8 高通量测序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 适于分离巴西橡胶树单染色体标本制备方法的优化 |
| 3.2 巴西橡胶树单染色体的显微分离 |
| 3.3 单染色体DNA体外单细胞全基因组扩增结果 |
| 3.4 单染色体扩增产物的鉴定 |
| 3.4.1 巴西橡胶树热研7-33-97基因组DNA提取 |
| 3.4.2 单染色体第二轮单细胞全基因组MALBAC-PCR产物的Southern杂交分析 |
| 3.4.3 单染色体第二轮单细胞全基因组MALBAC-PCR产物的FISH杂交验证 |
| 3.5 巴西橡胶树热研7-33-97第8号染色体的高通量测序 |
| 3.5.1 热研7-33-97第8号染色体MALBAC-PCR第二轮扩增产物质量检测 |
| 3.5.2 热研7-33-97第8号染色体MALBAC-PCR第二轮扩增产物高通量测序一重过滤数据的处理及质控 |
| 3.5.3 热研7-33-97第8号染色体MALBAC-PCR第二轮扩增产物高通量测序双重过滤数据的比对及质控 |
| 3.5.4 热研7-33-97第8号染色体变异检测 |
| 3.5.5 热研7-33-97第8号染色体clean reads在线BLAST比对 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于显微分离方法的选择 |
| 4.2 关于橡胶树单染色体体外扩增方法的选择 |
| 4.3 关于全基因组扩增技术的选择 |
| 4.4 关于对亿康基因公司单细胞全基因组扩增试剂盒的优化 |
| 4.5 关于序列分析结果的讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 致谢 |
（7）巴西橡胶树热研7-33-97第1，5和9号染色体的分离及文库的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 巴西橡胶树分子细胞学研究概况 |
| 1.1.1 关于巴西橡胶树的细胞学研究 |
| 1.1.2 巴西橡胶树分子生物学研究概况 |
| 1.2 染色体显微分离及微克隆技术的研究概况 |
| 1.2.1 染色体显微分离及微克隆技术的发展概况 |
| 1.2.2 植物单染色体显微分离及微克隆技术的方法与主要流程 |
| 1.2.3 单染色体显微分离及微克隆技术在植物中的应用 |
| 1.2.4 单染色体显微分离及微克隆技术在热带作物中的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的意义及技术路线 |
| 1.3.1 研究的目的意义 |
| 1.3.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验的主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 染色体标本的制备 |
| 2.2.2 染色体的显微分离 |
| 2.2.3 单染色体的体外扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.2.5 巴西橡胶树基因组DNA的提取 |
| 2.2.6 Southern杂交验证 |
| 2.2.7 FISH验证 |
| 2.2.8 巴西橡胶树单染色体微克隆文库的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 适合巴西橡胶树单染色体分离的染色体标本制备方法的建立 |
| 3.2 巴西橡胶树单染色体显微分离体系的建立 |
| 3.3 单染色体DNA的体外LA-PCR扩增结果 |
| 3.4 单染色体扩增产物的鉴定 |
| 3.4.1 巴西橡胶树热研7-33-97基因组DNA提取 |
| 3.4.2 单染色体第二轮LA-PCR扩增产物的Southern杂交分析 |
| 3.4.3 单染色体第二轮LA-PCR扩增产物的FISH杂交验证 |
| 3.5 巴西橡胶树热研7-33-97的第1、5及9号染色体文库的构建与初步分析 |
| 3.5.1 巴西橡胶树热研7-33-97的第1、5及9号染色体文库的构建 |
| 3.5.2 插入片段大小的PCR检测结果 |
| 3.5.3 热研7-33-97的第5号染色体文库部分克隆子测序及初步分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于染色体标本的制备 |
| 4.1.1 关于材料的预处理的探讨 |
| 4.1.2 关于制片方法与酶解时间 |
| 4.2 关于染色体显微分离过程的问题 |
| 4.3 外源污染的防控问题 |
| 4.4 关于扩增产物的验证等问题 |
| 4.4.1 验证方法 |
| 4.4.2 FISH验证过程假阳性干扰的问题 |
| 4.5 单染色体微克隆文库质量的讨论 |
| 4.6 在线比对结果的讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 附录Ⅳ |
| 致谢 |
（8）植物单染色体微分离技术研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 植物单染色体微分离的意义 |
| 2 染色体微分离的方法 |
| 2.1 微细玻璃针分离法 |
| 2.2 显微激光分离法 |
| 2.3 流式细胞分类仪法 |
| 2.4 显微激光切割与微细玻璃针结合的方法 |
| 3 植物单染色体的鉴定 |
| 4 总结与展望 |
（9）银杏单染色体文库的建立与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 单染色体显微分离 |
| 1.1.1 目标染色体的识别 |
| 1.1.2 目标染色体的分离 |
| 1.2 单染色体微克隆技术及其在植物上的研究进展 |
| 1.3 植物染色体微分离、微切割和微扩增技术的的应用及发展 |
| 1.3.1 特定染色体或染色体区段的DNA文库构建 |
| 1.3.2 构建高密度分子标记连锁图谱和分离重要基因 |
| 1.3.3 基因组物理作图（physical map） |
| 1.3.4 染色体进化研究 |
| 1.4 单染色体文库的鉴定 |
| 1.5 银杏分子技术的研究进展 |
| 1.6 银杏性别鉴定研究现状 |
| 1.7 研究意义 |
| 1.8 技术路线 |
| 第二章 银杏单染色体的微分离 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 染色体标本的制备 |
| 2.1.3 玻璃针的拉制 |
| 2.1.4 染色体的微分离 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 材料的处理和固定 |
| 2.2.2 染色体制片 |
| 2.2.3 单染色体的显微分离 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 材料的预处理和固定 |
| 2.3.2 低渗处理 |
| 2.3.3 玻璃针的制备 |
| 2.3.4 外源污染的防控 |
| 第三章 银杏基因组 DNA 的提取及单染色体的体外扩增 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.2 银杏基因组DNA的提取 |
| 3.2.1 银杏基因组DNA的提取 |
| 3.2.2 DNA的质量检测 |
| 3.2.3 DNA的浓度检测 |
| 3.3 基因组DNA酶切 |
| 3.4 银杏单染色体的体外扩增 |
| 3.4.1 LA-PCR预扩增过程 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 银杏基因组DNA的提取和酶切 |
| 3.5.2 银杏单染色体的LA-PCR扩增 |
| 3.6 讨论 |
| 3.6.1 银杏基因组DNA的提取 |
| 3.6.2 单染色体的体外扩增 |
| 3.6.3 单染色体体外扩增过程中的污染控制 |
| 第四章 银杏单染色体文库的鉴定和筛选 |
| 4.1 试剂和材料 |
| 4.1.1 试剂配制 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 银杏性别标记基因的克隆 |
| 4.2.2 单染色体文库的来源真实性鉴定 |
| 4.2.3 银杏性染色体的鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 引物扩增 |
| 4.3.2 菌液验证 |
| 4.3.3 探针效率评估 |
| 4.3.4 单染色体文库的来源真实性鉴定 |
| 4.3.5 与性别有关的银杏单染色体文库的筛选 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）柚（citrus grandis Osbeck）单染色体AFLP分子标记体系及文库的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 染色体制片技术 |
| 1.1 材料的预处理 |
| 1.2 染色体制片方法 |
| 1.3 染色方法的选择 |
| 2 单染色体显微分离 |
| 2.1 目标染色体识别 |
| 2.2 染色体微分离和微切割 |
| 2.2.1 微细玻璃针法 |
| 2.2.2 激光显微切割法 |
| 2.2.3 流式细胞仪分类法 |
| 3 单染色体微克隆技术及其在植物上的研究进展 |
| 4 植物染色体微分离、微切割和微扩增技术的的应用及发展 |
| 4.1 特定染色体或染色体区段的DNA文库构建 |
| 4.2 构建高密度分子标记连锁图谱和分离重要基因 |
| 4.3 基因组物理作图 |
| 4.4 染色体进化研究 |
| 4.5 单染色体微分离、微克隆技术在柚类植物上的应用 |
| 5 AFLP分子标记技术及其在柚类植物上的应用 |
| 5.1 AFLP分子标记技术特点 |
| 5.2 近两年AFLP技术在植物研究中的应用 |
| 5.2.1 遗传图谱构建 |
| 5.2.2 遗传多样性和种质亲缘关系鉴定 |
| 5.2.3 QTLs定位 |
| 5.2.4 AFLP在柚类果树上的应用 |
| 6 单染色体微分离、微切割和微扩增过程中核外污染的防控 |
| 7 单染色体微克隆及其文库的鉴定 |
| 8 试验内容 |
| 9 实验手段 |
| 10 关键技术 |
| 11 技术路线 |
| 12 本试验的特色与创新之处 |
| 第一章 柚染色体制片和显微分离 |
| 1. 试验材料和试剂 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 2 试验方法 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 染色体制片 |
| 3.2 单染色体的显微分离 |
| 4 讨论 |
| 4.1 预处理和固定 |
| 4.2 前低渗 |
| 4.3 酶解去壁 |
| 4.4 后低渗 |
| 4.5 压片-液氮速冻揭片法和悬液法 |
| 4.6 染色 |
| 4.7 显微分离 |
| 第二章 柚(Citrus grandis Osbeck)单染色体LA-PCR-AFLP技术体系中外源污染的防控 |
| 1. 试验材料和方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 2. 结果和分析 |
| 2.1 8种不同试验用水的比较分析 |
| 2.2 Bioteke水(OW水)重复性分析 |
| 2.3 Southern印迹杂交验证BT水外源DNA污染程度 |
| 2.4 Bioteke水(OW水)用于柚单染色体LA-PCR-AFLP分析 |
| 2.5 单染色体微克隆过程中不同步骤对水污染的敏感性分析 |
| 2.6 LA-PCR多聚物分析 |
| 2.7 细胞质污染对柚单染色体LA-PCR的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三章 柚(Citrus grandis Osbeck)单染色体LA-PCR-AFLP技术体系的建立 |
| 1 试验材料和试剂 |
| 2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 柚基因组DNA的提取 |
| 3.2 柚单染色体微分离和LA-PCR预扩增 |
| 3.2.1 LA-PCR反应中几个问题的研究 |
| 3.3 柚不同单染色体微分离和微克隆产物的dot blot杂交验证 |
| 3.4 柚不同单染色体微分离和微克隆产物的Southern blot杂交验证 |
| 3.5 选择性扩增体系优化 |
| 3.5.1 反应程序优化 |
| 3.5.2 模板浓度梯度分析 |
| 3.5.3 引物筛选 |
| 3.5.4 不同型号PCR仪对反应结果的影响 |
| 3.6 柚单染色体AFLP-SDS-PAGE图谱的建立 |
| 3.7 柚各单染色体差异片段的分析 |
| 4 讨论 |
| 第四章 柚cDNA扩增文库的建立 |
| 1 试验材料和试剂 |
| 2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 柚总RNA的提取 |
| 3.2 cDNA双链的合成及扩增 |
| 3.3 cDNA扩增文库的建立 |
| 4 讨论 |
| 4.1 琯溪蜜柚总RNA的提取 |
| 4.2 如何提高连接转化效率 |
| 4.3 cDNA文库片段的菌液PCR |
| 第五章 柚单染色体文库dot blot杂交体系的建立 |
| 1 试剂和材料 |
| 2 试验方法 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 探针制备中DIG-High Prime(vial 1)用量的优化 |
| 3.2 探针的纯化 |
| 3.3 第一轮与第二轮扩增产物制备探针的比较 |
| 3.4 杂交模板的纯化 |
| 3.5 单染色体探针对外源DNA污染检测的灵敏度 |
| 4 讨论 |
| 第六章 柚单染色体文库的建立 |
| 1. 试剂和材料 |
| 2 试验方法 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 55条单染色体的聚类分析 |
| 3.2 不同类别单染色体对cDNA克隆片段的dot blot杂交 |
| 3.3 同源单染色体划分的进一步验证 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、银杏第1染色体DNA文库的构建（论文参考文献）
- [1]巴西橡胶树热研7-33-97五条染色体文库构建及其序列分析[D]. 王波. 海南大学, 2018(08)
- [2]巴西橡胶树热研7-33-97六条染色体文库的构建及序列分析[D]. 张志丹. 海南大学, 2018(08)
- [3]巴西橡胶树热研7-33-97五条染色体文库的构建及序列分析[D]. 马梦晨. 海南大学, 2017(07)
- [4]巴西橡胶树热研7-33-97第4，12，17和18号染色体文库的构建及序列分析[D]. 马梦茹. 海南大学, 2017(07)
- [5]巴西橡胶树热研7-33-97三条染色体文库的构建及第4号染色体高通量测序初步分析[D]. 殷卉. 海南大学, 2016(01)
- [6]巴西橡胶树单染色体显微分离及其8号染色体高通量测序的初步研究[D]. 姚宇飞. 海南大学, 2015(03)
- [7]巴西橡胶树热研7-33-97第1，5和9号染色体的分离及文库的构建[D]. 陈学俊. 海南大学, 2014(07)
- [8]植物单染色体微分离技术研究进展[J]. 王英,李国丽,汪激扬,庄南生,李维国. 中国农学通报, 2012(15)
- [9]银杏单染色体文库的建立与鉴定[D]. 肖青苹. 福建农林大学, 2012(12)
- [10]柚（citrus grandis Osbeck）单染色体AFLP分子标记体系及文库的建立[D]. 王发明. 福建农林大学, 2010(07)