一、精子载体转基因技术的研究进展（论文文献综述）
代敏敏[1]（2020）在《精子载体制备转基因鸡方法研究》文中研究表明精子载体介导的转基因技术操作简单,成本低廉,自Lvaitran 1989年提出以来受到了人们的广泛关注。但是由于精子载体法精子存在在体外与外源DNA共孵育使精子活力下降影响与卵细胞结合使受精困难、外源DNA无法整合到动物细胞基因组等缺陷,很大程度上限制了精子载体技术的发展与应用。CRISPR/Cas9系统目前已经在众多研究人员实验结果中表现出强大的定点基因编辑能力,这一特点和精子载体法相结合制备基因编辑（基因突变）的遗传修饰的转基因动物具有一定的可行性。探讨将两个技术结合制备基因编辑鸡在目前转基因鸡制备技术尚不成熟的情况下,具有重要的意义。因此,本试验旨在通过以鸡生长激素受体基因（Growth hormone receptor,GHR）为模型,筛选出高效的sgRNA,建立精子载体脂质体孵育条件,将CRISPR/Cas9系统与精子载体技术结合,期望建立简单高效廉价的制备遗传修饰鸡的方法。主要研究内容及结果如下:高活性sgRNA体外酶切筛选:实验首先根据矮小型鸡生长激素受体基因缺失部分的外显子区用在线sgRNA设计软件设计5对sgRNA序列,并且分别构建出前边插入了 T7启动子的sgRNA的体外转录载体pT7-sgRNA-trac,转录出对应的sgRNA。按照Cas9体外酶切试剂盒说明书将Cas9蛋白、sgRNA和体外切割底物按比例混合孵育,酶切结果用1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果:sgRNA1体外切割效率为82.1%,sgRNA2体外切割效率为57.4%,sgRNA3体外切割效率为92.5%,sgRNA4体外切割效率为33.7%,sgRNA5体外切割效率为95.4%。sgRNA活性的DF-1细胞内鉴定及sgRNA脱靶分析:选择靶向GHR基因体外酶切效率较高的sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5,构建出相应的sgRNA、Cas9蛋白和EGFP共表达载体。构建左右同源臂质粒载体pMD19T-zyb,将Neo R表达结构和左右同源臂连接构建打靶载体pMD19T-Neo-zyb。将sgRNA、Cas9蛋白和EGFP共表达载体分别和打靶载体共转染DF-1细胞,用G418筛选,挑单克隆细胞并且增殖培养,将所有阳性单克隆细胞基因组DNA通过PCR扩增鉴定NeoR定点插入,并且将鉴定未定点插入的单克隆细胞基因组通过PCR扩增GHR基因检测靶点处基因序列并进行测序鉴定靶位点处是否发生编辑,其中sgRNA1获得16株细胞克隆有2株为定点插入阳性,编辑效率为12.5%;sgRNA3获得23株细胞克隆有9株为定点插入阳性,2株为未定点插入但靶点序列发生突变,编辑效率为47.8%;sgRNA5获得24株细胞克隆有11株为定点插入阳性,2株为未定点插入但靶点序列发生突变,编辑效率为54.2%。根据在线脱靶分析软件设计对sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5分别选出5个潜在脱靶位点,并设计相应引物,以筛选到的所有Neo R抗性为阳性的细胞克隆基因组为模板PCR扩增出对应潜在脱靶位点序列并测序:分别选出的5个潜在脱靶位点均未检测到sgRNA发生脱靶。精子孵育条件建立:采集新鲜公鸡精液,取200μL精液,洗涤液同孵育液洗涤精清,孵育液分别为稀释液、DMEM培养基、1640培养基、PBS缓冲液,孵育时间分别为10min、30min、60min、90min,观察精子活力选择合适的孵育液,选择能维持精子较高活力的孵育液分别与pX330质粒共孵育10min、30min、60min、90min,观察精子活力并且以半定量PCR鉴定摄取外源DNA情况筛选出最优孵育时间;另一组试验为孵育前分别用0μL、1μL、1.5 μL、2 μL脂质体包被质粒DNA,孵浴时间60 min,半定量PCR鉴定摄取外源DNA情况及有活力的精子所占比例综合选择合适的脂质体体积;通过人工授精,比较不同孵育方法受精率,并PCR鉴定携带外源DNA的受精蛋胚盘数以确定最佳孵育方法。结果不同孵育液孵育后,M199培养液做为孵育液孵育后有活力的精子所占比例显着高于其他组（P<0.05）,孵育时间60 min时为最佳孵育时间;脂质体孵育最佳的脂质体用量为1.5μL;普通孵育处理的受精率为51.18%,脂质体孵育处理的受精率为44.78%,差异不显着（P>0.05）,简单孵育外源DNA 阳性率为14.94%,脂质体孵育外源DNA 阳性率28.89%,差异显着（P<0.05）。编辑胚胎或个体的鉴定:将DF-1细胞筛选高效的sgRNA、Cas9蛋白、EGFP共表达载体与精子在建立的合适孵育条件下脂质体共孵育,人工授精,第X期胚盘水平和刚出壳雏鸡组织水平检测基因编辑:第X期胚盘1087枚,鉴定出3枚受精蛋发生基因编辑,初步估计编辑效率为0.28%,发生基因编辑的3枚受精蛋中发生基因编辑细胞数分别占第X期总细胞数的比例初步估计为10.4%、12.5%、10.4%,经鸡胚基因组DNA进行PCR鉴定性别,发生基因编辑的3枚受精蛋均为雌性,推测CRISPR/Cas9系统发生基因编辑的时期在受精卵发育到8细胞期之前;雏鸡组织未鉴定出发生基因编辑的样品,导致的原因可能是多样的。本试验通过将筛选靶向GHR基因的高效sgRNA,建立适合鸡精子载体的孵育条件,将两者相结合,在第X期胚盘中实现了定点基因编辑,为矮小鸡制备建立了一个新的技术方法,同时也为其他基因编辑及甚至基因打靶的转基因鸡的制备提供了新的思路和方法。
黄幸[2]（2019）在《CRISPR/Cas9编辑鸡MSTN和Mef2C基因的方法研究》文中提出MSTN是控制肌肉生长的负调控因子,也是近些年重点研究的影响畜禽瘦肉率、改善肌肉品质的重要调控基因。Mef2C基因属于Mef2家族,参与骨骼肌肌纤维形成,且促进慢肌纤维的形成。为获得肉质鲜美且能稳定遗传表达的转基因鸡,本实验采用CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建MSTN基因Cas 9敲除载体、MEF2C基因的g RNA-Cas9插入真核表达载体和Mef2C基因打靶载体,从细胞水平到动物个体开展CRISPR/Cas 9编辑鸡的方法研究。首先在已有的MSTN基因Cas 9敲除载体、Mef2C基因的g RNA-Cas9插入真核表达载体和Mef2C基因打靶载体的基础上,分离鸡原代成肌细胞,分别进行转染。转染后对生肌调节因子进行定量分析,观察Ed U和CCK8细胞增殖情况,结果表明MSTN基因Cas 9敲除载体使MSTN基因表达下调,而生肌调节因子My F5和Myo D表达上调,Ed U和CCK8细胞增殖检测结果均显示敲除MSTN基因促进成肌细胞增殖;Mef2C基因的g RNA-Cas 9插入真核表达载体和Mef2C基因打靶载体使Mef2C基因表达显着上调,生肌调节因子My F5、Myo D和My HC表达上调,Ed U和CCK8细胞增殖检测结果均显示插入Mef2C基因促进成肌细胞增殖。Mef2C基因的g RNA-Cas 9插入真核表达载体和Mef2C基因打靶载体促进细胞增殖效果比MSTN基因Cas 9敲除载体更好。把鸡精子细胞在精液稀释液中进行培养和转染,并统计1-6小时精子细胞活力,转染6小时后发现鸡精子细胞发出绿色荧光并发现6小时后仍有部分精子细胞具有活力。在DF-1细胞的脂质体转染和电转染的对比中,发现电转染效果优于脂质体转染效果。根据Neon?Transfection System电转仪摸索精子细胞电转染最佳条件,并进行动物实验,分别使用了脂质体精子载体法、电转染精子法和显微注射慢病毒的方法进行转基因鸡制备实验,但没有获得CRISPR/Cas 9编辑小鸡。
肖佳佳[3]（2017）在《SIRT2对牛体细胞转基因效率的影响及其作用机制》文中认为体细胞转基因技术广泛的应用于基因功能研究和转基因动物育种过程中。转基因过程是一个多步骤过程,任何阶段的效率低下都会引起基因转移系统效率降低甚至导致外源基因不能表达。因此,需要采取策略来促进外源基因透过细胞膜,通过细胞质迁移到细胞核并转运通过核膜,从而能有效地表达。微管蛋白乙酰化是一种微管常规修饰,参与多种细胞功能的调节,包括纤毛组装,细胞内运输,细胞运动,以及轴突生长。SIRT2是一种微管蛋白去乙酰化酶,主要分布在细胞质中,在体外能够对多种靶蛋白进行去乙酰化作用,在许多衰老相关疾病,如癌症、神经性疾病、糖尿病、关节炎等具有重要的调节作用,但是SIRT2对外源基因转染效率的影响并不清楚。因此,本研究利用RNA干扰、定量PCR、蛋白免疫印迹等分析手段,对SIRT2影响牛体细胞转基因效率及作用机制进行调查研究。具体结果如下:1.本研究发现,利用SIRT2特异性siRNA转染细胞后,在SIRT2沉默大约80%时,实验组与对照组相比获得了更多EGFP阳性细胞和更高的EGFP相对表达水平,这一结果表明通过干扰SIRT2表达可以提高外源基因表达水平。2.为了研究SIRT2抑制对基因转染效率的影响机制,本研究构建了SIRT2表达载体pEGFP-SIRT2,并利用蛋白印迹技术分析细胞内微管乙酰化水平。研究结果发现,与阴性对照组相比,SIRT2过表达导致微管乙酰化水平降低（pEGFP-SIRT2）,而SIRT2抑制组（SiRNA-2）的乙酰化水平则明显升高。同时,在质粒pEGFP-SIRT2转染BFFs 24 h后,利用荧光显微镜检测融合蛋白SIRT2-EGFP表达情况,结果显示SIRT2与微管共定位。而且,利用SIRT2特异性抑制siRNA（SiRNA-2）转染BFFs-EGFP细胞时发现,SIRT2抑制组与对照组相比EGFP表达未出现显着变化,由此说明SIRT2抑制并没有改变细胞核中已存在质粒DNA转录效率。同时,本研究还对转基因体细胞克隆胚胎的发育能力进行了评估。结果显示SIRT2敲除对SCNT克隆胚胎的卵裂率、囊胚率等发育能力没有产生明显影响。3.本研究通过将人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因引入牛骨髓来源巨噬细胞（bBMMs）中建立了牛巨噬细胞系（TERT-bBMMs）,该细胞系表达巨噬细胞表面抗原（CD11b,CD282）。在细菌侵袭过程中bBMMs和TERT-bBMMs细胞因子表达情况发生变化,IL-1β,IL-6,IL-10,IL-12,TNF-α的表达出现了上调。这些结果表明,TERT-bBMMs细胞系能够和bBMMs细胞一样对BCG感染作出反应,能够作为体外研究牛结核病（BTB）感染机制的潜在工具。综上所述,通过干扰SIRT2的表达可以提高外源基因表达水平。这种表达的增加并不是因为质粒DNA在细胞核中转录效率的提高,而是由于SIRT2抑制使得微管乙酰化水平增加,促进了质粒从细胞质转运到细胞核的过程,进而增加了外源基因的表达水平,提高了其转染效率。TERT-bBMMs细胞系保留了bBMMs的形态和功能特征,该细胞系可以作为研究牛巨噬细胞与结核分枝杆菌之间相互作用的细胞模型。
葛家春[4]（2015）在《黄颡鱼转基因与基因敲除的技术研究》文中进行了进一步梳理黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）是中国的一种重要的养殖鱼类,但它体型较小、生长较慢,限制了黄颡鱼养殖产业的快速发展。为获得大规格且快速生长的黄颡鱼,本论文开展了黄颡鱼转基因和基因敲除的研究。首先,比较了精子载体法和显微注射法将转基因构件导入黄颡鱼受精卵的效率。其次,应用显微注射法将以黄颡鱼β-actin基因启动子驱动黄色荧光蛋白报告基因构件导入黄颡鱼受精卵,获得了转黄色荧光蛋白基因黄颡鱼1尾,证明黄颡鱼β-actin基因启动子可驱动报告基因表达。第三,通过将黄颡鱼β-actin基因启动子驱动的“全鱼”转生长激素基因构件导入黄颡鱼受精卵,获得转“全鱼”生长激素基因黄颡鱼1尾。最后,为制作不育系黄颡鱼,运用CRISPR-Cas9技术获得gnrh1与gnrh2基因单或双敲除的杂合子黄颡鱼51尾。以上结果成功地建立了黄颡鱼基因组改造的技术平台,为黄颡鱼的基因工程育种奠定了基础。1.比较了精子载体法和显微注射法将转基因构件导入黄颡鱼受精卵的效率。将含黄颡鱼1017 bp β-actin基因5’-起始密码子上游侧翼序列的近端启动子驱动的黄色荧光蛋白报告基因构件Tg（beta-actin:eYFP）显微注射入斑马鱼胚胎,结果表明该启动子能够驱动报告基因在斑马鱼胚胎发育早期进行表达。比较了精子载体法和显微注射法将Tg（beta-actin:eYFP）转入黄颡鱼受精卵的效率,结果显示精子载体法未见黄色荧光蛋白的表达,而显微注射法可以见到黄色荧光蛋白在黄颡鱼胚胎中表达,并获得表达黄色荧光蛋白的黄颡鱼胚胎共451枚,具全身广泛性表达黄颡鱼胚胎77枚,表明显微注射法优于精子载体法。2.应用显微注射法将以黄颡鱼β-actin基因5’-起始密码子上游侧翼序列启动子驱动黄色荧光蛋白报告基因构件导入黄颡鱼受精卵,获得了转黄色荧光蛋白基因黄颡鱼。利用获得的黄颡鱼1017 bp β-actin基因5’-起始密码子上游侧翼序列,构建由该近端启动子驱动的mCherry报告基因构件Tg（ycbeta-actin:mCherry）及黄色荧光蛋白报告基因构件Tg（beta-actin:eYFP）。将Tg（ycbta-actin:mCherry）构件显微注射入斑马鱼胚胎获得转Tg(ycbeta-actin:mCherry 斑马鱼首建者,经对5尾首建者后代的荧光报告基因表达检测,获得了3个斑马鱼转基因品系,报告基因在转基因斑马鱼胚胎和成鱼体中广泛表达。将Tg（beta-actin:eYFP）构件显微注射入黄颡鱼胚胎,经PCR检测,在288尾胚胎期具黄色荧光信号的个体中筛选出34尾转黄色荧光蛋白基因黄颡鱼首建者。经过对19尾转Tg（beta-actin:eYFP）黄颡鱼首建者后代的基因型检测和荧光报告基因表达检测,获得了 1尾转基因黄颡鱼,其中报告基因在转基因黄颡鱼幼鱼中广泛性表达。以上结果证明黄颡鱼β-actin启动子可驱动报告基因表达。3.通过将黄颡鱼β-actin基因5’-起始密码子上游侧翼序列启动子驱动的黄颡鱼生长激素基因编码序列和3’-UTR序列共2105bp长的“全鱼”转生长激素基因构件显微注射入黄颡鱼受精卵,共获得160尾转生长激素基因黄颡鱼首建者,从第二批注射胚胎发育而来的12尾黄颡鱼首建者的1478尾后代中,筛选获得了 1尾转“全鱼”生长激素基因黄颡鱼,成功地建立了黄颡鱼基因组改造的技术平台。4.为获得黄颡鱼不育转基因品系,确保转基因黄颡鱼的生态安全,运用CRISPR-Cas9技术获得gnrh1（促性腺激素释放激素）与gnrh2基因单或双敲除的杂合子黄颡鱼。通过将经测试有活性的sgRNA-gnrh1、sgRNA-gnrh2和Cas9 mRNA混合后,注射入黄颡鱼受精卵,获得gnrh基因敲除黄颡鱼首建者群体。从首建者中随机选取5尾雄性与野生型个体进行人工授精,成功地获得了 51尾gnrh1和gnrh2基因单敲及双敲除突变体,其中gnrh1基因敲除杂合子鱼21尾、gnrh2基因敲除杂合子鱼20尾,gnrh1和gnrh2基因双敲除杂合子鱼10尾。由于gnrh突变可导致不育,本研究为获得不育的转基因黄颡鱼系提供了基础。
牟玉莲,阮进学,吴添文,程英,魏景亮,樊俊华,李奎[5]（2014）在《猪规模化转基因技术体系构建及其应用》文中提出猪是重要的经济动物,优良猪种的培育对农业的发展具有重要的作用。同时,作为一种常用的试验动物,猪在解剖学、生理学、遗传学等方面与人类高度相似,其在生命科学研究领域中也具有独特的应用价值。转基因技术可以运用基因工程等实验技术手段,对动物基因组进行有目的的遗传修饰,使修饰改造的基因稳定遗传给后代,从而获得满足人类特定需求的动物个体。因此,猪规模化转基因技术体系的建立对转基因育种、基因功能研究和人类疾病模型研究等方面具有重要的意义。本文回顾了国内外猪转基因技术体系的研究进展,总结了目标基因的选择原则,介绍了原核显微注射、体细胞核移植、锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases,ZFN）、转录激活子样效应子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases,TALEN）和规律成簇间隔短回文重复序列/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR/Cas9）系统、精子载体和逆转录病毒等各种目标基因导入手段,并分析其优缺点和适用范围,列举了表达调控策略中常用的基因调控元件和相关调控系统。近年来,随着转基因重大专项工作的推进,中国猪规模化转基因技术研究取得长足的发展:发掘出大批功能基因;搭建了ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9介导的高效基因修饰技术平台及其切割效率检测平台;对供体细胞的分离、培养和筛选流程进行优化;完善体细胞核移植和原核显微注射体系平台,并与新型的基因组编辑技术有机结合,实现目的基因定点、高效、安全的整合;通过将再克隆、胚胎移植、人工受精及常规育种等多种技术的集成创新,建立转基因猪扩繁技术体系,可在较短时间内扩大转基因猪数量;并且实现了这些技术体系的资源共享,为众多单位提供了技术服务支撑,培训技术人员,使转基因技术得到普遍的应用。但是中国猪规模化转基因技术体系仍然存在着一系列的问题:决定转基因猪相关性状并具有自主知识产权的主效基因少;标记基因存在潜在的危害;外源基因随机整合率低、稳定性差;基因打靶等技术环节还不成熟;仔猪成活率低等仍然是猪规模化转基因技术发展面临的瓶颈。因此,要实现猪规模化转基因体系构建的技术性突破,必须结合相关组学工具,深入挖掘并获得具有自主知识产权的重要功能基因和调控元件;构建高效、安全的转多基因载体,实现外源基因的协同、高效表达;完善转基因猪制备过程中的相关技术环节。总之,在猪规模化转基因技术体系的支撑下,中国的转基因猪培育研究必将进入一个新的高速发展时期。
陈集成[6]（2014）在《利用细胞穿膜肽进行精子载体法制备转Sohlh2基因猪胚胎的初步探索》文中研究说明Sohlh2（spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix2）是bHLH（basic helix-loop-helix）转录因子超家族的成员,是启动原始卵泡发育的关键基因之一,制备转有Sohlh2基因的动物具有重要的科研价值和应用价值。而在制备转基因动物的方法中,精子载体法以操作简单,人为机械损伤较少的优点,受广大研究者的瞩目。与此同时,精子载体法阳性率不高的问题得不到妥善解决,需要在精子载体法的基础上提高外源基因进入精子的效率,以达到提高阳性率的目的,细胞穿膜肽就是一种较好的解决方案。穿膜肽是由不多于30个氨基酸残基组成的小分子多肽,具有很强的跨膜转运能力。本研究拟比较细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs）用于不同细胞转染的转染效率,之后探讨将筛选的CPPs用于精子载体法制备转Sohlh2基因猪胚胎的可行性。具体研究结果如下。1.Sohlh2基因全长编码区序列片段的克隆。基因包含全长编码序列的扩增片段大小为1281bp,应用MEGA和ORF Finder等程序对所得序列进行相关生物信息学分析。多重序列比较结果显示,水牛与黄牛、绵羊、猪、人、小鼠Sohlh2基因氨基酸的相似性分别为98%、96%、85%、81%和81%,在氨基酸和核苷酸水平上Sohlh2基因在不同物种中具有较高保守性。蛋白二级结构分析结果显示Sohlh2蛋白由α一螺旋、p一折叠、p一转角及无规则卷曲组成,蛋白有自己独特的结构域。2.水牛Sohlh2基因表达模式的研究。应用qRT-PCR技术,检测了Sohlh2基因在水牛不同组织的表达。结果显示,水牛Sohlh2在睾丸中表达丰度最高。之后构建Sohlh2基因的慢病毒表达载体,然后采用倍比稀释法测定包装出来的病毒滴度,检测得病毒滴度已经达到106,达到了要求。3.穿膜肽在不同细胞以及精子上的转染效率的探讨。首先探讨不同孵育液、温度、以及孵育时间下质粒与穿膜肽孵育之后转染293T细胞的情况,以得到最佳的反应条件。结果显示,在37℃下Sohlh2基因质粒与穿膜肽在无血清无双抗的DMEM溶液孵育20min转染效果最佳。其次是流式细胞仪检测不同穿膜肽的转染效率。结果显示,脂质体的转染的效率最高,达到87.72%。C105y、Mpg、Tat、Pep-1和Pep-3穿膜肽的转染效率分别为48.61%、42.90%、8.03%、3.36%和1.98%,效率对比脂质体略低。最后是探讨不同液体和孵育温度下精子的转染效率,最佳反应条件为用无血清无双抗的DMEM作为孵育液体,在37℃培养箱孵育20min。应用激光共聚焦技术观察精子发光,结果显示,精子发光部位集中在顶体后区。4.利用穿膜肽和慢病毒进行IVF制备转Sohlh2基因猪胚胎。首先通过检测穿膜肽,脂质体和慢病毒处理精子对精子活率、平均曲线运动速度（VCL）、平均直线运动速度（VSL）和前向性（STR）等试验指标的影响。结果显示,穿膜肽C105y对精子平均直线运动速度、平均曲线运动速度和精子前向性的影响与对照组相比,差异都不显着（P>0.05）。之后,选择慢病毒和C105y进行IVF生产转Sohlh2基因猪胚胎。C105y组的囊胚率显着高于慢病毒组（15.8±6.9vs9.1±3.5,P<0.05）,和对照组差异不显着（15.8±6.9vs13.8±5.0,P>0.05）,但C105y组的阳性率低于慢病毒组（8.54±0.78vs10.38±0.95,P<0.05）。结论：1.以水牛卵巢和睾丸的混合cDNA为模板,可克隆得到水牛Sohlh2基因,并能用于构建Sohlh2基因的慢病毒载体。2.穿膜肽C105y与Mpg在37℃下以无血清无双抗的DMEM溶液孵育20min后可有效将Sohlh2基因质粒转染到细胞和精子内,但效果比脂质体组差。3.穿膜肽C105y对精子活率、平均曲线运动速度（VCL）、平均直线运动速度（VSL）和前向性（STR）各项指数无显着影响,是一种理想的IVF穿膜肽载体。4.采用穿膜肽C105y和慢病毒转染精子进行IVF均可以得到转Sohlh2囊胚。
胡骁睿,朱志伟,黄菁,陈晓宇,于福先,潘建治[7]（2014）在《胞质内单精子注射制备转基因猪技术的优势与前景》文中研究表明综述了20多年来转基因猪的研究概况,探讨了各种转基因技术的特点,分析了胞质内单精子注射制备转基因猪技术的特点和优势,并展望了单精子注射与人工染色体载体技术相结合制备大片段转基因猪的应用前景。
郝枭雄,朱征,曹棉富,李成仁,刘运来[8]（2013）在《精子载体技术研究进展》文中研究指明随着生物科技的飞速发展,人类已经初步掌握了通过转基因技术去改变生物性状的方法。近年来精子载体技术因其可方便有效地产生转基因动物模型而受到人们越来越多的关注。这项技术具有操作简单、人为损伤小等优点。本文主要从精子载体技术的技术背景、发展历程、相关机制、操作方法以及应用展望等方面对其进行综述。
杜伟,崔海信,王琰,孙长娇,赵翔[9]（2012）在《精子载体法制备转基因动物的研究进展》文中认为精子载体法是一种低成本、简单快速制备转基因动物的方法。外源基因主要通过两种方式实现基因整合,一种是直接整合到精子的基因组中;另一种是通过精子携带进入卵细胞,然后整合到受精卵的基因组中。尽管现在已经有很多利用精子载体法获得了转基因动物的研究,但是基于精子在受精过程中,结合、内化、以及转运外源基因等方面能力的差异,转染效率仍有待提高。就利用精子载体法制备转基因动物过程中,精子载体法制备转基因动物的分子机制和方法方面进行系统的阐述和分析。
张顺[10]（2013）在《单精子胞质内注射转基因法（ICSI-MGT）生产转Fat-1基因兔的初步研究》文中进行了进一步梳理单精子胞质内注射转基因（Intracytoplasmic Sperm Injection Mediated Gene Transfer, ICSI-MGT）是精子载体转基因中应用最广泛的一种方法,它具有不需要考虑精子的活力、能转移大片段的外源基因和相对于体外受精介导有较高的转基因效率等优点,因此被广泛应用于转基因动物制作研究。本研究以线虫体内克隆获得的n-3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因（Fat-1）为目的基因,系统研究了兔ICSI-MGT转基因效率的相关影响因素和精子/DNA结合的分子机制,并对应用ICSI-MGT生产转Fat-1基因兔的可行性进行了探讨。1、研究了兔精子处理方法对ICSI-MGT转基因效率的影响。结果发现,无抗冻剂液氮长期冻存对精子DNA的损伤程度与一次液氮冻融组相比无显着差异（P>0.05）,其受精后的合子双原核形成率（71.4% vs 67.5%和77.2%）、卵裂率（76.7% vs 79.5%和80.4%）及囊胚率（39.7% vs 42.0%和40.2%）与一次液氮冻融组及新鲜精子组相比均无显着差异（P>0.05）,但其ICSI-MGT后的阳性胚胎率及囊胚阳性率显着高于新鲜精子组（43.8% vs18.6%；56.1% vs 12.8%,P<0.05）,而与一次液氮冻融精子组无显着差异（43.8% vs 40.2%；56.1% vs 46.8%,P>0.05）。比较不同来源精子的ICSI-MGT转基因效率时发现,来自附睾的精子与采集的精子相比,其与外源DNA结合的效率差异极为显着（DNaseI消化前：77.5% vs 17.0%；DNaseI消化后：47.6% vs 5.2%,P<0.01）,ICSI-MGT后能获得较高的阳性胚胎率和囊胚阳性率（32.4% vs 10.8%；40.2% vs 9.2%,P<0.05）；对二者精液的差异成份——精浆进行分析,发现外源质粒孵育精浆后出现降解现象且降解程度随着其含量的升高而逐步升高,当精子/DNA孵育体系中添加EDTA后能显着抑制孵育外源质粒的降解,同时,EDTA处理后的采集精子用于ICSI-MGT生产转基因胚胎,与未添加EDTA对照组相比能显着提高阳性胚胎率及囊胚阳性率（24.5% vs 10.8%；36.0% vs 9.2%；P<0.05）。上述结果表明：（1）无抗冻剂液氮长期冻存精子可以用于ICSI-MGT操作生产转基因胚胎,为兔精子介导转基因提供了一种方便可靠的精子保存方法；（2）精浆成份存在高活性的脱氧核糖核酸酶能降解外源DNA从而降低ICSI-MGT的转基因效率,添加EDTA能抑制外源DNA的降解进而提高ICSI-MGT的转基因效率。2、探讨了ICSI兔卵母细胞激活与培养对胚胎发育的影响。激活方法对比研究的结果显示,ICSI卵母细胞经5μM Ion激活5 min后,再用2 mM·6-DMAP或2mM 6-DMAP+5μg/mL CHX培养1.5 h,其分裂率高于用5μg/mL CHX培养1.5 h的卵母细胞和未激活对照的卵母细胞,卵母细胞激活后用2 mM 6-DMAP+5μg/mL CHX培养1.5 h的囊胚率（41.3%）和一级胚胎率（65.4%）显着高于其它各组的卵母细胞（P<0.05）；胚胎分级后进行常规体外培养,一级胚胎的囊胚率和囊胚细胞数与体内胚胎差异不显着（P>0.05）,显着高于二级、三级胚胎（P<0.05）。当在培养液中添加不同浓度的细胞凋亡抑制剂1-磷酸-鞘氨醇（S1P）时,添加50 nM或100 nM的S1P能提高囊胚形成率和囊胚质量（P<0.05）,100nMS1P组的整二倍体（2n=44）囊胚比例显着高于不添加的对照组（94.7% vs 78.6%,P<0.05）；检测二级碎裂胚胎细胞微丝蛋白分布发现：胚胎经100 nM SIP处理的各阶段细胞微丝蛋白在细胞间隙及内细胞团处呈现集中分布,但未处理培养组的碎裂二级胚胎各阶段细胞微丝蛋白松散、无规则排列,内细胞团处无明显聚集。上述结果表明:（1） ICSI兔卵母细胞的适宜激活处理方法是Ion激活5 min,再用6-DMAP和CHX培养1.5 h；（2）细胞凋亡抑制剂S1P能提高ICSI胚胎的体外培养质量、降低胚胎碎裂程度、维持胚胎细胞染色体的正常倍性并对细胞骨架微丝蛋白的正常分布有调节作用。3、探讨了ICSI-MGT转基因兔胚胎生产的相关影响因素（质粒浓度和构型）,并建立了转Fat-1基因的家兔模型。结果发现,随着pPGK1/Fat-1-CMV/EGF质粒浓度的升高,兔精子结合质粒的效率在DNaseI消化前后均呈上升趋势,且ICSI-MGT的阳性胚胎率也随着质粒浓度的升高而提高,但当浓度达到500 ng/μL时,胚胎的分裂率和囊胚率与其他各组相比均显着降低,而30 ng/μL组的囊胚率显着高于50 ng/μL组（49.0% vs 33.3%,P<0.05）,且其阳性胚胎率、囊胚阳性率显着高于10 ng/μL和15 ng/μL组（56.3% vs 45.6%和21.2%；55.3% vs 39.0%和33.3%,P<0.05）。对与不同浓度质粒孵育后的精子基因组进行琼脂糖凝胶电泳发现,随着外源质粒浓度的升高精子基因组发生降解而使胚胎发育能力受到影响。在研究线状/环状质粒的不同比例对转基因效率的影响时发现：比例为1：1的线状/环状质粒在精子结合效率和胚胎转基因效率上均显着高于1：0、1：4和0：1组（P<0.05）。将281枚2-8细胞期阳性胚胎分别移植到10只同期发情受体或供体兔自体移植,结果共有两只受体妊娠,生产出7只仔兔（编号1-7）；采用组织切片激光共聚焦扫描显微镜、PCR、RT-PCR、Southern Blotting、 Western Blotting分子生物学方法和气-质联用技术（GC-MS）对仔兔进行转基因鉴定,发现除编号3的仔兔外,其余六只均有pPGK1/Fat-1-CMV/EGFP质粒的报告基因元件EGFP及目的基因Fat-1的表达,且仔兔肌肉组织n-3多不饱和脂肪酸的相对含量有大幅提高,n-6多不饱和脂肪酸的含量则大幅下降,n-6/n-3 PUFAs的比值由野生型的约17.5±1.4下降到转基因组的0.6士0.1～1.9士0.1左右。上述结果表明：（1）质粒的浓度和线状/环状比例影响兔ICSI-MGT的转基因效率,以浓度为30 ng/μL和1：1的线状/环状比例能获得较好的转基因效率；（2）采用ICSI-MGT方法能获得整合并且表达Fat-1基因的的转基因兔,并且能降低n-6/n-3 PUFAs的比值。4、采用非变性PAGE电泳对DNA/精子蛋白质共孵育复合物和精子自由蛋白质进行分离联合质谱技术初步探讨了精子与外源DNA相互结合的分子机制。结果发现,DNA/精子蛋白质共孵育复合物泳道出现一条蛋白质-DNA结合的滞后带,对该条带进行质谱分析获得7个蛋白质,通过理化性质和蛋白保守区域分析发现其中的IAM38蛋白质均符合DBPs的性质,进一步SMART在线对7个蛋白质的功能结构域进行分析,发现仅IAM38具有若干免疫球蛋白IG结合位点及蛋白质与DNA相互作用的结构功能单元（包括锌指结构、亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋结构）。Western Blotting结果显示免疫球家族蛋白CD4分子在精子中有分布,但在精浆中并不存在；利用CD4分子单克隆抗体对兔精子CD4分子功能位点进行封闭后再与pPGK1/Fat-1-CMV/EGFP质粒共孵育,原位杂交结果显示：兔精子经CD4分子抗体封闭后与未封闭组相比不影响其与外源DNA的携带能力（68.3%vs 75.7%,P>0.05）,但极显着地降低了外源DNA的内化（7.5% vs 51.4%,P<0.01）。将CD4分子单克隆抗体封闭后的精子进行ICSI-MGT,发现封闭后的兔精子ICSI-MGT胚胎的分裂率和囊胚率与未封闭对照组相比虽然无显着差异（70.5% vs 76.7%； 39.7% vs 32.6%；P>0.05）,但阳性胚胎率及囊胚阳性率均极显着低于未封闭组（7.8% vs 43.8%；7.1% vs 56.1%,P<0.01）。上述结果表明：精子结合外源DNA模式为首先外源DNA与精子质膜的跨膜蛋白质IAM38结合,然后二者依赖免疫球蛋白的异嗜性与CD4分子形成DNA/IAM38/CD4复合物完成DNA入核转运。
二、精子载体转基因技术的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、精子载体转基因技术的研究进展（论文提纲范文）
（1）精子载体制备转基因鸡方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 转基因动物研究进展 |
| 1.1.1 转基因动物应用 |
| 1.1.2 转基因鸡优势及应用 |
| 1.2 转基因鸡的制备方法 |
| 1.2.1 逆转录病毒与慢病毒感染法 |
| 1.2.2 原始生殖细胞(PGCs)转染法 |
| 1.2.3 显微注射法 |
| 1.2.4 精子介导法 |
| 1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9发展历程及作用机理 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9的应用 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9的存在的问题 |
| 1.4 靶基因—生长激素受体基因 |
| 1.5 实验目的意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 仪器材料与实验动物 |
| 2.1.1 质粒与引物合成 |
| 2.1.2 实验试剂及来源 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 相关溶剂配制 |
| 2.1.6 主要分析软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sgRNA设计 |
| 2.2.2 sgRNA酶切活性体外鉴定 |
| 2.2.3 sgRNA活性的DF-1细胞内鉴定及sgRNA脱靶分析 |
| 2.2.4 精子孵育条件建立 |
| 2.2.5 转基因鸡胚及组织检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 高活性sgRNA体外酶切筛选 |
| 3.1.1 体外转录载体构建 |
| 3.1.2 sgRNA转录模板与切割底物的PCR扩增 |
| 3.1.3 sgRNA体外酶切活性鉴定 |
| 3.2 sgRNA活性的DF-1细胞内鉴定及sgRNA脱靶分析 |
| 3.2.1 载体构建结果 |
| 3.2.2 细胞转染及单克隆细胞筛选鉴定 |
| 3.2.3 潜在脱靶位点鉴定 |
| 3.3 精子孵育条件优化结果 |
| 3.3.1 孵育液的选择 |
| 3.3.2 孵育时间的选择 |
| 3.3.3 脂质体孵育效果 |
| 3.3.4 人工授精检测孵育效果 |
| 3.4 编辑胚胎或个体的鉴定 |
| 3.4.1 胚盘水平检测基因突变 |
| 3.4.2 转基因鸡组织水平检测基因突变 |
| 4 讨论 |
| 4.1 sgRNA活性及CRISPR/Cas9脱靶分析 |
| 4.2 GHR做为靶基因的优势 |
| 4.3 影响鸡精子载体的因素 |
| 4.4 发生基因编辑胚盘DNA检测方法 |
| 4.5 雏鸡组织检测发生基因编辑不足及展望 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）CRISPR/Cas9编辑鸡MSTN和Mef2C基因的方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 转基因技术与基因编辑 |
| 1.1.2 MSTN |
| 1.1.3 Mef2C |
| 1.1.4 转基因鸡的培育方法 |
| 1.2 研究目的和研究意义 |
| 1.2.1 研究目的 |
| 1.2.2 研究意义 |
| 1.3 全文实验技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 载体及实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂配方 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 MSTN基因的g RNA-Cas9 敲除载体、Mef2C基因的g RNA-Cas9 插入真核表达载体和p EGFP-DS1-CMV-MEF2C-DS2 载体质粒DNA的提取 |
| 2.2.3 鸡原代成肌细胞的分离、培养和传代 |
| 2.2.4 鸡原代成肌细胞的转染 |
| 2.2.5 鸡原代成肌细胞的RNA抽提、反转录与基因的定量 |
| 2.2.6 鸡原代成肌细胞增殖检测Ed U与 CCK-8 |
| 2.2.7 DF-1细胞培养与传代 |
| 2.2.8 DF-1细胞的电转染与脂质体转染 |
| 2.2.9 鸡精子细胞在精液稀释液中的培养 |
| 2.2.10 鸡精子细胞在精液稀释液中的脂质体转染 |
| 2.2.11 鸡精子细胞在精液稀释液中的电转染 |
| 2.2.12 脂质体精子载体法制备转基因鸡实验一 |
| 2.2.13 脂质体精子载体法制备转基因鸡实验二 |
| 2.2.14 脂质体精子载体法制备转基因鸡实验三 |
| 2.2.15 电转染法制备转基因鸡实验 |
| 2.2.16 显微注射慢病毒法制备转基因鸡实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 载体质粒DNA的提取 |
| 3.2 鸡原代成肌细胞的转染 |
| 3.2.1 载体DNA成功在鸡原代成肌细胞中表达 |
| 3.2.2 生肌调节因子基因在鸡原代成肌细胞中的表达 |
| 3.2.3 MSTN敲除载体和Mef2C插入载体促进鸡原代成肌细胞的增殖 |
| 3.3 DF-1细胞电转染和脂质体转染 |
| 3.4 鸡精子细胞在精液稀释液中的培养 |
| 3.5 鸡精子细胞的脂质体转染 |
| 3.6 鸡精子细胞的电转染 |
| 3.7 脂质体精子载体法与电转染法 |
| 3.7.1 脂质体精子载体法制备转基因鸡实验一结果 |
| 3.7.2 脂质体精子载体法实验二与电转染法制备转基因鸡实验结果 |
| 3.7.3 脂质体精子载体法制备转基因鸡实验三结果 |
| 3.8 显微注射慢病毒法制备转基因鸡 |
| 3.8.1 MSTN过表达慢病毒载体的构建 |
| 3.8.2 MSTN g RNA序列及测序结果分析 |
| 3.8.3 显微注射慢病毒制备转基因鸡 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CRISPR/Cas系统 |
| 4.2 鸡精子细胞 |
| 4.3 转基因动物 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 实验测序结果 |
| 附录 B 硕士期间参与发表的论文 |
（3）SIRT2对牛体细胞转基因效率的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 Sirtuins家族基因研究进展 |
| 1.1 Sirtuins家族基因进展 |
| 1.2 SIRT2基因的研究进展 |
| 1.2.1微管蛋白去乙酰化酶SIRT2 |
| 1.2.2 SIRT2对细胞周期和癌症的影响 |
| 1.2.3 Sirt2在细胞衰老及相关疾病中的作用 |
| 1.3 其他Sirtuin家族基因生物学功能 |
| 1.3.1 SIRT1基因生物学功能研究进展 |
| 1.3.2 SIRT3基因生物学功能研究进展 |
| 1.3.3 SIRT4基因生物学功能研究进展 |
| 1.3.4 SIRT5基因生物学功能研究进展 |
| 1.3.5 SIRT6基因生物学功能研究进展 |
| 1.3.6 SIRT7基因生物学功能研究进展 |
| 1.4 Sirtuin家族成员之间相互作用研究进展 |
| 第二章 转基因动物技术进展 |
| 2.1 转基因动物研究进展 |
| 2.1.1 抗病转基因动物育种 |
| 2.1.2 利用转基因技术构建人类疾病动物模型 |
| 2.1.3 利用转基因动物生产药物 |
| 2.1.4 利用转基因技术培育移植器官 |
| 2.2 转基因技术研究进展 |
| 2.2.1 非病毒载体转基因技术 |
| 2.2.2 病毒载体转基因技术 |
| 2.3 转基因技术的问题和未来 |
| 实验部分 |
| 第三章 SIRT2对牛体细胞基因转染效率的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要实验试剂 |
| 3.1.2 干扰序列 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 成纤维细胞的制备 |
| 3.2.2 BFFs总 RNA的提取和反转录 |
| 3.2.3 质粒p EGFP-N1 的制备 |
| 3.2.4 RNA干扰实验 |
| 3.2.5 Western blot分析蛋白表达 |
| 3.2.6 基因表达定量检测 |
| 3.2.7 SIRT2干扰干扰对不同转基因方法的影响 |
| 3.2.8 生长曲线的检测 |
| 3.2.9 细胞周期的检测 |
| 3.2.10 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 特异性si RNA显着抑制SIRT2 表达 |
| 3.3.2 SIRT2 抑制对BFFs基因转染效率的影响 |
| 3.3.3 SIRT2抑制对不同转基因方法的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 SIRT2提高牛体细胞转基因效率的机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 SIRT2 引物序列和定量PCR序列 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 BFFs总 RNA的提取和反转录 |
| 4.2.3 构建p EGFP-SIRT2 表达载体 |
| 4.2.4 RNA干扰实验 |
| 4.2.5 Western blot分析蛋白表达 |
| 4.2.6 基因表达定量检测 |
| 4.2.7 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 SIRT2基因克隆 |
| 4.3.2 载体pEGFP-Sirt2 的表达检测 |
| 4.3.2 SIRT2细胞定位 |
| 4.3.3 SIRT2抑制未能改变质粒的转录活性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 SIRT2干扰对转基因体细胞核移植胚胎发育的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要实验试剂和仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 卵母细胞的收集和体外成熟 |
| 5.2.2 体外成熟卵母细胞的去核 |
| 5.2.3 供体细胞的准备及注核 |
| 5.2.4 核质复合体的电融合 |
| 5.2.5 核移植胚胎的激活及体外培养 |
| 5.2.6 克隆胚的Ipr1基因检测 |
| 5.2.7 囊胚内细胞凋亡染色 |
| 5.2.8 囊胚差异染色 |
| 5.2.9 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SiRNA-2处理对转基因核移植胚胎体外发育的情况 |
| 5.3.2 Ipr1转基因克隆胚外源基因的检测 |
| 5.3.3 SiRNA-2处理对牛体细胞核移植胚胎内细胞团与滋养层细胞比例的影响 |
| 5.3.4 SiRNA-2处理对牛转基因体细胞核移植胚胎细胞凋亡率的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 SIRT2干扰在细胞系建立过程中的应用 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 引物序列 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 制备pCI-neo-hTERT质粒 |
| 6.2.2 牛骨髓来源巨噬细胞的培养与鉴定 |
| 6.2.3 牛骨髓来源巨噬细胞系的建立 |
| 6.2.4 流式细胞术检测细胞系纯度 |
| 6.2.5 免疫荧光检测TERT-bBMMs细胞标志物 |
| 6.2.6 TERT-bBMMs细胞端粒酶活性测定 |
| 6.2.7 逆转录PCR和定量RT-PCR |
| 6.2.8 生长曲线测定 |
| 6.2.9 Western Blot检测TERT蛋白表达 |
| 6.2.10 染色体核型分析 |
| 6.2.11 检测TERT-bBMMs细胞生物学功能 |
| 6.2.12 数据分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 pCI-neo-hTERT质粒的提取与鉴定 |
| 6.3.2 牛骨髓来源巨噬细胞的分离与培养 |
| 6.3.3 TERT-bBMMs细胞系的建立 |
| 6.3.3 TERT-bBMMs细胞系生长性能鉴定 |
| 6.3.4 TERT-bBMMs细胞生物学功能分析 |
| 6.3.5 检测TERT-bBMMs细胞系端粒酶活性 |
| 6.3.6 结核杆菌对细胞系的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 结论 |
| 全文结论 |
| 创新之处和进一步研究课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）黄颡鱼转基因与基因敲除的技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 鱼类转基因研究进展 |
| 1.1.1 鱼类转基因技术 |
| 1.1.2 鱼类转基因效果 |
| 1.1.2.1 促生长效果 |
| 1.1.2.2 抗病性 |
| 1.1.2.3 抗冻性 |
| 1.1.2.4 转基因的多效性 |
| 1.1.3 转GH基因鱼制作需考虑的问题 |
| 1.2 转基因鱼生态安全研究进展 |
| 1.2.1 转基因鱼的生态安全 |
| 1.2.2 应对转基因鱼生态安全的方法 |
| 第2章 黄颡鱼转基因导入方法的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 黄颡鱼基因组DNA提取 |
| 2.1.3 黄颡鱼β-actin启动子的分离 |
| 2.1.4 黄颡鱼β-actin启动子驱动黄色荧光蛋白报告基因表达载体的构建 |
| 2.1.5 斑马鱼受精卵采集 |
| 2.1.6 黄颡鱼β-actin启动子活性的鉴定 |
| 2.1.7 黄颡鱼精液和受精卵采集 |
| 2.1.8 精子载体法转Tg (beta-actin:eYFP)试验 |
| 2.1.9 显微注射法转Tg (beta-actin:eYFP)试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 黄颡鱼β-actin启动子序列 |
| 2.2.2 黄颡鱼β-actin启动子驱动的eYFP报告基因在斑马鱼胚胎中表达 |
| 2.2.3 精子载体法转Tg(beta-actin:eYFP)结果 |
| 2.2.4 显微注射法转Tg(beta-actin:eYFP)结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 稳定表达黄色荧光蛋白转基因黄颡鱼的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 黄颡鱼受精卵的获得 |
| 3.1.3 转黄颡鱼β-actin启动子驱动报告基因的斑马鱼的制作 |
| 3.1.4 转Tg(beta-actin:eYFP)基因黄颡鱼制作 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 获得黄颡鱼β-actin启动子驱动mCherry报告基因转基因斑马鱼 |
| 3.2.2 获得黄颡鱼β-actin启动子驱动eYFP报告基因转基因黄颡鱼 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 “全鱼”转生长激素基因黄颡鱼的制作 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 黄颡鱼生长激素编码序列的克隆 |
| 4.1.3 黄颡鱼生长激素与其它动物生长激素的同源性比对及系统进化树构建 |
| 4.1.4 黄颡鱼生长激素3'-非翻译区序列的克隆 |
| 4.1.5 “全鱼”转生长激素基因构件的制备 |
| 4.1.6 黄颡鱼人工繁殖和受精卵获得 |
| 4.1.7 “全鱼”转生长激素基因黄颡鱼首建者的制作 |
| 4.1.8 转入目的基因检测 |
| 4.1.9 “全鱼”转生长激素基因黄颡鱼的筛选 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 黄颡鱼生长激素蛋白质序列 |
| 4.2.2 “全鱼”转生长激素基因构件 |
| 4.2.3 获得“全鱼”转生长激素基因首建者 |
| 4.2.4 获得“全鱼”转生长激素基因黄颡鱼 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 GNRH1与GNRH2基因敲除黄颡鱼的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 黄颡鱼人工授精 |
| 5.1.2 黄颡鱼gnrh基因的克隆 |
| 5.1.3 敲除黄颡鱼gnrh1与gnrh2的sgRNA的设计及合成 |
| 5.1.4 Cas9 mRNA的体外合成及sgRNA活性鉴定 |
| 5.1.5 黄颡鱼gnrh1和gnrh2基因敲除初建者的建立及后代突变体筛选 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 黄颡鱼gnrh1和gnrh2基因的克隆 |
| 5.2.2 识别gnrh1和gnrh2靶目标序列的sgRNA活性的确定 |
| 5.2.3 黄颡鱼gnrh1和gnrh2基因单敲及双敲除突变体的获得 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 一、发表论文 |
| 二、获奖 |
| 致谢 |
（5）猪规模化转基因技术体系构建及其应用（论文提纲范文）
| 1 构建猪规模化转基因技术体系的必要性 |
| 1.1 转基因育种的需要 |
| 1.2 基因功能研究的需要 |
| 1.3 人类疾病模型研究的需要 |
| 2 国内外猪转基因技术体系研究进展 |
| 2.1 目标基因的选择 |
| 2.2 目标基因的导入及调控 |
| 2.2.1 目标基因导入 |
| 2.2.1. 1 原核显微注射法 |
| 2.2.1. 2 体细胞核移植法 |
| 2.2.1. 3 基因组编辑技术 |
| 2.2.1. 4 精子载体法 |
| 2.2.1. 5 逆转录病毒法 |
| 2.2.2 目标基因表达调控策略 |
| 3 中国近期猪规模化转基因技术体系构建的进展 |
| 3.1 目标基因的克隆 |
| 3.2 转基因/基因修饰载体的构建和优化 |
| 3.2.1 搭建了ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9介导的高效基因修饰技术 |
| 3.2.2建立了效率较高的ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9等技术的检测平台 |
| 3.3 供体细胞的分离、培养和筛选体系的优化 |
| 3.4 体细胞核移植技术体系的优化及与新型的基因组编辑技术的有机结合 |
| 3.5 规模化的原核显微注射技术平台的完善 |
| 3.6 多种技术集成创新体系的建立 |
| 3.7 猪转基因技术体系的应用 |
| 4 猪转基因技术发展趋势 |
| 4.1 多基因复合性状 |
| 4.2 去除筛选标记 |
| 4.3 定点整合 |
| 5 问题与展望 |
（6）利用细胞穿膜肽进行精子载体法制备转Sohlh2基因猪胚胎的初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述文献 |
| 1. Sohlh2基因的生理功能 |
| 2. 转基因动物生产制备研究进展 |
| 2.1 反转录病毒感染法 |
| 2.2 显微注射法 |
| 2.3 胚胎干细胞法 |
| 2.4 体细胞核移植法 |
| 2.5 精子载体法 |
| 3. 精子捕获并内化外源DNA的分子机制,SMGT的影响因素及存在问题 |
| 3.1 SMGT精子捕获并内化外源DNA的分子机制 |
| 3.2 外源DNA对SMGT的效率影响 |
| 3.3 精子质量对SMGT的效率影响 |
| 3.4 精子与外源基因孵育时间、温度及混合比例对SMGT效率的影响 |
| 3.5 孵育溶液中的电荷密度对SMGT效率的影响 |
| 3.6 SMGT存在的问题 |
| 4. 细胞穿膜肽的定义以及研究进展 |
| 4.1 细胞穿膜肽的结构特点以及分类 |
| 4.2 细胞穿膜肽与外源物质的连接方式 |
| 4.3 细胞穿膜肽的穿膜机制 |
| 5. 研究的目的和意义 |
| 第二章 水牛Sohlh2基因克隆及生物信息学分析 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 总RNA的提取 |
| 2.2 克隆得到的水牛Sohlh2基因 |
| 2.3 水牛Sohlh2基因pMD18-T重组质粒克隆及鉴定 |
| 2.4 序列提交 |
| 2.5 Sohlh2基因生物信息学分析 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 水牛Sohlh2基因的克隆 |
| 3.2 水牛Sohlh2基因的生物信息学分析 |
| 4 结论 |
| 第三章 水牛Sohlh2基因表达模式的研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 定量引物验证 |
| 2.2 Sohlh2基因在水牛组织中表达模式的建立 |
| 2.3 Sohlh2基因真核表达载体及慢病毒载体的构建 |
| 2.4 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3 分析和讨论 |
| 3.1 Sohlh2基因在不同组织的mRNA表达 |
| 3.2 构建Sohlh2基因的慢病毒载体 |
| 4 结论 |
| 第四章 穿膜肽在不同细胞及精子上的转染效率 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 探讨C105y和Sohlh2基因质粒孵育条件及不同细胞类型对五种穿膜肽转染效果的影响 |
| 2.2 流式细胞仪检测不同穿膜肽的转染效率 |
| 2.3 穿膜肽与探针fam在不同孵育液和孵育温度下对猪精子转染效果的影响 |
| 3 分析讨论 |
| 3.1 探讨C105y和Sohlh2基因质粒孵育条件及不同细胞类型对五种穿膜肽转染效果的影响 |
| 3.2 流式细胞仪检测不同穿膜肽的转染效率 |
| 3.3 穿膜肽与探针fam在不同孵育液和孵育温度下对猪精子转染效果的影响 |
| 4 结论 |
| 第五章 利用穿膜肽和慢病毒进行IVF制备转Sohlh2基因猪胚胎 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 不同方式处理精子对精子活率、平均曲线运动速度(VCL)、平均直线运动速度(VSL)和前向性(STR)影响 |
| 2.2 不同载体(慢病毒和穿膜肽C105y)对转Sohlh2基因猪胚胎发育的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 不同方式处理精子对精子活率、平均曲线运动速度(VCL)、平均直线运动速度(VSL)和前向性(STR)影响 |
| 3.2 不同载体(慢病毒和穿膜肽C105y)对转Sohlh基因猪胚胎发育的影响 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）胞质内单精子注射制备转基因猪技术的优势与前景（论文提纲范文）
| 1 转基因猪研究概况 |
| 2 猪转基因常用方法的技术特点 |
| 3 单精子注射转基因法的特色优势 |
| 4 ICSI介导猪转基因技术的应用与展望 |
（10）单精子胞质内注射转基因法（ICSI-MGT）生产转Fat-1基因兔的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 精子载体介导转基因法及n-3 PUFAs的研究进展 |
| 前言 |
| 1. 精子载体法转基因研究进展 |
| 1.1 精子载体法转基因研究简史 |
| 1.2 精子介导转基因中的精子特性 |
| 1.3 精子介导转基因法方式的演变 |
| 1.4 精子载体法转基因分子机制 |
| 1.5 外源DNA/精子相互作用方式的发展 |
| 1.6 精子载体法应用前景 |
| 1.7 转基因兔模型的研究及应用 |
| 2 多不饱和脂肪酸的研究进展与转基因工程研究 |
| 2.1 多不饱和脂肪酸分类与细胞膜功能 |
| 2.2 n-3 PUFAs脂肪酸的功能 |
| 2.3 n-6/n-3 PUFAs的比例与健康 |
| 2.4 n-3 PUFAs的合成代谢 |
| 2.5 n-3 PUFAs的转基因工程技术的研究进展 |
| 3 研究前景及本课题的意义 |
| 第二章 兔精子处理方法对ICSI-MGT转基因效率的影响 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 无抗冻剂液氮长期冻存对精子DNA损伤、ICSI-MGT受精能力及转基因效率的影响 |
| 2.2 精子来源对其结合pPGK1/Fat-1-CMV/EGFP质粒效率及转基因效率的影响 |
| 2.3 精浆对pPGK1/Fat-1-CMV/EGFP质粒孵育的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 无抗冻剂液氮长期冻存对兔精子ICSI-MGT转基因效率的影响 |
| 3.2 兔精子不同来源对其转基因效率的影响 |
| 4 结论 |
| 第三章 兔ICSI激活方法与培养对胚胎发育的影响 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同激活方法对胚胎发育及对胚胎碎裂的影响 |
| 2.2 培养液中添加S1P对胚胎培养与发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 ICSI卵母细胞激活的研究 |
| 3.2 碎裂对胚胎发育的影响 |
| 3.3 S1P对碎裂的影响 |
| 4 结论 |
| 第四章 转Fat-1基因兔模型的制备与检测 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 PCR引物及探针 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 质粒浓度对兔ICSI-MGT转基因胚胎生产效率的影响 |
| 2.2 质粒线状/环状的不同比例对兔ICSI-MGT转基因胚胎生产效率的影响 |
| 2.3 ICSI-MGT兔胚胎体内发育 |
| 2.4 转基因兔的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA浓度对兔ICSI-MGT转基因胚胎生产效率的影响 |
| 3.2 质粒线状/环状不同比例对兔ICSI-MGT转基因效率的影响 |
| 3.3 ICSI-MGT生产转Fat-1基因兔的可行性 |
| 4 结论 |
| 第五章 精子结合外源DNA分子机制的初步研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 DBPs蛋白质的鉴定 |
| 2.2 IAM38蛋白质的结构与功能预测 |
| 2.3 CD4分子在精子细胞内的鉴定及其与转基因效率的关系 |
| 2.4 精子结合外源DNA并内化模式图的构建 |
| 3 讨论 |
| 3.1 与DNA结合的精子蛋白质筛选与鉴定 |
| 3.2 CD4分子在精子载体中的作用 |
| 3.3 精子/DNA结合转运模型的模式建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 图片 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、精子载体转基因技术的研究进展（论文参考文献）
- [1]精子载体制备转基因鸡方法研究[D]. 代敏敏. 河北农业大学, 2020(01)
- [2]CRISPR/Cas9编辑鸡MSTN和Mef2C基因的方法研究[D]. 黄幸. 华南农业大学, 2019(02)
- [3]SIRT2对牛体细胞转基因效率的影响及其作用机制[D]. 肖佳佳. 西北农林科技大学, 2017(01)
- [4]黄颡鱼转基因与基因敲除的技术研究[D]. 葛家春. 南京师范大学, 2015(12)
- [5]猪规模化转基因技术体系构建及其应用[J]. 牟玉莲,阮进学,吴添文,程英,魏景亮,樊俊华,李奎. 中国农业科学, 2014(21)
- [6]利用细胞穿膜肽进行精子载体法制备转Sohlh2基因猪胚胎的初步探索[D]. 陈集成. 广西大学, 2014(02)
- [7]胞质内单精子注射制备转基因猪技术的优势与前景[J]. 胡骁睿,朱志伟,黄菁,陈晓宇,于福先,潘建治. 安徽农业科学, 2014(08)
- [8]精子载体技术研究进展[J]. 郝枭雄,朱征,曹棉富,李成仁,刘运来. 生物医学工程学杂志, 2013(02)
- [9]精子载体法制备转基因动物的研究进展[J]. 杜伟,崔海信,王琰,孙长娇,赵翔. 生物技术通报, 2012(12)
- [10]单精子胞质内注射转基因法（ICSI-MGT）生产转Fat-1基因兔的初步研究[D]. 张顺. 广西大学, 2013(01)