他克莫司通过转基因异基因间充质干细胞促进骨缺损修复

一、他克莫司促进基因修饰的同种异体间充质干细胞修复骨缺损（论文文献综述）

毛鑫^[1]（2021）在《人羊膜间充质干细胞抑制同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用microRNA表达初步探究》文中认为目的:本研究旨在探讨人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs）有减轻小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用的基础上,采用RNA-seq技术对其进行micro RNA转录组研究。初步挖掘hAMSCs在减轻排斥损伤方面的潜在机制。为hAMSCs的应用提供理论基础,也为其在减轻心脏移植免疫损伤方面的应用提供新的认识。方法:1.运用显微外科技术进行模型构建。分为同系移植组（A组）,异系移植组（B组）,异系移植干细胞干预组（C组）,干细胞（2.5×105个细胞/次/0.4毫升）于术后第1天、第4天经尾静脉注入。2.观察小鼠存活时间及状态,通过取B、C组供体心脏做HE染色观察心肌病理改变。3.评估模型成功后,于术后第7天取小鼠供心组织,收集RNA样本测序。通过RNA-seq、生物信息技术分析得到差异表达显着的micro RNA。4.应用mi Randa行靶基因预测后,用R的cluster Profiler进行富集分析。5.通过阅读相关文献,测序数据富集结果分析以及在GEO数据库相关测序分析结果中通过韦恩（venn）取得交集的方式,筛选出差异显着的micro RNA进行q RT-PCR验证。结果:1.造模及干预后观察小鼠状态良好,干细胞干预组小鼠存活时间较单纯异系移植组延长（P<0.05）;2.通过HE染色发现单纯异系移植组心肌组织中单核细胞、中性粒细胞侵入肌细胞的周界,肌细胞被浸润细胞包围。心肌纤维扭曲断裂。心肌纤维形态不规则,肌纤维水肿,且连续性消失。干细胞干预组心肌间单核细胞、中性粒细胞浸润明显减少,亦可见心肌纤维损伤断裂和结构变形,但程度较轻。3.通过测序分析得出AB组间、AC组间、BC组间差异性表达micro RNA分别为:1324、1323和1340个,其中显着差异的分别有:213、211、82个。4.通过靶基因预测发现的重要micro RNA包括:mi R-1247-5P、mi R-106b-3p、mi R-127-5p。GO富集分析结果显示,靶基因主要富集包括:蛋白结合、激酶活性、转录调控、磷酸化等方面。KEGG通路富集在多个通路中,主要涉及:Rap1信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路、c AMP信号通路等。5.筛选出差异表达显着的micro RNA为:（1）.同、异系移植组间（AB组间）差异表达micro RNA:mi R-199a-3p;mi R-34b-3p;mi R-434-3p;（2）.三组间差异表达micro RNA:mi R-451a;mi R-494-3p;mi R-136-3p。通过q RT-PCR验证发现这些micro RNA与转录组测序得到的结果趋势基本相同。结论:1.初步表明了hAMSCs具有减轻同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用。2.通过RNA-seq、生物信息技术分析及q RT-PCR验证,初步确认mi R-451a、mi R-494-3p、mi R-136-3p的表达可能与hAMSCs减轻同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤的作用存在密切关系。

乔禹铭^[2]（2020）在《EPO预处理BMSCs对大鼠肾缺血再灌注损伤修复作用的初步研究》文中进行了进一步梳理背景:在同种异体肾移植过程中,移植肾肯定会受到缺血再灌注损伤的影响,移植肾的缺血再灌注损伤是造成移植肾急性排斥反应、移植物功能延迟恢复的主要原因,也是影响移植肾长期存活的重要原因之一,如何有效减轻移植肾的缺血再灌注损伤始终是临床工作关注的重点及难点。近年来,骨髓间充质干细胞的修复作用成为临床和基础研究的关注热点,因其来源广泛、易于工业化制备、免疫原性低等优点被广泛应用于组织工程、生物治疗等多种领域的研究,但是,骨髓间充质干细胞的治疗效果与其归巢到受损部位数量及其在局部微环境下的存活能力有着密切关系。因此,使用一些预处理方式来改善骨髓间充质干细胞的归巢能力和在局部微环境下的存活能力,是提高其治疗效果的一种新思路。有研究表明,骨髓间充质干细胞会表达促红细胞生成素受体,使用促红细胞生成素预处理骨髓间充质干细胞,可以增强其归巢能力和促进损伤修复能力,但是具体的作用机制有待进一步研究和探讨。目的:利用细胞实验和动物实验,探究促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞增殖分化的影响以及在微环境下存活能力的影响,进一步探明经促红细胞生成素预处理后骨髓间充质干细胞对肾脏缺血再灌注损伤的治疗效果。方法:1.细胞实验:将骨髓间充质干细胞与促红细胞生成素（500 IU/mL）在缺血再灌注损伤肾脏的匀浆上清中进行共培养,做好分组及标记,之后分别进行骨髓间充质干细胞成骨、成脂诱导分化及凋亡情况观察等实验,探究促红细胞生成素作为预处理因素对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响以及在局部损伤微环境下存活能力的影响。2.动物实验:实验动物分成模型组（夹闭双侧肾蒂45min,造成缺血再灌注损伤）,BMSCs组（模型鼠经尾静脉注射骨髓间充质干细胞）,EPO组（模型鼠经尾静脉注射促红细胞生成素）,EPO+BMSCs组（经尾静脉注射经促红细胞生成素预处理后的骨髓间充质干细胞）。分别于手术后第1天,第5天获取大鼠肾脏组织进行病理检查,并收集大鼠下腔静脉血进行肾功能检测,来探究EPO+BMSCs对肾脏缺血再灌注损伤的治疗作用。结果:1.EPO不会改变BMSCs的表面标志物,BMSCs组和EPO-BMSCs组经成骨诱导后,可见有红色的矿化结节出现;BMSCs组和EPO-BMSCs组经成脂诱导后,细胞中出现较为明显的圆形小脂滴,经油红O染色,可见红色脂滴;2.在肾脏缺血再灌注损伤微环境下,EPO预处理可显着降低BMSCs的凋亡率;3.经 EPO、BMSCs、EPO-BMSCs 治疗 1 天、5 天后,在 EPO-BMSCs 治疗组,表现为较轻的炎症反应,评分与模型组相比有显着差异;4.在EPO-BMSCs治疗组,大鼠肾功能得到明显改善。结论:1.促红细胞生成素预处理可增强骨髓间充质干细胞在损伤微环境下的抗凋亡能力;2.促红细胞生成素预处理骨髓间充质干细胞可明显改善肾脏缺血再灌注损伤。

王之旭^[3]（2019）在《异种胰岛移植研究最新进展》文中提出1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus,T1DM）是一种因自身免疫而引起的胰岛β细胞不可逆性的功能受损,因此无法通过口服降糖药物来改善病情,其治疗主要依赖外源性胰岛素的补充或进行胰岛移植。在T1DM的治疗上,胰岛移植可以增加T1DM患者体内正常胰岛细胞的数量,减少对外源性胰岛素的依赖、有效降低血糖水平以及防治远期并发症,因此在远期效果来看要优于补充外源性胰岛素。但目前由于供体器官短缺,而器官捐献者数量有限,导致同种胰岛移植无法大规模应用于临床,因此急需其他可以替代的手段——异种胰岛移植。目前转基因猪器官已被证明是异种移植的可靠来源,因此,猪的胰岛也被应用于异种胰岛移植中。近年来科学家们在该领域的多个方面的研究都取得了长足的进展:在供体的选择中确立了猪作为异种移植的主要器官来源,并通过对猪的胰岛进行多种基因编辑（如GTKO/CMAH/β4Ga1NT2基因的敲除以及CD2、CD46、CD59的插入等）实现了猪胰岛的人源化处理,使其免疫原性逐渐降低;在胰岛的制备方面通过应用各种新型消化酶和分离液（如Liberase MTF C/T消化酶、IPS分离液、EJ分离液等）以及新的分离方法（连续密度梯度离心法、选择性渗透压休克法等）,胰岛产量大幅度提升;在抗植免疫排斥通过应用各种高分子材料对胰岛细胞进行免疫封装隔离、免疫耐受的诱导（如通过形成混合嵌合体或进行胸腺移植来导中枢性免疫耐受以及通过间充质干细胞或Treg细胞诱导外周性免疫耐受）等方法在一定程度上降低了免疫排斥反应;除此之外科学家还发现了新的异源性抗原基因靶点（如FAM234A等）,并且对新基因靶点进行敲除后抑制了免疫排斥反应的发生。这些各种新的技术成果都在促进着异种胰岛移植的发展。为了使研究者们能更加直观地了解异种移植最新的研究进展,本文就异种胰岛移植供受体选择、胰岛的制备以及抗异种胰岛移植免疫排斥的方法等诸多方面最新进展做一系统的综述。

黄梦强^[4]（2019）在《柴胡皂苷a促进坐骨神经损伤大鼠IL-10表达并抑制瘢痕形成的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:周围神经损伤后的炎症反应和瘢痕形成是阻碍神经再生的主要因素,而柴胡皂苷a已经被证实在脊髓损伤及颅脑损伤大鼠可发挥抑制炎症反应的作用。本研究将柴胡皂苷a用于坐骨神经损伤模型大鼠,研究其对炎症反应和神经瘢痕形成的影响,并利用神经电生理及坐骨神经功能指数等手段评估神经功能恢复情况。方法:1.将60只SD大鼠随机分为三组,每组20只:假手术组（暴露坐骨神经后缝合肌肉及皮肤）;治疗组（切断坐骨神经后腹腔注射柴胡皂苷a悬液,剂量10mg/kg）;损伤组（切断坐骨神经后腹腔注射生理盐水,剂量10mg/kg）。2.造模后7天每组取8只大鼠,解剖取出相应坐骨神经,ELISA法检测抗炎因子IL-10的表达量。3.分别于造模后1天、7天、14天、28天、56天测量各组大鼠坐骨神经功能指数,评估各组大鼠下肢运动功能恢复情况;于造模后56天检测各组大鼠神经电生理功能,评估神经电传导功能恢复情况。4.于造模后56天每组取6只大鼠,解剖取出相应坐骨神经,进行Masson染色,以衡量损伤处瘢痕组织形成情况;造模后56天每组取6只大鼠,解剖取出相应坐骨神经组织,处理后进行Western blot检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量。结果:1.ELISA检测各组IL-10表达量结果显示:假手术组IL-10表达量为65.93±7.374ng/L,损伤组IL-10表达量为95.74±5.741ng/L,治疗组IL-10表达量为168.2±12.13ng/L,治疗组IL-10表达量明显高于损伤组,差异有统计学意义。这说明柴胡皂苷a促进了坐骨神经损伤大鼠IL-10的表达,2.Masson染色结果显示:假手术组蓝色胶原纤维量较少,损伤组蓝色胶原纤维大量存在,而治疗组蓝色胶原纤维量明显少于损伤组。Western blot结果显示:损伤组Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达量明显高于治疗组,差异有统计学意义。以上结果共同说明:柴胡皂苷a抑制了大鼠坐骨神经损伤处瘢痕组织的形成。3.坐骨神经功能指数测量结果显示:在造模后28天和56天,治疗组大鼠SFI值均明显高于损伤组,差异有统计学意义。神经电生理结果显示:治疗组大鼠坐骨神经传导速度明显高于损伤组,差异有统计学意义。以上结果说明:柴胡皂苷a促进了坐骨神经损伤大鼠下肢运动功能和神经电传导功能的恢复。结论:1.柴胡皂苷a可作用于大鼠坐骨神经损伤,对IL-10的表达有促进作用,同时可神经瘢痕的形成。2.柴胡皂苷a对大鼠坐骨神经损伤后的下肢运动功能及神经电传导功能恢复均有正向作用。或可成为治疗周围神经损伤的辅助手段。

刘克勋,霍洪军,赵岩,左媛^[5]（2018）在《间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的进展及发展趋势》文中研究表明背景:间充质干细胞有取材方便、易于分离培养的优点,并且具有调控免疫反应、支持造血、抑制过度炎症反应、促血管生成等诸多特性。通过移植间充质干细胞治疗脊髓损伤的方法,给脊髓损伤患者康复带来希望。目的:总结并讨论间充质干细胞治疗脊髓损伤的最新进展、存在的问题及未来应用前景。方法:检索中国期刊全文数据库（CNKI）和PubMed数据库2000至2017年相关文献,检索词分别为"间充质干细胞;脊髓损伤;细胞移植;联合治疗"和"Mesenchymal stem cells;spinal cord injury;cell transplantation;combined treatment"。排除旧的、重复的观点,对检索的文献进行整理,共纳入71篇文献进行分析探讨。结果与结论:（1）间充质干细胞移植治疗脊髓损伤大多停留在基础研究与动物研究;（2）单纯间充质干细胞移植治疗脊髓损伤存在局限性,人们更多的采用间充质干细胞联合细胞、药物及生物支架等方法治疗脊髓损伤,这样不仅可以发挥间充质干细胞的治疗作用,而且可以将间充质干细胞的优点扩大;（3）寻找对人体影响较小的间充质干细胞最佳搭档,并进行自体间充质干细胞移植将成为脊髓损伤治疗的发展趋势。

陈海德^[6]（2017）在《GGTA1敲除猪以及低免疫原性人多能干细胞的研究》文中指出(1)GGTA1敲除猪的研究面临器官移植供体短缺的现状,异种移植是一种可行的替代方案。大量研究证明猪是合适的异种移植供体。使用猪进行异种移植仍然需要克服许多免疫排斥障碍,包括超急性免疫排斥反应（HAR）,急性体液异种排斥反应（AHXR）,急性细胞排斥反应（ACR）,凝血功能异常,慢性排斥反应（CR）和炎症反应等。基于相关致病机理的研究,研究人员认为制备基因修饰猪是克服异种移植免疫排斥障碍的有效措施。目前功能正常的猪多能干细胞系仍然没有建立,而基于同源重组进行的基因修饰在猪体细胞中效率较低,严重制约了相关研究的进展。最近几年出现了多种高效的基因定点修饰工具,包括锌指核酶（ZFN）,转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）以及CRISPR/Cas9。这些技术被成功地应用于各种模式生物中,我们也建立了基于ZFN和TALEN的猪基因修饰系统。我们首先使用ZFN制备GGTA1KO（GTKO）猪,然后在GTKO猪细胞中使用TALEN对猪白细胞抗原（SLAs）相关基因进行修饰。GGTA1参与形成的Ga1是引起HAR的主要异种抗原。在进化过程中,GGTA1在人类和旧世界猴中失去功能,导致他们的细胞表面没有Ga1抗原,所以他们血液中存在大量靶向Ga1抗原的天然抗体。为了克服HAR障碍,研究人员在猪体细胞上通过同源重组修饰GGTA1并结合体细胞核移植技术制备GTKO猪,通过异种移植实验表明GTKO猪可以显着抑制HAR的发生。但是这种技术不仅效率很低,而且会引入外源的抗药基因,无法满足后续大量基因修饰的需求。我们将靶向GGTA1编码区序列的ZFN质粒和抗药质粒通过瞬转手段导入胎猪成纤维细胞中,经过药物筛选获得了18个单拷贝敲除和4个双拷贝敲除的细胞克隆,效率分别为23.4%和5.2%。随后我们将获得的双拷贝敲除的细胞作为核供体进行体细胞核移植,产生克隆猪。经鉴定,一共获得3头GTKO猪。同时我们利用克隆胎儿建立了一个GTKO胎猪成纤维细胞系。通过细胞表面标记鉴定证明GTKO猪的细胞膜上Ga1抗原被完全清除。通过杀伤实验证明GTKO猪的细胞可以在与人血清共培养时不受抗体补体介导的免疫攻击。在GTKO猪的基础上,我们通过TALEN技术修饰猪的SLAs,将其中的部分基因替换为人类白细胞抗原（HLAs）中的部分基因。我们设计并验证了靶向SLA-1和-2的TALEN。同时我们设计并构建了相关的KI载体进行基因替换实验。通过PCR验证HLA-A基因成功替代SLA-1,并能在猪细胞中表达。这一策略在异种移植中的效果仍需要使用实验猪进行进一步的异种移植验证。（2）低免疫原性人多能干细胞的研究人多能干细胞（hPSCs）具有自我更新能力,并可以在一定条件下分化为机体内所有的细胞类型。所以研究人员尝试将hPSCs分化为各种组织细胞,用于移植替换病人身上受损的组织细胞。在人类同种异体组织器官移植的过程中,供受体细胞表面的HLAs不兼容会导致免疫排斥反应。HLAs分为HLA Ⅰ和HLA Ⅱ:CD8+T细胞识别HLA Ⅰ,参与直接靶细胞杀伤作用;CD4+T细胞识别HLA Ⅱ,分泌大量细胞因子参与调控免疫反应。我们实验室的工作重点在于使用定点基因修饰的方法降低hPSCs的免疫原性,以满足其临床使用的要求。我们实验室之前通过对B2M的KO已经建立了 HLA Ⅰ缺陷的hPSCs,证明了其免疫原性的降低,同时hPSCs的多能性和自我更新能力都没有显着的变化。在本研究中我们使用TALEN对HLA Ⅱ的关键调控基因CIITA进行KO,从而降低hPSCs及其分化获得的细胞中的HLA Ⅱ相关基因的表达。CIITA-/-hPSCs在自我更新和分化能力方面与WT hPSCs无明显差异。将CIITA-/-hPSCs分化为树突状细胞（DCs）后,CD83和CD86等表面蛋白标记物正常表达,但其结构型HLA Ⅱ表达显着下降。将CIITA-/-hPSCs分化为成纤维细胞后,在IFN-γ的刺激下诱导型HLA Ⅱ表达显着下降。将分化获得的CIITA--成纤维细胞与CD4+T细胞共培养,CD4+T的活化减弱。这些结果说明CIITA-/-hPSCs分化获得的组织细胞可能降低CD4+T细胞介导的免疫排斥反应。我们的研究将有利于推动hPSCs的临床应用,尤其是将hPSCs分化为结构型高表达HLAII的组织细胞进行移植替换,比如DCs和T细胞等。

张军^[7]（2016）在《同种异基因脂肪来源间充质干细胞辅助自体脂肪移植的实验研究》文中进行了进一步梳理【研究背景】脂肪移植技术因脂肪组织来源丰富,获取方便,操作相对简单、微创,故在美容和修复重建领域得到越来越广泛的应用。然而,术后移植的脂肪容易出现脂肪结节、囊泡等并发症,更因术后低且不稳定的脂肪容积保有率（20–80%）严重制约了该技术进一步发展。2001年Zuk等学者第一次从人的脂肪组织中分离出具有多向分化能力的干细胞,命名为脂肪来源间充质干细胞（ADSCS）。ADSCS具有转分化为血管内皮细胞和脂肪细胞的能力,具有抗组织细胞凋亡和促进移植物血管化的作用,因此利用ADSCS辅助自体脂肪移植能明显降低脂肪结节、囊泡等并发症的发生几率,降低脂肪吸收率,进而提高移植脂肪成活质量和长期容积保有率。然而,消瘦的患者缺乏可以获得充足ADSCS的脂肪组织;ADSCS的分化与再生能力随年龄的增加而减弱,故难以从老年患者体内获得高活力的ADSCS;糖尿病、红斑狼疮等自身免疫相关性疾病改变了该类患者ADSCS的细胞属性,使其自身的ADSCS丧失了细胞保护和再生的功能。基于以上原因,传统的ADSCS辅助脂肪移植术在消瘦的、老龄的、自身免疫相关性疾病的患者中无法有效展开。鉴于ADSCS具有低免疫性和免疫抑制能力,利用同种异基因充足、健康的ADSCS辅助自体脂肪移植可能是解决上述问题有效的方法。【研究目的】1、通过对Lewis和BN大鼠腹股沟皮下脂肪和附睾周围脂肪组织的ADSCS获取、培养、鉴定,探讨哪个部位来源的ADSCS具有更高的生物活性。2、通过建立刀豆蛋白刺激脾单个核细胞（MNCs）增殖的模型,探究不同浓度的ADSCS对于MNCs增殖的影响;探讨同基因和异基因ADSCS的低免疫原性和免疫抑制能力。3、建立BN大鼠来源的ADSCS辅助Lewis大鼠脂肪移植的动物模型,观察同种异基因ADSCS是否降低了自体脂肪移植过程中的细胞损伤程度;是否促进移植脂肪的再血管化过程;是否提高了移植脂肪的长期容积保有率。并检测了移植的同种异基因ADSCS和宿主间可能发生的免疫反应。【研究方法】1、Lewis和BN大鼠的腹股沟皮下脂肪和附睾周围脂肪通过酶消化法来分离和培养ADSCS,通过表面分子检测和诱导分化鉴定其是否为ADSCS;并且测定两种部位来源细胞的形态学、生长曲线、细胞周期。2、利用流式细胞分析仪检测与免疫原性相关的细胞表面分子CD40、CD80、CD86、MHC-I、MHC-II;建立ADSCS与活化的MNCs共培养的细胞模型,检测在此共培养体系中同基因和异基因ADSCS对脾单个核细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、以及CD4/CD25/Foxp3 Treg细胞比例的影响。3、建立BN大鼠来源的ADSCS辅助Lewis大鼠自体脂肪移植的动物模型。在脂肪移植术后7天和14天,检测了HE组织染色、脂周蛋白、原位细胞凋亡等反映脂肪组织细胞损伤指标;进行了VEGF的ELAISA和CD34的免疫组织化学等反映移植组织血管化指标的检测;进行了外周血CD4/CD8和CD4/CD25/Foxp3等反映免疫反应指标的检测。【结果】1、Lewis和BN大鼠获取的ADSCS,无种属上的明显区别;但与腹股沟皮下脂肪相比,两种大鼠附睾周围脂肪组织的纤维组织更少,在进行剪碎脂肪操作时更加省时省力;附睾脂肪组织纯度更高,单位质量获取的ADSCS的数量更多;而且附睾来源的ADSCS具有更早的贴壁时间,更佳的增殖能力和更短的传代时间;综上所述,附睾脂肪组织来源的ADSCS更加适合作为实验细胞。2、流式细胞仪检测发现,ADSCS不表达CD40、CD80、CD84、MHC-II和中度表达MHC-I。在ADSCS与活化的MNCs共培养的细胞模型中,ADSCS明显降低了MNCs的增殖,增加了处于G0/G1期的MNCs细胞比例;抑制了MNCs的凋亡;提高了具有负向免疫调节能力的CD4/CD25/Foxp3 Treg细胞的比例。3、在建立BN大鼠来源的ADSCS辅助Lewis大鼠脂肪移植的模型中,发现异基因和同基因ADSCS均能减轻移植术后7天、14天的脂肪细胞损伤与凋亡;增加移植物血管密度和血管内皮生长因子的含量;提高术后3月时脂肪容积保有率。移植术后7天、14天的宿主外周血中CD4/CD8比值和CD4/CD25/Foxp3 Treg含量在异基因干细胞组和对照组之间并无统计学差异。【结论】1、与腹股沟皮下脂肪相比,Lewis和BN大鼠附睾周围脂肪来源的ADSCS获取效率更高和增殖传代能力更强。2、ADSCS具有低免疫原性和免疫抑制性。同基因和异基因ADSCS均能降低Lewis大鼠的已经活化的MNCs增殖、抑制MNCs的细胞分裂、提高MNCs中CD4/CD25/Foxp3+Treg细胞的含量。但是并不促进MNCs凋亡的发生。3、在建立BN大鼠来源的ADSCS辅助Lewis大鼠脂肪移植的动物模型中,异基因ADSCS和同基因ADSCS一样能够降低术后7天、14天的细胞损伤和凋亡;促进移植物的血管化进程;提高移植脂肪组织的长期容积保有率;而且未发现异基因ADSCS引起的免疫排斥反应。

向俊西,郑幸龙,董鼎辉,康骁弘,李建辉,吕毅^[8]（2014）在《间充质干细胞辅助肝脏移植的应用方向及前景》文中研究指明背景:因严峻的肝脏供体短缺形势而产生的边缘供肝移植、辅助性肝移植、部分肝移植等技术,仍无法克服术后移植物无功能及受者死亡率高等困难,移植后免疫相关并发症等也已成为制约肝脏移植进一步发展的瓶颈问题。间充质干细胞因其强大的再生能力及多向分化潜能、免疫调节作用,有望成为解决肝脏移植领域重大临床问题的创新疗法。目的:总结并讨论间充质干细胞辅助肝脏移植的应用方向及前景。方法:检索PubMed、ScienceDirect、OvidSP、CNKI数据库相关文章,检索时间为2000至2014年,英文检索词为"mesenchymal stem cells,mesenchymal stromal cells,liver transplantation,immunosuppression,liver regeneration",中文检索词为"骨髓间充质干细胞、骨髓基质细胞、肝移植、免疫抑制、肝再生",从中筛选出与主题相关且论据可靠的部分文献,最终纳入74篇文章进行归纳综述。结果与结论:间充质干细胞因具有广泛的来源、强大的再生及分化潜能、免疫调节作用,已成为细胞治疗研究的热点,有望解决器官移植领域一些尚未攻克的难题,为延长移植器官寿命、减少免疫抑制剂使用、改善移植受者预后提供了新的治疗手段。已有大量关于间充质干细胞应用于器官移植的实验研究、临床前研究、临床研究发表,证实了这一可能性。但在其广泛应用于临床之前,仍有许多问题有待进一步研究明确,以确保其安全性和有效性。

马虎成^[9]（2014）在《CXCR4转染的骨髓间充质干细胞移植联合白介素-1β siRNA治疗急性肝衰竭的作用研究》文中进行了进一步梳理急性肝功能衰竭（acute liver failure,ALF）是指患者突然发生大量肝细胞坏死,或出现严重的肝功能损害,并于起病8-24周内,出现肝昏迷的一种临床综合征。传统的内科治疗并不能逆转肝衰竭患者的预后,肝移植术是目前唯一有效的治疗方式。但由于供体来源短缺、实施肝移植治疗等待时间过长、手术费用昂贵、术后需终生服用免疫抑制剂等缺陷限制了其应用。近些年来,骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）已被证实具有免疫抑制和修复损伤组织的能力。并且大量的基于干细胞移植治疗的研究已在医学领域取得了令人瞩目的成果,为多种疾病的治疗提供了新的思路。MSC移植也已被用于治疗包括急性肝衰竭在内的各种终末期肝病的实验及临床研究。但同时国内外的许多研究也发现了细胞移植疗效不佳的现象,对这一系列文献的回顾性研究发现主要有两个原因制约了 MSC移植治疗的疗效,一是由于移植的MSC在肝脏的定植率较低,二是由于肝功能衰竭体内存在过激的炎症反应,这在一定程度上抵消了 MSC的组织修复能力。同时,干细胞移植治疗急性肝衰竭的机理尚缺乏统一认识。因此,本课题从提高移植干细胞在肝脏的定植率和降低急性肝衰竭体内过激的炎症反应入手,通过明确干细胞移植治疗的机制,解决目前干细胞移植治疗急性肝衰竭效率低下的问题。第一部分:CXCR4促进骨髓间充质干细胞在肝脏定植的相关研究目的:提高外周静脉注射的CXCR4-MSC在急性肝衰竭裸鼠肝脏的定植率和疗效。方法:构建CXCR4慢病毒载体并进行包装和滴度测定,采用慢病毒侵染骨髓间充质干细胞构建过表达CXCR4基因的稳定转染细胞株。qPCR检测CXCR4基因转录水平的表达,Western Blot和流式细胞术检测CXCR4蛋白水平的表达。20%v/v四氯化碳（CC14）橄榄油溶液8μl/g腹腔注射诱导裸鼠急性肝衰竭模型,ELISA实验检测急性肝衰竭裸鼠肝脏SDF-1α水平。迁移实验检测转染的骨髓间充质干细胞向基质衍生因子-1α（SDF-1α）的趋化能力。模型诱导后24小时裸鼠尾静脉分别注射CXCR4转染的间充质干细胞（CXCR4-MSC,n=10）和未转染的间充质干细胞（Null-MSC,n=10）,并采用ALF组作为对照（n=10）。于注射后各时间点活体示踪MSC分布情况,评估CXCR4对MSC肝脏靶向定植的作用。结果:qPCR、WB和流式细胞术检测显示构建的CXCR4-MSC高表达CXCR4基因和CXCR4蛋白;急性肝衰竭裸鼠肝脏SDF-1α水平明显升高,与正常裸鼠相比有统计学差异。体外迁移实验证实CXCR4-MSC比Null-MSC具有向SDF-1α更好的迁移能力。体内活体成像显示干细胞移植后第1天和第5天,CXCR4-MSC主要定植在肝脏,而Null-MSC在肝脏和脾脏都有定植。结论:通过基因修饰使MSC高表达CXCR4基因能够促进MSC在急性肝衰竭肝脏的定植,为MSC移植治疗急性肝衰竭提供了广阔的前景。第二部分:IL-1β siRNA腺病毒载体抑制肝脏IL-1β的相关研究目的:构建IL-1β siRNA腺病毒载体,筛选出其抑制裸鼠肝脏内IL-1β水平的最佳剂量和最佳时间点,并验证腺病毒载体的免疫源性。方法:针对IL-1β设计并合成一套siRNA干扰序列,共4对;将siRNA干扰序列克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体中。将一系列化学合成的oligo通过PCR的方法拼接成所需的序列,并将合成好的序列TA克隆入pMD-18T载体,测序验证。然后再将目的基因克隆装入载体pcDNA3.1+;测序验证,构建高表达载体。将干扰载体和高表达载体同时转染模型细胞HEK293细胞进行干扰效果评价,挑选干扰效果最好的干扰载体通过重组转换成腺病毒载体;并利用293A细胞进行腺病毒的包装,收集病毒原液并测定病毒滴度。裸鼠（n=20）尾静脉分别注射腺病毒 2×107 ifu（20μl）、5×107 ifu（50μl）、1×108 ifu（100μl）和2×108ifu（200μl）。并设置正常组（n=5）作为对照,36h后取肝脏qPCR检测肝组织IL-1β相对表达量,筛选最佳计量。随后使用最佳计量尾静脉注射,注射后不同时间点取裸鼠肝脏,qPCR检测IL-1β相对表达量,评估IL-1β siRNA腺病毒载体对IL-1β的最佳干扰时间点。选取健康裸鼠尾静脉注射最佳计量不含IL-1β siRNA的腺病毒空载体,4h后ELISA检测血清INF-γ、TNF-α和IL-6水平,评估腺病毒载体的免疫源性。结果:成功构建四对IL-1β siRNA腺病毒载体,qPCR显示干扰载体13MR0069-4的基因沉默效果最佳,达到69%。qPCR实验显示注射剂量为1×108 ifu时干扰效率达到90%左右,继续增加病毒数量干扰效率无明显变化。在注射IL-1β siRNA腺病毒载体后36h,干扰效率最高,达到76%,随后干扰效率逐渐降低,到第5天时降为40%。尾静脉注射1×108 ifu腺病毒空载体4h后,血清中INF-y、TNF-α和IL-6水平无明显升高。结论:IL-1β siRNA腺病毒载体具有强烈的IL-1β抑制效应,1×108 ifu为最佳干扰剂量,注射36h后干扰效率最高。该载体不诱导非特异性免疫反应,可以用作下一步研究。第三部分:IL-1β siRNA联合CXCR4-MSC治疗急性肝衰竭的相关研究目的:评估第一部分构建的CXCR4-MSC与第二部分构建的IL-1β siRNA腺病毒载体联合治疗急性肝衰竭的协同作用。方法:20%v/v四氯化碳（CCl4）橄榄油溶液8μ1/g腹腔注射诱导裸鼠急性肝衰竭模型。100只裸鼠随机分为5组:正常对照组（n=20）;ALF组（n=20）;IL-1β siRNA组（n=20）,裸鼠造模前6小时尾静脉注射腺病毒1×108 ifu;CXCR4-MSC组（n=20）,裸鼠造模后24小时后尾静脉注射CXCR4-MSC约5×105;IL-1β siRNA+CXCR4-MSC组（n=20）,裸鼠造模前6小时尾静脉注射腺病毒1×108 ifu,造模后24小时后尾静脉注射CXCR4-MSC约5×105。每组随机抽取10只裸鼠用于生存期观察,其余裸鼠于注射后各时间点检测各组裸鼠肝功能、生存率、血清炎症因子水平、组织病理学改变、肝细胞凋亡和肝细胞增殖情况。为评估IL-1β siRNA对MSC的保护作用,免疫组化和荧光显微镜观察肝脏组织切片中的GFP 阳性细胞。检测肝脏中VEGF和HGF含量,初步探讨联合治疗的机制。结果:IL-1β siRNA+CXCR4-MSC具有促进肝功能恢复、显着降低转氨酶及体内促炎因子水平、促进肝细胞增殖、降低肝细胞凋亡的功能,效果优于单独应用IL-1β siRNA或者CXCR4-MSC;免疫组化及荧光显微镜显示IL-1βsiRNA+CXCR4-MSC组比CXCR4-MSC存活数量明显增多;ELISA显示IL-1βsiRNA+CXCR4-MSC组分泌VEGF和HGF较其余各组明显增多。结论:IL-1β siRNA能够发挥对移植CXCR4-MSC的保护作用,两者联合使用具有协同作用。

李轩,邢自宝,苏佳灿^[10]（2010）在《骨修复中基因工程应用研究进展》文中研究指明

二、他克莫司促进基因修饰的同种异体间充质干细胞修复骨缺损（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、他克莫司促进基因修饰的同种异体间充质干细胞修复骨缺损（论文提纲范文）

（1）人羊膜间充质干细胞抑制同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用microRNA表达初步探究（论文提纲范文）

（2）EPO预处理BMSCs对大鼠肾缺血再灌注损伤修复作用的初步研究（论文提纲范文）

（3）异种胰岛移植研究最新进展（论文提纲范文）

（4）柴胡皂苷a促进坐骨神经损伤大鼠IL-10表达并抑制瘢痕形成的实验研究（论文提纲范文）

（5）间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的进展及发展趋势（论文提纲范文）

（6）GGTA1敲除猪以及低免疫原性人多能干细胞的研究（论文提纲范文）

（7）同种异基因脂肪来源间充质干细胞辅助自体脂肪移植的实验研究（论文提纲范文）

（9）CXCR4转染的骨髓间充质干细胞移植联合白介素-1β siRNA治疗急性肝衰竭的作用研究（论文提纲范文）

四、他克莫司促进基因修饰的同种异体间充质干细胞修复骨缺损（论文参考文献）

• [1]人羊膜间充质干细胞抑制同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用microRNA表达初步探究[D]. 毛鑫. 遵义医科大学, 2021(01)
• [2]EPO预处理BMSCs对大鼠肾缺血再灌注损伤修复作用的初步研究[D]. 乔禹铭. 南方医科大学, 2020(06)
• [3]异种胰岛移植研究最新进展[D]. 王之旭. 厦门大学, 2019(12)
• [4]柴胡皂苷a促进坐骨神经损伤大鼠IL-10表达并抑制瘢痕形成的实验研究[D]. 黄梦强. 天津医科大学, 2019(02)
• [5]间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的进展及发展趋势[J]. 刘克勋,霍洪军,赵岩,左媛. 中国组织工程研究, 2018(21)
• [6]GGTA1敲除猪以及低免疫原性人多能干细胞的研究[D]. 陈海德. 浙江大学, 2017(11)
• [7]同种异基因脂肪来源间充质干细胞辅助自体脂肪移植的实验研究[D]. 张军. 第二军医大学, 2016(02)
• [8]间充质干细胞辅助肝脏移植的应用方向及前景[J]. 向俊西,郑幸龙,董鼎辉,康骁弘,李建辉,吕毅. 中国组织工程研究, 2014(32)
• [9]CXCR4转染的骨髓间充质干细胞移植联合白介素-1β siRNA治疗急性肝衰竭的作用研究[D]. 马虎成. 南京大学, 2014(05)
• [10]骨修复中基因工程应用研究进展[J]. 李轩,邢自宝,苏佳灿. 中国康复, 2010(05)

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