一、番茄ACC合成酶基因的反义RNA-核酶嵌合基因植物表达载体的构建及对番茄的转化（论文文献综述）
张伟[1]（2013）在《桃成熟过程中的活性物质变化及PG、ACO基因的克隆表达与遗传转化》文中研究说明桃（Prunus persica）原产于我国，属蔷薇科多年生落叶乔木果树，在全球南北纬45°间范围均有分布。桃果实鲜丽、清香多汁、酸甜适口、味美质细、极宜鲜食，其果肉中的生物活性组成成分有抗氧化、预防糖尿病、癌症等作用。桃从发育、成熟到软化经历了一系列复杂的过程，不仅包括生长，还包含色泽、质地、风味、香气及内含物等变化。桃是典型的呼吸跃变型水果，其果实成熟后会产生大量乙烯，诱发果实“呼吸”迅速升高，导致果实贮藏物质迅速水解而软化腐烂。这一过程涉及许多基因表达和多种水解酶活性变化，是由多种因素共同作用而导致的综合性结果。RNA干扰技术的创立与应用为有效缓解桃果实采后迅速软化和快速实现桃种质创新提供了新的重要途径，可望通过该技术的应用，封闭或降低果实成熟过程中果肉细胞壁原果胶分解的多聚半乳糖醛酸酶（PG）和催化乙烯合成前提物1-氨基丙烷-1-羧酸（ACC）氧化脱羧的氧化酶（ACO）活性，阻滞桃果实采后迅速软化和腐烂，大幅度延长果实的有效贮藏时间和降低贮运成本，增加桃的生产附加值。为此本研究以兰州地区果实成熟后极易软化的“白凤桃”为实验材料，测定和分析其成熟过程不同阶段，果实中活性物质和抗氧化能力的变化，以及与PG和ACO基因表达之间的关系，并以白凤桃基因组DNA为模板，克隆了PG和ACO基因，构建其RNA干扰植物表达载体，通过根癌农杆菌介导法建立桃胚和番茄的遗传转化体系，获得了卡那霉素（km）抗性植株。主要研究结果如下：1.随着桃果实的逐渐成熟，果实硬度、可滴定酸度逐渐下降，可溶性固形物含量、果肉成熟指数、花青素和维生素C的含量则逐渐增加；总酚含量基本呈下降趋势，而总黄酮含量先升而后降。在果实成熟软化过程中，果肉芳香挥发物的总量显着增加，其中有7类主要的芳香挥发物变化明显：反式-2-己烯醛和顺式-3-己烯醇含量逐渐减少，γ-十二内酯、γ-癸内酯、δ-癸内酯含量则显着增加，而γ-己内酯和γ-辛内酯含量显着增加后略有回落，这些变化使得桃果实可食性增强。2．采用DPPH法和FRAP法进行桃果实抗氧化能力分析，发现果肉总抗氧化能力随着果实成熟整体呈上升趋势，达到完熟期开始下降。皮尔逊相关分析表明，果实抗氧化能力增强促进了芳香挥发物总量、γ-十二内酯、γ-己内酯、γ-辛内酯、γ-癸内酯、δ-癸内酯、花青素和维生素C的代谢，呈显着正相关性。其中DPPH法测得抗氧化能力与γ-己内酯相关系数达到0.973，而FRAP法得到与维生素C的相关系数达到0.981。3.桃果实成熟期间，随着果实硬度和可滴定酸度降低，可溶性固形物和果实成熟指数上升，ACO基因表达量不断增加，而且与芳香挥发物总量，γ-十二内酯，γ-癸内酯，δ-癸内酯，γ-己内酯，γ-辛内酯，花青素和维生素C呈正相关，而与反式-2-己烯醛，顺式-3-己烯醇和总酚类物质则呈显着负相关。PG基因的表达在桃果实在进入着色期后就显着增加，接近完熟期时下降并保持在一个相对稳定的水平。其表达量的变化与可滴定酸度和反式-2-己烯醛、顺式-3-己烯醇、总酚类物质呈负相关（P<0.05和P <0.01），与γ-己内酯、类黄酮和花青素呈正相关（P <0.01）。果实成熟期抗氧化能力的降低与PG基因表达量的降低密切相关。而ACO基因的表达与桃抗氧化能力的关系却明显不同，不论桃“着色期”中ACO表达量降低或升高，果实的类黄酮含量和抗氧化能力均呈缓慢降低的态势，表明ACO的表达与果实成熟期抗氧化能力的变化无关。4.利用CTAB法提取了供试材料果实基因组DNA，以DNA为模板进行PG、ACO基因的克隆，并进行表达载体的构建，得到了PG和ACO的RNAi植物表达载体，同时进行PCR、酶切鉴定和测序，结果表明，成功构建了pCAMBIA2300-PG和pCAMBIA2300-ACO植物表达载体。5.优化番茄再生体系，用携有ACO基因hpRNA片段和35S启动子的表达载体pCAMBIA2300，转化番茄。番茄暗预培养3d后，经OD600为0.6的根癌农杆菌菌液浸染8min后进行共培养（MS+IAA0.2mg/L+6-BA1.0mg/L+AS200μmol/L），3d后，用Cef进行洗涤脱菌，脱菌培养3d后，转去分化培养基MS+IAA0.2mg/L+6-BA1.0mg/L+Cef300mg/L+Km30mg/L诱导产生不定芽，将抗km的不定芽在生根培养基上继续选择，获得完整植株。经PCR和点杂交检测初步证明，ACO基因已导入番茄中。6.以白凤桃果实种胚为外植体，进行桃胚直接诱导不定芽再生体系的优化：种胚开花75d后能在MS+NAA0.05mg/L+6-BA0.5mg/L上直接诱导分化成苗，分化率可达91.5%。用携带有PG基因hpRNA片段和35S启动子的表达载体pCAMBIA2300，转化白粉桃幼胚。当幼胚预培养3d后，经OD600值为0.4的根癌农杆菌菌液浸染10min后共培养65h，转移去分化培养基MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+Cef250mg/L+km50mg/L上诱导产生不定芽，将抗km的不定芽生根培养基上继续选择，获得完整植株。经PCR检测和Southern杂交检测初步证明，PG基因已导入桃中。
李文桂,陈雅棠[2]（2011）在《改良品质的转基因番茄研制现状》文中研究说明番茄（Lycopersicon esculentum）是一种优良的蔬菜品种,应用基因工程技术对番茄进行开发和改造已成为国内外研究的热点。本文综述了延迟成熟品种、耐盐品种和耐寒品种的转基因番茄的研制现状。
关淑艳,王丕武,刘广娜,刘慧婧,赵丽娜,郭树成[3]（2009）在《反义技术及其在植物基因工程中的应用》文中研究说明概述了反义技术的作用机制及其在现代植物研究中的应用。反义技术在调控植物淀粉的合成与果实成熟、改良作物品质、改变植物花色、增强植物抗病性和研究未知基因的功能等方面具有重要作用,并对反义基因技术的应用进行了展望。
朱海生[4]（2008）在《草莓乙烯受体反义基因遗传转化的研究》文中研究指明草莓（Fragaria ananassa Duch）是一种重要的小型浆果,在世界范围内广泛栽种,近年来育出很多优良品种,种植面积逐渐扩大。然而仍有很多因素限制了草莓生产的发展,其中一个重要难题就是草莓果实难以保鲜、不耐贮运。基因工程技术为植物育种、种质资源开发利用等领域开辟了新的途径,可以获得常规育种难以或无法得到的新类型。果实成熟是一个复杂的生理生化过程,而乙烯是引发果实成熟的主要因素之一。乙烯能从其生物合成和感知与信号转导两方面进行调控,相对于人们对乙烯生物合成途径的了解而言,有关植物感知乙烯及其信号转导机制的知识了解甚少,目前对乙烯信号转导的研究主要集中在拟南芥上。草莓是非跃变型果实,也能产生乙烯,某些情况下乙烯可能参与草莓的成熟,乙烯和草莓成熟之间的关系,不同的试验得出的数据彼此矛盾,目前并没有明确的结论,至今没有结果明确表明乙烯和非跃变型果实成熟的关系。乙烯感知和信号转导的初始成分是乙烯受体,乙烯的生理作用最终是通过乙烯受体及其信号转导过程完成的。目前草莓上分离出3个乙烯受体基因,本试验采用反义RNA技术试图了解乙烯在草莓果实成熟衰老中的作用及这些乙烯受体的功能和作用方式。本试验对草莓组织培养体系进行了系统研究,优化了农杆菌介导的草莓遗传转化体系。构建了草莓反义乙烯受体表达载体pBI121Etr1、pBI121Ers1和pBI121Etr2及同时含有草莓乙烯受体FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS,用于转化草莓,成功的获得了转基因植株,并进行了相关分子生物学鉴定,获得反义转基因材料对探讨乙烯受体作用以及乙烯在草莓等非跃变型果实成熟的调控机理具有重要意义,也为后续研究提供了宝贵的试验材料。1.在已报道的FaEtr1、FaErs1和FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,分别克隆草莓乙烯受体FaEtr1基因580bp部分特异序列、FaErs1基因445bp部分特异序列和FaEtr2基因345bp部分特异序列,将上述3个片段分别反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和Nos终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr1、pBI121Ers1和pBI121Etr2。将带有完整启动子和终止子的FaEtr1和FaErs1基因引入pCAMBIA2301中,最终获得FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS。通过PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pBI121Etr1、pBI121Ers1、pBI121Etr2和pFRS。将这4个重组表达质粒导入根癌农杆菌EHA105中,PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。2.以‘丰香’、‘鬼露甘’、‘全明星’、‘嫜姬’、‘哈利’、‘幸香’6个草莓品种为试材,研究了影响草莓不定芽再生的各种因素,建立离体叶片高效再生系统。结果表明,外植体基因型、植物生长调节剂种类及配比、叶龄等是影响草莓再生的主要因子。其中‘鬼露甘’叶片最佳芽诱导培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+IBA0.1mg·L-1,‘嫜姬’叶片愈伤组织的诱导以MS+6-BA3mg·L-1+2,4-D0.2mg·L-1较好;芽伸长的最适培养基为MS+6-BA0.5mg·L-1+IBA0.5mg·L-1;生根的最适培养基为MS+IBA0.2mg·L-1,试管苗移栽后成活率为87%。另外,1W左右的暗培养可以防止外植体的褐化。3.利用带有内含子的gus基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导‘鬼露甘’草莓遗传转化的若干因素。结果表明:草莓叶片外植体对卡那霉素较为敏感,适宜的筛选浓度为20mg·L-1,可明显抑制非转化组织的生长;300mg·L-1的羧吩青霉素可有效抑菌,对外植体生长影响也较小;预培养2-4d有利于转化;共培养2-3d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD600nm值为0.4的菌液侵染10min效果最佳。再生植株经PCR检测初步证明gus基因已成功整合到草莓基因组中。4.通过根癌农杆菌EHA105将含有反义FaEtr1和FaErs1基因的双价植物表达载体pFRS导入草莓,经卡那霉素选择压下连续分化选择、扩繁和生根培养并经PCR和Southern blot检测证明,其中15株的基因组已成功导入和整合反义FaEtr1和FaErs1基因。Northern分析表明,转入的反义基因对靶基因都有部分的抑制。通过根癌农杆菌EHA105将含有反义FaEtr2基因的植物表达载体pBI121Etr2导入草莓,经卡那霉素选择压下连续分化选择、扩繁和生根培养,并经PCR和Southern blot检测证明,其中26株的基因组已成功导入和整合反义FaEtr2基因。Northern分析表明,转入的反义基因对靶基因有部分的抑制。5.对转基因植株叶片部分器官的乙烯释放量,呼吸强度以及叶片脱落进行了检测。相对于对照而言,转基因植株叶片部分器官的乙烯释放量降低,转反义FaEtr2基因叶片乙烯释放量降低更明显。乙烯处理这些植株,叶柄脱落变缓,转反义FaEtr1和FaErs1双基因植株叶片脱落要比转FaEtr2基因植株叶片脱落慢。
李田[5]（2008）在《乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和番茄中的表达》文中研究指明乙型肝炎是一种严重危害人类健康的全球性疾病,接种乙肝疫苗是目前预防乙肝病毒（HBV）感染的主要措施。乙肝病毒表面抗原（HBSAg）为HBV包膜蛋白的组分,不具感染性,是乙肝疫苗的有效成分。现行乙肝疫苗主要通过酵母表达系统得到,其生产工序复杂、需要专门的纯化设备和相应的技术人员,成本较高,从而限制了乙肝疫苗的广泛应用,而利用植物生产乙肝疫苗可有效弥补这一不足。因此,本实验构建了含乙肝病毒表面抗原基因的植物表达载体,并将其分别在烟草和番茄中成功进行了表达。本实验首先构建了植物表达载体pBRSAg,该载体具有完整的植物表达元件,具CaMV35S启动子、农杆菌T-DNA左右边界、植物报告基因gus和植物选择标记基因hpt,适用于根癌农杆菌的转化;其次将表达质粒导入农杆菌,用于对烟草外植体的遗传转化,获得的抗性植株经检测,结果表明乙肝病毒表面抗原基因在烟草中得到表达;最后,将HBSAg基因用于番茄的遗传转化,其间建立了番茄再生体系以及番茄遗传转化体系,获得的抗性植株经检测,证明HBSAg基因在番茄植株中也同样获得了表达,这为利用转基因番茄生产口服疫苗提供了一定的理论指导和实验基础。
张亚丽[6]（2007）在《茶树ACS、ACO基因克隆与亲环素基因的鉴定及其表达分析》文中进行了进一步梳理乙烯是一种重要的植物激素，参与植物整个生理过程。ACC合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase，ACS）和ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid oxidase，ACO）是植物乙烯合成过程中的重要酶，对乙烯的合成具有重要的调控作用，所以这两个基因的研究具有理论与实际意义。在茶树新梢cDNA文库测序所获得的EST基础上，利用RACE（Rapid Amplification cDNA Ends）、RT-PCR等技术，克隆得到编码这两个酶的全长基因序列，在NCBI上分别登录为EF205149、DQ904328。其中ACS长1579bp，编码478个氨基酸，预测分子量约为53.7KD，等电点8.039；ACO长1237bp，编码320个氨基酸残基，预测分子量为36.2KD，等电点5.41。以Neighbor-Joining法构建进化树，发现ACS及ACO都与柿树中的同类基因同源性最高，亲缘关系最近。这两个基因的获得为以后进一步研究其在茶树抗逆中的作用打下一定的基础。根据所得到的茶树ACS及ACO基因序列设计引物，利用B-actin作为阳性对照，取安吉白茶、6／8、杭州大叶、龙井长叶、薮北、龙井43和福鼎大白茶7个品种在经历高温和低温，以及龙井43在冬天不同时期样品逆转录的cDNA进行RT-PCR分析，结果发现ACS及ACO基因的表达量与品种的抗逆性强弱有一定程度的相关性；在不同时期龙井43样品中，ACS及ACO基因的表达也有类似的结果。亲环素广泛存在于多种生物体内，在植物的发育和新陈代谢等生理过程中具有重要作用。通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序，获得了一个编码亲环素的全长基因，在GenBank登录，登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949bp，其中开放阅读框全长495bp，编码蛋白质含有164个氨基酸，分子量约为17.47kD，等电点约为8.54，它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后，发现与水稻和小麦的相似性较高，达到85％以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物，构建了原核表达载体pET／Csin-Cyp，并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功诱导出了一个分子量为23kD的亲环素融合蛋白。这将便于后期在基因以及蛋白质水平上进一步研究亲环素蛋白在茶树生理和调控机制中发挥的作用。
黄春琼[7]（2007）在《反义CCoAOMT基因转化苎麻和烟草的研究》文中认为木质素是植物体的主要化学组分,是地球上数量仅次于纤维素的有机物,是植物组织进化的产物,对植物的正常生长具有重要作用。然而,它的存在却给苎麻纺织工业及畜牧业生产带来负面影响。因此,对于木质素的生物合成途径及其基因调控的探索已成为研究热点。苎麻是中国重要的纤维植物,原麻含木质素1%～5%,是比较顽固的杂质,少量木质素的存在对苎麻纺织性能仍有较大影响。纺织工业利用的是苎麻韧皮纤维,原麻需经过脱胶后才能用于纺织。其中木质素是苎麻脱胶过程中最难去除的成分,原麻中的木质素含量高不仅使得脱胶的成本大大提高、而且污染严重。用常规育种或栽培措施来控制木质素含量总难达到理想的效果。因此,通过基因工程从源头上降低苎麻纤维中的木质素含量,具有潜在的应用前景。本研究利用反义RNA技术,把反义CCoAOMT cDNA转入烟草和苎麻,以为了解苎麻CCOAOMT基因对木质素合成的作用和降低木质素含量的可行性。本文的主要研究结果如下:（1）采用冻融法将pBSP—antiCCoAOMT-2301植物表达载体转入根癌农杆菌LBA4404,经PcR检测,获得了工程农杆菌LBA4404（pBSP—antiCCoAOMT-2301）,用于对植物的遗传转化。（2）为了验证所构建的pBSP-antiCCoAOMT-2301植物表达载体的可用性以及衡量在待转化苎麻中的可能表现,本研究将pBSP—antiCCoAOMT-230l植物表达载体转化烟草,经PCR以及Southern Blot鉴定证实,该基因己导入烟草基因组中,获得了转基因烟草。将其移栽于温室生长三个月时测定木质素及纤维素含量,结果显示,转基因烟草比非转基因烟草木质素平均含量降低了16.8%,伴随纤维素平均含量比非转基因烟草升高了15.2%,并且植株正常生长的转基因烟草。（3）优化了苎麻的再生体系,通过实验筛选出诱导愈伤及分化芽的培养基为MS+6·BA3.0mg/L+NAA 0.03mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉5g/L,（pH5.7）。并通过外植体及苎麻小苗对Kan的抗性实验,将Kan.50mg/L作为诱导愈伤的最适选择压力,Kan.40mg/L作为生根的最适选择压力,为进一步植物转化打下基础。（3）通过农杆菌介导,将苎麻反义CCoAOMT基因转入苎麻,经PCR及SouthernBlot检测,获得了转基因苎麻。
李峰,曹刚强,梁会娟[8]（2007）在《转基因技术在番茄遗传改良中的应用》文中研究表明近年来,利用转基因技术已经培育出抗病虫、抗逆、抗除草剂和延迟成熟等高品质的优良番茄品种。概述了国内外利用转基因技术进行番茄品种遗传改良的研究现状,并对其应用前景进行了展望。
陈春艳[9]（2006）在《Patatin、Wun1启动子驱动下的PPO反义基因植物表达载体构建及马铃薯、烟草的遗传转化研究》文中研究表明多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase, PPO）不仅与马铃薯抗病性有关,也与马铃薯块茎损伤褐化有关。如何保证地上植株具有较高的PPO活性,同时又能抑制块茎中PPO活性,减少块茎酶促褐变是马铃薯常规育种亟待解决的问题。本研究是在同源序列PPO反义基因PC3-ASPPOty植物表达载体基础上,利用生物技术构建由Patatin、Wun1启动子调控的PPO反义基因植物表达载体,初步探讨由Patatin、Wun1启动子调控的PPO反义基因植物表达载体在烟草中的转化和表达情况,为其在马铃薯上的应用提供依据。主要研究结果如下:1.设计合成带有BamHⅠ、SalⅠ特定酶切位点的2对特异引物,通过PCR获得了1.1kb和1.2kb的扩增产物,将扩增产物与pMD-18T载体连接,得到了具有Patatin启动子和Wun1启动子的2个重组子pMD-P和pMD-W。对2个重组质粒酶切、回收和纯化短片段后连接到线性表达载体PC3-ASPPOty中,通过PCR及酶切鉴定,证明得到了所需要的2个反义基因表达载体pCP-ASPPOty和pCW-ASPPOty。通过直接导入法将反义基因表达载体质粒（pCP-ASPPOty、pCW-ASPPOty）导入农杆菌LBA4404;经PCR鉴定,此质粒已整合到农杆菌Ti上。2.用农杆菌工程菌LBA4404+pCP-ASPPOty、LBA4404+pCW-ASPPOty、LBA4404+PC3-ASPPOty和LBA4404+PC3-ASPPOqc对烟草T12、马铃薯甘农薯1号和甘农薯2号进行遗传转化。烟草叶盘农杆菌侵染适宜浓度为0.5（OD600）,侵染最佳时间为58min,共培养2d出愈率和转化率最好;马铃薯茎段预培养2d,农杆菌侵染适宜浓度为0.5（OD600）,侵染最佳时间为5min,共培养2d出愈率和转化率（抗性愈伤组织）最好。而卡那霉素敏感性实验结果表明,烟草叶盘选取100mg/L Kan、马铃薯茎段选取50mg/L Kan作为选择压最为适宜。3.目前已获得含有全长序列PPO反义基因（PC3-ASPPOqc）、同源序列PPO反义基因（PC3-ASPPOty）、Patatin启动子驱动的同源序列PPO反义基因（pCP-ASPPOty）以及Wun1启动子驱动的同源序列PPO反义基因（pCW-ASPPOty）的转化烟草植株和“甘农薯1号”、“甘农薯2号”的转基因抗性愈伤组织。对转化植株进行PCR鉴定,证明为阳性植株。进一步生理检测和统计分析表明,Patain启动子驱动的PPO反义基因
张锋[10]（2005）在《纳豆激酶植物表达载体的构建及番茄遗传转化体系的建立》文中进行了进一步梳理番茄是世界上栽培最广泛,年产量最高的蔬菜作物之一,也是遗传学和生物工程等学科研究中的重要对象和模式植物,其研究结果常常被借鉴用于其他作物上。截至1997年底,全世界共有48个转基因番茄品种进行商业化生产。目前,利用番茄作为生物反应器生产植物疫苗、基因工程药物和功能食品的研究正成为番茄基因工程研究的一个热点。而纳豆激酶是一种由纳豆枯草杆菌（Bacillus natto）产生的具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶,其来源于日本的传统食品—纳豆（natto）。国内外的研究结果表明,NK可有效地分解血栓的主要成分——纤维蛋白,极有可能开发成为新一代理想的溶栓药物。因此,本试验旨在建立根癌农杆菌介导的高效的番茄遗传转化体系,为用植物作为生物反应器来获取纳豆激酶蛋白提供一条新途径,现取得的研究成果如下: 1. 根据GeneBank里公布的纳豆激酶基因序列设计引物,并分别在两端增加了BamHI酶切位点,利用纳豆芽孢杆菌菌液进行PCR 反应,通过试剂盒回收纯化提取NK 基因,并和PBST 载体连接,从而成功地克隆到了纳豆激酶基因;测序结果表明,克隆的NK 基因大小为1143bp,共编码381 个氨基酸,其与GeneBank 中报道的序列（AF368283）同源性达到99.7%以上,产生突变的3 个碱基,并没有影响到纳豆激酶的纤溶活性。 2. 利用质粒pBPC47、质粒pCAMBIA1300 和质粒pMG15 进行纳豆激酶基因NK 表达载体的构建。PCR 反应和酶切检测证明,目的基因片段正向插入载体pCAMBIA1300,从而成功的构建了表达载体pCAMBIA-nk。 3.采用经典冻融法转化pCAMBIA-nk 表达质粒,将其导入到农杆菌LBA4404 中;并利用农杆菌介导作用,将质粒pCAMBIA-nk 导入番茄,通过潮霉素筛选得到了大量的抗性愈伤组织,并进一步进行分化、生根、炼苗培养,最终得到了7 株再生番茄苗,转化率最高达到7.52‰。 4. 以载体质粒DNA 为阳性对照,未转化植株DNA 为阴性对照,对得到的再生植株进行PCR 反应。检测结果表明:有7 株扩增出1146bp 的条带,与质粒扩增出的条带位置相同,初步说明外源基因NK 已整合到番茄基因组中。
二、番茄ACC合成酶基因的反义RNA-核酶嵌合基因植物表达载体的构建及对番茄的转化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、番茄ACC合成酶基因的反义RNA-核酶嵌合基因植物表达载体的构建及对番茄的转化（论文提纲范文）
（1）桃成熟过程中的活性物质变化及PG、ACO基因的克隆表达与遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 引言 |
| 2. 果实成熟过程中生理的研究进展 |
| 2.1 果实成熟过程中物质的变化 |
| 2.1.1 果实成熟过程中的质地变化 |
| 2.1.2 果实成熟过程中细胞壁结构的变化 |
| 2.1.3 果实成熟过程中细胞及细胞壁主要成分的降解 |
| 2.2 主要细胞壁水解酶与果实成熟软化的关系 |
| 2.2.1 多聚半乳糖醛酸酶（PG） |
| 2.2.2 果胶果酯酶（PE）的变化 |
| 2.2.3 纤维素酶（Cx-cellulase） |
| 2.2.4 淀粉酶、糖苷酶的变化 |
| 2.3 乙烯与果实成熟软化的关系 |
| 2.3.1 乙烯的生物合成及其调控 |
| 2.3.2 乙烯生物合成中的关键酶 |
| 3. 调控果实成熟老化的基因工程技术 |
| 3.1 反义基因技术 |
| 3.2 RNA 干扰技术 |
| 4. 桃组织培养及遗传转化研究进展 |
| 4.1 桃组织培养研究进展 |
| 4.1.1茎尖培养 |
| 4.1.2 胚培养 |
| 4.1.3 其它类型的外植体培养 |
| 4.2 桃遗传转化研究进展 |
| 4.2.1 农杆菌介导法转化桃 |
| 4.2.2 基因枪轰击法转化桃 |
| 5. 立题依据、目的意义和研究内容 |
| 第二章 桃果实成熟过程中果实物质变化与 ACO 和 PG 基因表达 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 果实品质评估 |
| 2.2 植物化学分析 |
| 2.2.1 提取物的制备 |
| 2.2.2 总酚含量分析 |
| 2.2.3 类黄铜含量分析 |
| 2.2.4 花青素含量分析 |
| 2.2.5 维生素 C 含量分析 |
| 2.2.6 芳香挥发性物质的分离和分析 |
| 2.2.7 抗氧化能力的分析 |
| 2.3 基因表达分析 |
| 2.3.1 桃果实 RNA 的提取 |
| 2.3.2 引物的设计与合成 |
| 2.3.3 qPCR 分析 |
| 2.4 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 果实品质的变化 |
| 3.2 不同发育时期桃果肉中总酚、类黄酮、花青素和维生素 C 的变化 |
| 3.3 果肉芳香挥发物结构的变化 |
| 3.4 果肉的抗氧化能力的变化 |
| 3.5 桃不同发育阶段中 ACO 和 PG 基因表达变化 |
| 3.6 基因表达和果实品质、代谢成分和抗氧化能力的关系 |
| 4 讨论 |
| 第三章 桃 PG 基因的克隆与其 hpRNA 表达载体的构建 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 载体及菌株 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要试剂溶液的配制 |
| 1.6 引物的设计与合成 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 桃 PG 基因的克隆 |
| 2.1.1 桃基因组 DNA 的提取 |
| 2.1.2 基因组 DNA 的 PCR 扩增 |
| 2.1.3 目的片段的回收 |
| 2.1.4 目的片段与 T 载体的连接 |
| 2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.1.6 连接产物的转化 |
| 2.1.7 阳性克隆的筛选和鉴定 |
| 2.1.8 目的 DNA 片段的测序与序列分析 |
| 2.2 hpRNA 表达载体的构建 |
| 2.2.1 技术路线 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 含 pCAMBIA2300 质粒的菌株复苏与质粒 DNA 提取 |
| 2.2.2.2 中间载体 pCAMBIA2300-PG1 的构建 |
| 2.2.2.3 RNAi 表达载体 pCAMBIA2300-PG 的构建 |
| 2.2.2.4 构建好的植物表达载体向农杆菌中的转化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 桃基因组 DNA 的提取 |
| 3.2 电泳检查 PCR 扩增产物 |
| 3.3 PCR 产物的回收与鉴定 |
| 3.4 阳性克隆的测序及分析 |
| 3.5 反义基因 pCAMBIA2300-PG1 的鉴定 |
| 3.6 载体 pCAMBIA2300-PG 的构建 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 桃 ACO 基因的克隆与其 hpRNA 表达载体的构建 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 试剂、载体、菌株及主要仪器 |
| 1.3 主要试剂溶液的配制 |
| 1.4 引物的设计与合成 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 桃 ACO 基因的克隆 |
| 2.1.1 桃基因组 DNA 的提取 |
| 2.1.2 基因组 DNA 的 PCR 扩增 |
| 2.1.3 目的片段的回收 |
| 2.1.4 目的片段与 T 载体的连接 |
| 2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.1.6 连接产物的转化 |
| 2.1.7 阳性克隆的筛选和鉴定 |
| 2.1.8 目的 DNA 片段的测序与序列分析 |
| 2.2 hpRNA 表达载体的构建 |
| 2.2.1 技术路线 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 含 pCAMBIA2300 质粒的菌株复苏与质粒 DNA 提取 |
| 2.2.2.2 中间载体 pCAMBIA2300-ACO1 的构建 |
| 2.2.2.3 RNAi 表达载体 pCAMBIA2300-ACO 的构建 |
| 2.2.2.4 构建好的植物表达载体向农杆菌中的转化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 电泳检查 PCR 扩增产物 |
| 3.2 阳性克隆的测序及分析 |
| 3.3 ACO 干扰载体的构建 |
| 4. 讨论 |
| 第五章 根癌农杆菌介导 ACO 基因 hpRNA 表达载体对番茄的遗传转化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 番茄高效再生体系的建立 |
| 1.1.1 种子的消毒与接种 |
| 1.1.2 不同外植体对番茄愈伤组织和不定芽诱导的影响 |
| 1.1.3 不同激素配比对番茄愈伤组织和不定芽诱导的影响 |
| 1.1.4 不定芽的生根培养 |
| 1.1.5 计算公式 |
| 1.2 根癌农杆菌介导的 ACO 基因 hpRNA 表达载体对番茄的转化 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 试验方法 |
| 1.2.2.1 农杆菌工程菌液制备 |
| 1.2.2.2 抗生素敏感性试验 |
| 1.2.2.3 遗传转化系统的试验 |
| 1.2.3 转基因植株的 PCR 检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 番茄高效再生体系的建立 |
| 2.1.1 浸泡、不同消毒方式对番茄种子灭菌及萌发的影响 |
| 2.1.2 不同激素配比对番茄愈伤组织和不定芽诱导的影响 |
| 2.1.3 不同激素浓度对番茄外植体生根的影响 |
| 2.2 根癌农杆菌介导的 ACO 基因 hpRNA 表达载体对番茄的转化 |
| 2.2.1 抗生素敏感性试验 |
| 2.2.1.1 头孢霉素对组培苗生长的抑制效果 |
| 2.2.1.2 头孢霉素对农杆菌的抑制效果 |
| 2.2.1.3 卡那霉素对番茄组培苗生长的影响 |
| 2.2.1.4 卡那霉素对番茄叶片再生的影响 |
| 2.2.1.5 暗预培养过的叶片在含卡那 30 mg/L 的再生培养基上的再生情况 |
| 2.2.2 遗传转化条件的优化 |
| 2.2.2.1 预培养时间对遗传转化的影响 |
| 2.2.2.2 AS（乙酰丁香酮）浓度对遗传转化的影响 |
| 2.2.2.3 菌液浓度对遗传转化的影响 |
| 2.2.2.4 侵染时间对遗传转化的影响 |
| 2.2.2.5 不同共培养时间对遗传转化的影响 |
| 2.2.2.6 不同脱菌方式对抑菌效果的影响 |
| 2.2.3 转化植株的检测 |
| 3 讨论 |
| 第六章 桃胚直接诱导不定芽再生体系的建立及遗传转化 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 菌株与质粒 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 培养基 |
| 1.5.1 基本培养基 |
| 1.5.2 培养基类型 |
| 1.5.3 农杆菌培养基 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 桃胚直接诱导不定芽再生体系的建立 |
| 2.1.1 果实的选取 |
| 2.1.2 种胚的处理 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 种胚的培养 |
| 2.2 根癌农杆菌介导的桃胚遗传转化 |
| 2.2.1 抗生素敏感性试验 |
| 2.2.2 农杆菌的活化培养 |
| 2.2.3 遗传转化 |
| 2.3 转基因植株检测 |
| 2.3.1 转化植株与非转化植株 DNA 的提取 |
| 2.3.2 PCR 扩增 |
| 2.3.3 Southern 印记杂交检测 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 桃胚直接诱导不定芽再生体系的建立 |
| 3.1.1 幼胚发育天数对种胚萌发率的影响 |
| 3.1.2 不同消毒时间对种胚萌发率的影响 |
| 3.1.3 不同激素配比对种胚直接诱导分化的影响 |
| 3.2 遗传转化 |
| 3.2.1 卡那霉素敏感性试验 |
| 3.2.2 预培养时间对转化的影响 |
| 3.2.3 农杆菌菌液浓度和侵染时间对转化的影响 |
| 3.2.4 共培养时间对转化的影响 |
| 3.3 转化植株的检测 |
| 3.3.1 PCR 检测 |
| 3.3.2 Southern 杂交检测 |
| 4. 讨论 |
| 第七章 讨论 |
| 7.1 桃果实成熟过程中 PG 基因与 ACO 基因的表达的关系 |
| 7.2 PG 基因和 ACO 基因的表达与桃成熟过程中物质转化的关系 |
| 7.3 PG 基因和 ACO 基因的表达与桃抗氧化能力的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
（2）改良品质的转基因番茄研制现状（论文提纲范文）
| 1 延迟成熟品种 |
| 1.1 乙烯生物合成途径的调节 |
| 1.1.1 ACC合成酶基因 |
| 1.1.2 ACC氧化酶基因 |
| 1.2 乙烯信号转导途径的调节 |
| 1.2.1 LeEIL2基因 |
| 1.2.2 LeETR2基因 |
| 1.2.3 LeERF2基因 |
| 1.3 多聚半乳糖醛酸酶基因 |
| 1.4 异戊烯基转移酶基因 |
| 2 耐盐品种 |
| 2.1 液泡转化酶基因 |
| 2.2 K+/Na+转运蛋白基因 |
| 2.3 晚期胚胎丰富蛋白基因 |
| 2.4 胆碱脱氢酶基因 |
| 2.5 HRD转录因子基因 |
| 2.6 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因 |
| 3 耐寒品种 |
| 3.1 抗冻蛋白基因 |
| 3.2 小分子热休克蛋白基因 |
| 3.3 果聚糖合酶基因 |
| 4 结语 |
（3）反义技术及其在植物基因工程中的应用（论文提纲范文）
| 1 反义技术的作用机制 |
| 1.1 反义RNA |
| 1.2 反义DNA |
| 1.3 核酶 |
| 2 反义技术在植物基因工程中的应用 |
| 2.1 植物淀粉合成的调控 |
| 2.2 植物抗病性的研究 |
| 2.3 果实成熟过程的控制 |
| 2.4 油料作物种子中脂肪酸合成的控制 |
| 2.5 花卉颜色的控制 |
| 2.6 在植物其他方面的应用 |
| 3 反义技术的研究展望 |
（4）草莓乙烯受体反义基因遗传转化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1 乙烯 |
| 1.1 乙烯与果实的成熟 |
| 1.2 乙烯生物合成及相关酶 |
| 1.2.1 ACC合成酶(ACS) |
| 1.2.2 ACC氧化酶(ACO) |
| 1.2.3 SAM合成酶 |
| 1.2.4 SAM水解酶 |
| 2 乙烯的信号转导 |
| 2.1 乙烯受体与乙烯的感受 |
| 2.2 乙烯的胞质内信号转导 |
| 2.3 乙烯的核内信号转导 |
| 2.4 乙烯信号感受与转导模型 |
| 3 乙烯受体基因转基因植物的应用 |
| 4 草莓与乙烯 |
| 4.1 乙烯与草莓成熟 |
| 4.2 草莓的乙烯受体 |
| 5 草莓转基因研究进展 |
| 5.1 草莓抗病虫害转基因研究 |
| 5.2 草莓抗逆性转基因研究 |
| 5.3 草莓抗除草剂转基因研究 |
| 5.4 改善草莓品质转基因研究 |
| 5.5 草莓耐贮运转基因研究 |
| 5.6 草莓转基因中存在的问题和建议 |
| 6 反义RNA |
| 6.1 反义RNA的作用机理 |
| 6.2 反义RNA技术 |
| 6.3 反义RNA在果实成熟调控中的应用 |
| 6.3.1 多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因工程研究进展 |
| 6.3.2 果胶酯酶(PE)反义基因工程研究进展 |
| 6.3.3 ACC合成酶反义基因的应用 |
| 6.3.4 乙烯形成酶反义基因的应用 |
| 6.3.5 乙烯受体反义基因的应用 |
| 7 本项目的研究内容 |
| 8 本项目研究的意义 |
| 第一章 草莓乙烯受体FaEtr1,FaErs1和FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.1.3 酶与化学试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 目的片段的克隆 |
| 1.2.1.1 草莓总RNA的提取 |
| 1.2.1.2 第一链cDNA的合成 |
| 1.2.1.3 引物设计 |
| 1.2.1.4 PCR产物的回收 |
| 1.2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 1.2.1.6 目的片段T载体的连接,转化及鉴定 |
| 1.2.1.7 大肠杆菌质粒的提取 |
| 1.2.2 植物表达载体构建和鉴定 |
| 1.2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备,转化及质粒提取 |
| 1.2.2.2 质粒的限制性酶切反应 |
| 1.2.2.3 反义乙烯受体FaEtr1,FaErs1和FaEtr2表达载体的构建 |
| 1.2.2.4 含反义乙烯受体FaEtr1和FaErs1双价表达载体的构建 |
| 1.2.2.5 表达载体的鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 草莓RNA的提取 |
| 2.2 草莓FaEtr1,FaErs1和FaEtr2基因克隆 |
| 2.3 植物反义表达载体的构建及重组子的鉴定 |
| 2.4 外源基因整合检测 |
| 3 讨论 |
| 第二章 草莓高频离体再生体系的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试试材 |
| 1.2 培养基与植物生长调节剂 |
| 1.2.1 不定芽诱导 |
| 1.2.2 不定芽伸长 |
| 1.2.3 不定芽生根 |
| 1.3 其他因素设计 |
| 1.4 培养条件 |
| 1.5 数据调查 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 叶盘再生芽的生长动态 |
| 2.2 外植体和外植体培养方式对不定芽诱导的影响 |
| 2.3 叶龄对叶片不定芽诱导率的影响 |
| 2.4 基因型对叶片不定芽诱导率的影响 |
| 2.5 暗培养对叶片不定芽诱导率的影响 |
| 2.6 不同植物生长调节剂配比对不定芽分化的影响 |
| 2.7 不同植物生长调节剂配比对不定芽伸长的影响 |
| 2.8 不同植物生长调节剂配比对不定芽生根的影响 |
| 2.9 试管苗的移植 |
| 3 讨论 |
| 第三章 根癌农杆菌介导草莓遗传转化研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 转化受体材料 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基及培养条件 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 抗生素敏感性试验 |
| 1.4.2 试管苗叶片状态试验 |
| 1.4.3 工程菌液的制备 |
| 1.4.4 预培养时间、侵染时间、共培养时间和菌液浓度的优化 |
| 1.4.5 遗传转化 |
| 1.4.6 gus瞬时表达检测 |
| 1.5 PCR检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 抗生素敏感性试验 |
| 2.2 试管苗叶片状态试验 |
| 2.3 预培养时间对转化的影响 |
| 2.4 菌液浓度对转化的影响 |
| 2.5 侵染时间对转化的影响 |
| 2.6 共培养时间对转化的影响 |
| 2.7 转化植株再生与分子检测 |
| 3 讨论 |
| 第四章 反义乙烯受体基因转化材料的获得及检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 转化材料及培养条件 |
| 1.2 农杆菌对草莓叶盘的转化和再生 |
| 1.3 草莓DNA的提取及酶切 |
| 1.3.1 方法一:CTAB法提取草莓DNA |
| 1.3.1.1 试剂 |
| 1.3.1.2 方法 |
| 1.3.2 方法二:试剂盒提取 |
| 1.3.3 DNA的酶解检测 |
| 1.4 转基因植株的PCR检测 |
| 1.5 转基因植株的SOUTHERN印迹杂交检测 |
| 1.5.1 杂交相关溶液 |
| 1.5.2 样品制备 |
| 1.5.3 Southern转膜 |
| 1.5.4 探针标记 |
| 1.5.5 探针效率检测 |
| 1.5.6 预杂交 |
| 1.5.7 杂交 |
| 1.5.8 杂交后洗膜 |
| 1.5.9 显色反应 |
| 1.6 转基因植株的NORTHERN印迹杂交检测 |
| 1.6.1 杂交相关试剂及其配制 |
| 1.6.2 RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.6.3 印迹 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 草莓DNA的提取及酶切 |
| 2.2 转化及抗性苗的获得 |
| 2.3 转基因植株的PCR检测 |
| 2.4 转基因植株的SOUTHERN杂交检测 |
| 2.5 转基因植株的NORTHERN印迹杂交检测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 转反义乙烯受体基因草莓乙烯合成特性相关研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 乙烯测定方法 |
| 1.2 叶片脱落试验 |
| 1.2.1 乙烯处理方法 |
| 1.2.2 1-MCP处理方法 |
| 1.3 呼吸强度测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乙烯释放量的变化 |
| 2.2 叶片脱落试验 |
| 2.3 呼吸强度的变化 |
| 3 讨论 |
| 总结及后续研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 读博期间发表的相关文章 |
（5）乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和番茄中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中文文摘 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 转基因植物疫苗 |
| 1.1.1 利用转基因植物生产疫苗的可行性 |
| 1.1.2 转基因植物疫苗的研究进展 |
| 1.1.3 转基因植物疫苗的优势及前景 |
| 1.2 乙肝病毒表面抗原基因植物疫苗研究 |
| 1.2.1 HBV病毒的分子结构 |
| 1.2.2 HBSAg基因的结构 |
| 1.2.3 转乙肝表面抗原基因植物疫苗的研究及进展 |
| 1.2.4 转乙肝表面抗原基因植物疫苗的问题及对策 |
| 1.3 转基因番茄研究进展 |
| 1.3.1 转基因抗病毒番茄研究 |
| 1.3.2 转基因抗菌番茄研究 |
| 1.3.3 转基因疫苗番茄研究 |
| 1.3.4 转基因延熟番茄研究 |
| 1.3.5 转基因抗虫番茄研究 |
| 1.3.6 改善番茄品质研究 |
| 1.3.7 转基因抗逆性番茄研究 |
| 1.3.8 转基因抗除草剂番茄研究 |
| 1.3.9 转基因雄性不育番茄研究 |
| 1.4 研究意义与内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第2章 植物表达载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要工具酶和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 质粒提取液 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 质粒DNA的制备 |
| 2.2.2 酶切 |
| 2.2.3 片段的回收 |
| 2.2.4 DNA片段的连接 |
| 2.2.5 转化及重组子的筛选与鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 植物表达载体的构建 |
| 2.3.2 植物表达载体的酶切鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 植物表达载体的构建 |
| 2.4.2 载体构建中筛选抗性基因Hpt的应用 |
| 2.4.3 载体构建中植物表达启动子的选择 |
| 第3章 乙肝病毒表面抗原基因对烟草的转化及其表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 烟草组织培养及转化培养基 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 三亲交配法转化农杆菌 |
| 3.2.2 无菌烟草苗的获得 |
| 3.2.3 农杆菌介导转化烟草 |
| 3.2.4 转基因烟草的GUS组织化学染色 |
| 3.2.5 转基因烟草的分子生物学检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 目的基因质粒导入农杆菌LBA4404 |
| 3.3.2 农杆菌介导的烟草转化的筛选培养 |
| 3.3.3 转基因烟草的继代培养与生根培养 |
| 3.3.4 转基因植株的GUS组织化学染色 |
| 3.3.5 PCR鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 乙肝病毒表面抗原基因对番茄的转化及其表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 植物材料 |
| 4.1.3 主要药品和试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 番茄组织培养及转化培养基 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 冻融法转化农杆菌 |
| 4.2.2 番茄无菌苗的获得 |
| 4.2.3 番茄组织培养再生体系 |
| 4.2.4 番茄转化体系 |
| 4.2.5 转基因番茄的GUS组织染色检测 |
| 4.2.6 转基因番茄的PCR扩增检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 番茄再生系统的建立 |
| 4.3.2 影响番茄转化的因素 |
| 4.3.3 转基因番茄抗性植株的获得 |
| 4.3.4 转基因番茄的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 转化中番茄受体材料的选择 |
| 4.4.2 转化中菌株的选择 |
| 4.4.3 转化中菌株浓度及侵染时间的选择 |
| 4.4.4 乙酰丁香酮(AS)在转化中的应用 |
| 4.4.5 番茄转化中抗生素的选择 |
| 4.4.6 番茄的生根培养 |
| 4.4.7 转化中番茄的褐化和玻璃化问题 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）茶树ACS、ACO基因克隆与亲环素基因的鉴定及其表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 文献综述及研究思路 |
| 1.1 植物ACS与ACO基因研究概况 |
| 1.1.1 ACS和ACO基因克隆 |
| 1.1.2 ACS和ACO启动子研究 |
| 1.1.3 ACS和ACO基因表达研究 |
| 1.1.4 ACS和ACO转基因研究 |
| 1.2 亲环素基因研究概况 |
| 1.3 茶树中这三个基因相关研究 |
| 1.4 植物基因克隆的常用方法 |
| 1.4.1 简并PCR技术 |
| 1.4.2 RACE技术 |
| 1.4.3 表达序列标签法 |
| 1.5 基因表达的分析方法 |
| 1.6 本论文的研究目的及意义 |
| 第二章 茶树ACS基因的克隆及RT-PCR分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 常用溶液 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 ACS基因中间序列的获得 |
| 2.2.3 ACS基因3’端序列的获得 |
| 2.2.4 ACS基因5’端序列的获得 |
| 2.2.5 不同茶树品种、龙井43冬季不同时间ACS基因的RT-PCR分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RNA提取 |
| 2.3.2 ACS基因中间序列的扩增 |
| 2.3.3 ACS基因3’端序列的扩增 |
| 2.3.4 ACS基因5’端序列的扩增 |
| 2.3.5 三段序列的拼接 |
| 2.3.6 茶树ACO基因所编码的氨基酸与同源序列的联配 |
| 2.3.7 进化树构建 |
| 2.3.8 ACS基因不同品种间的相对表达含量分析 |
| 2.3.9 不同时期龙井43中ACS基因的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 茶树ACO基因的克隆与RT-PCR分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 ACO基因克隆 |
| 3.2.2 不同茶树品种、龙井43冬季不同时间ACO基因的RT-PCR分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3 1 ACO基因部分EST片段序列的获得 |
| 3.3.2 ACO基因中间序列的获得 |
| 3.3.3 ACO基因全长序列的获得 |
| 3.3.5 进化树构建 |
| 3.3.6 ACO基因不同品种间的相对表达含量分析 |
| 3.3.7 不同时期龙井43中ACO基因的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 茶树新稍EST测序及Cyclophilin基因的鉴定 |
| 4.2.2 亲环素基因的序列分析、多序列联配及进化树构建 |
| 4.2.3 亲环素基因的原核表达 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 亲环素基因克隆的鉴定 |
| 4.3.2 亲环素蛋白的多序列联配 |
| 4.3.3 亲环素基因进化分析 |
| 4.3.4 亲环素基因的克隆与酶切鉴定 |
| 4.3.5 亲环素基因表达载体的构建 |
| 4.3.6 亲环素基因诱导表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论与展望 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）反义CCoAOMT基因转化苎麻和烟草的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 木质素生物合成及其基因工程研究进展 |
| 1.2 反义RNA技术 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 1.4 本研究的技术路线 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 农杆菌工程菌株的鉴定 |
| 3.2 转基因烟草的获得 |
| 3.3 转基因烟草的检测 |
| 3.4 苎麻遗传转化体系的优化 |
| 3.5 转基因苎麻的获得 |
| 3.6 转基因苎麻的分子检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于苎麻的遗传转化 |
| 4.2 关于反义RNA抑制基因表达 |
| 4.3 木质素与纤维素合成的相互补偿关系 |
| 4.4 适当降低CCoAOMT的表达活性对植物正常生长的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 缩写词 |
| 致谢 |
（8）转基因技术在番茄遗传改良中的应用（论文提纲范文）
| 1 转基因抗病虫番茄的研究 |
| 1.1 转基因抗病毒番茄的研究 |
| 1.2 转基因抗细菌、真菌番茄的研究 |
| 1.3 转基因抗虫番茄的研究 |
| 2 转基因抗逆番茄的研究 |
| 2.1 转基因抗冻番茄的研究 |
| 2.2转基因耐盐番茄的研究 |
| 3 转基因抗除草剂番茄的研究 |
| 4 转基因延熟番茄的研究 |
| 4.1 抑制番茄细胞壁降解的研究 |
| 4.2 抑制番茄乙烯合成的研究 |
| 5 转基因改进番茄品质的研究 |
| 5.1 提高番茄甜度的研究 |
| 5.2 提高番茄类胡萝卜素含量的研究 |
| 5.3 提高番茄固形物含量的研究 |
| 6 转基因生物反应器番茄的研究 |
| 7 其他方面的研究 |
| 8 转基因番茄研究的前景展望 |
（9）Patatin、Wun1启动子驱动下的PPO反义基因植物表达载体构建及马铃薯、烟草的遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词表 |
| Ⅰ引言 |
| Ⅱ文献综述 |
| 1 马铃薯生产现状 |
| 2 马铃薯酶促褐变机理及控制途径 |
| 2.1 马铃薯酶促褐变机理 |
| 2.2 马铃薯酶促褐变的理论控制方法 |
| 2.2.1 抑制PPO 活性 |
| 2.2.1.1 调节反应液PH 值 |
| 2.2.1.2 热烫 |
| 2.2.1.3 亚硫酸盐处理 |
| 2.2.1.4 抗坏血酸（AA）处理 |
| 2.2.1.5 辅基络合物处理 |
| 2.2.2 添加PPO 酶底物类似物 |
| 2.2.3 驱逐氧气 |
| 2.3 马铃薯酶促褐变的控制途径 |
| 2.3.1 品种选择 |
| 2.3.2 栽培方法 |
| 2.3.3 合理的采后处理 |
| 2.3.4 加工时采用物理和化学方法抑制PPO 活性 |
| 2.4 控制新途径 |
| 2.4.1 基因工程 |
| 2.4.2 4-己基间苯二酚 |
| 2.4.3 曲酸(KOJICACID) |
| 2.4.4 蜂蜜处理 |
| 2.4.5 稳定的AA 衍生物 |
| 3 多酚氧化酶研究进展 |
| 3.1 多酚氧化酶的定位 |
| 3.2 多酚氧化酶的生理功能 |
| 3.3 多酚氧化酶的酶学特征 |
| 3.4 多酚氧化酶的研究和实际应用 |
| 4 反义RNA 技术 |
| 4.1 反义RNA 的作用原理 |
| 4.2 反义RNA 在植物基因工程中的应用 |
| 4.2.1 果实熟性的抑制 |
| 4.2.2 植物抗病性研究 |
| 4.2.2.1 反义RNA 干扰植物RNA 病毒 |
| 4.2.2.2 反义RNA 干扰植物DNA 病毒 |
| 4.2.3 观赏植物基因工程的应用 |
| 4.2.4 植物淀粉合成的控制 |
| 4.2.5 油料植物种子中脂肪酸合成的控制 |
| 4.2.6 植物雄性不育性的控制 |
| 5 抑制马铃薯块茎损伤褐化的基因工程 |
| 6 植物遗传转化研究进展 |
| 6.1 载体系统转化方法 |
| 6.1.1 根癌农杆菌TI 质粒介导基因转化法 |
| 6.1.1.1 整体植株接种共感染法 |
| 6.1.1.2 叶盘转化法 |
| 6.1.1.3 原生质体共培养转化法 |
| 6.1.2 植物病毒载体介导基因转化法 |
| 6.2 直接转化法 |
| 6.2.1 物理法诱导DNA 直接转化 |
| 6.2.1.1 基因枪法介导基因转化 |
| 6.2.1.2 激光微束介导基因转化 |
| 6.2.1.3 显微注射介导基因转化 |
| 6.2.1.4 超声波介导基因转化 |
| 6.2.1.5 电激法介导基因转化 |
| 6.2.2 化学诱导DNA 直接转化 |
| 6.2.2.1 PEG 介导基因转化 |
| 6.2.2 2 脂质体介导基因转化 |
| 6.3 种质系统介导基因转化 |
| 6.3.1 花粉管通道法介导基因转化 |
| 6.3.2 生殖细胞浸泡法介导基因转化 |
| 6.3.3 胚囊、子房注射法介导基因转化 |
| 7 本研究的目的意义 |
| 8 PATATIN、WUN1 启动子驱动的 PPO 反义基因表达载体构建及其遗传转化研究的技术路线 |
| Ⅲ实验部分 |
| 1 PATATIN、WUN1 启动子驱动的 PPO 反义基因植物表达载体的构建 |
| 1.1 马铃薯块茎特异蛋白 PATATIN 和损伤诱导 WUN1 启动子的亚克隆 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.1.2 工具酶和试剂 |
| 1.1.1.3 引物设计 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.2.1 大肠杆菌质粒 DNA 的微量提取 |
| 1.1.2.2 目的基因的 PCR 扩增 |
| 1.1.2.3 目的 DNA 片断的回收 |
| 1.1.2.4 PATATIN/WUN1 启动子与 PMD18-T VECTOR 连接 |
| 1.1.2.5 感受态 E.COLI DH5Α的制备 |
| 1.1.2.6 重组体向宿主细胞的导入 |
| 1.1.2.7 重组体的筛选与鉴定 |
| 1.1.3 实验结果及分析 |
| 1.1.3.1 重组子滞后质粒筛选 |
| 1.1.3.2 滞后质粒 PCR 鉴定 |
| 1.1.3.3 滞后质粒酶切鉴定 |
| 1.2 PATATIN、WUN1 启动子驱动的 PPO 反义基因植物表达载体的构建 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.1.1 菌株和质粒 |
| 1.2.1.2 工具酶和试剂 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.2.1 PMD-P、PMD-W 和PC3-ASPPOTY 反义表达载体的酶切及目的片段回收. |
| 1.2.2.2 PATATIN/WUN1 启动子与 PC3-ASPPOTY 反义表达载体连接 |
| 1.2.2.3 连接产物转化感受态 E.COLI DH5Α |
| 1.2.2.4 表达载体的 PCR 及酶切鉴定 |
| 1.2.3 实验结果及分析 |
| 1.2.3.1 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.2.3.2 重组质粒的 PCR 鉴定 |
| 1.3 PATATIN、WUN1 启动子驱动的反义 PPO 表达载体转化农杆菌 |
| 1.3.1 表达载体质粒 DNA 导入农杆菌 |
| 1.3.1.1 根癌农杆菌感受态细胞制备 |
| 1.3.1.2 转化 |
| 1.3.2 农杆菌整合外源基因的鉴定 |
| 1.3.2.1 农杆菌 TI 质粒 DNA 提取 |
| 1.3.2.2 农杆菌 TI 质粒的 PCR 鉴定 |
| 1.3.2 实验结果及分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 启动子的选择 |
| 1.4.2 酶切位点 |
| 1.4.3 实验中应注意的事项 |
| 1.4.4 二次连接 |
| 2 CAMV355、PATATIN 及 WUN1 启动子驱动的反义 PPO 表达载体对烟草和马铃薯的遗传转化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 植物生长激素及其他试剂 |
| 2.1.4 PCR 引物的设计与合成 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 转化受体材料的制备 |
| 2.2.2 农杆菌的培养和菌液制备 |
| 2.2.2.1 菌株培养 |
| 2.2.2.2 菌液制备 |
| 2.2.3 烟草及马铃薯转化系统的研究 |
| 2.2.3.1 植物培养基的选择 |
| 2.2.3.2 菌液侵染浓度的确定 |
| 2.2.3.3 菌液侵染时间的确定 |
| 2.2.3.4 外植体预培养时间的确定 |
| 2.2.3.5 外植体共培养时间的确定 |
| 2.2.3.6 头孢霉素（CEF）浓度的确定 |
| 2.2.3.7 受体材料的 KAN 敏感性实验 |
| 2.2.4 外植体的继代培养 |
| 2.2.5 转化植株的生根和继代培养 |
| 2.2.6 转化植株的 PCR 鉴定 |
| 2.2.6.1 转化植株 DNA 提取方法 |
| 2.2.6.2 转化植株的 PCR |
| 2.3 实验结果及分析 |
| 2.3.1 烟草及马铃薯转化系统的优化 |
| 2.3.1.1 植物培养基的选择 |
| 2.3.1.2 农杆菌工程菌液侵染外植体浓度对抗性愈伤组织的影响 |
| 2.3.1.3 农杆菌工程菌液侵染外植体时间对抗性愈伤组织的影响 |
| 2.3.1.4 外植体预培养时间对抗性愈伤组织的影响 |
| 2.3.1.5 外植体共培养时间对抗性愈伤组织的影响 |
| 2.3.1.6 头孢霉素（CEF）浓度对抗性愈伤组织的影响 |
| 2.3.1.7 受体材料的卡那霉素（KAN）敏感性实验 |
| 2.3.2 转化植株的 PCR 鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 选择压的确定 |
| 2.4.2 农杆菌预处理对转化的影响 |
| 2.4.3 根癌农杆菌介导的遗传转化 |
| 3 转基因植株 PPO 生理活性检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 PPO 活性的测定 |
| 3.1.2.1 粗酶液的提取 |
| 3.1.2.2 比色液的制备 |
| 3.1.2.3 比色 |
| 3.1.3 褐变强度（BD 值）的测定 |
| 3.1.3.1 粗酶液的提取 |
| 3.1.3.2 比色液的制备 |
| 3.1.3.3 比色 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 烟草转基因品系 PPO 活性变化 |
| 3.2.2 烟草转基因品系褐变强度变化 |
| 3.2.3 转基因品系 PPO 活性变化与褐变强度的关系 |
| 3.3 讨论 |
| Ⅳ结论 |
| Ⅴ附图 |
| Ⅵ附图说明 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（10）纳豆激酶植物表达载体的构建及番茄遗传转化体系的建立（论文提纲范文）
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物基因工程研究进展 |
| 1.1.1 目的基因的分离与鉴定 |
| 1.1.2 基因的修饰及植物表达载体的构建 |
| 1.1.3 植物遗传转化研究 |
| 1.1.4 转化体的筛选和鉴定 |
| 1.1.5 外源基因的整合、表达和遗传 |
| 1.1.6 植物基因工程的安全性评价 |
| 1.1.7 植物基因工程存在的问题及对策 |
| 1.2 转基因番茄研究进展 |
| 1.2.1 转基因延熟番茄的研究 |
| 1.2.2 转基因抗病番茄的研究 |
| 1.2.3 番茄抗虫基因工程 |
| 1.2.4 番茄抗除草剂基因工程 |
| 1.2.5 番茄抗逆基因工程 |
| 1.2.6 番茄品质改良的研究 |
| 1.2.7 延缓番茄叶衰老的转基因研究 |
| 1.2.8 番茄雄性不育基因工程 |
| 1.2.9 利用番茄作为生物反应器 |
| 1.2.10 番茄基因工程展望 |
| 1.3 纳豆激酶研究进展 |
| 1.3.1 纳豆 |
| 1.3.2 纳豆激酶 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章NK基因表达载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.1.2 PCR引物 |
| 2.1.1.3 工具酶和试剂 |
| 2.1.1.4 DNAMarker |
| 2.1.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.1.6 培养菌常用培养基 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 载体构建路线 |
| 2.1.2.2 质粒提取(北京天为时代质粒小量提取试剂盒) |
| 2.1.2.3 NK基因的克隆 |
| 2.1.2.4 DNA片段回收(北京天为时代胶回收试剂盒) |
| 2.1.2.5 PCR扩增的NK基因与T-载体的连接及转化 |
| 2.1.2.6 T4DNA酶连接DNA片段和载体DNA |
| 2.1.2.7 去磷酸化作用 |
| 2.1.2.8 感受态细胞制备及转化 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 带有BamHI位点的NK基因的扩增与克隆 |
| 2.2.1.1 NK基因的扩增 |
| 2.2.1.2 T-NK载体的构建和鉴定 |
| 2.2.1.3 纳豆激酶基因序列测定和分析 |
| 2.2.2 pCAMBIA-nk(农杆菌表达载体)的构建 |
| 2.2.2.1 pBPC1300中间质粒的构建 |
| 2.2.2.2 pubiCAMBIA中间质粒的构建和鉴定 |
| 2.2.2.3 pCAMBIA-nk表达载体的构建和鉴定 |
| 2.2.3.4 农杆菌的转化检测 |
| 2.3 讨论与结论 |
| 2.3.1 带有特异BamHI酶切位点目的基因NK的获得 |
| 2.3.2 NK基因的测序结果 |
| 2.3.3 构建表达载体时影响限制性内切酶酶切效果的因素 |
| 2.3.4 构建表达载体所需的pCAMBIA载体的选择 |
| 2.3.5 关于直接法转化农杆菌 |
| 2.3.6 转化农杆菌的鉴定方法 |
| 第三章 番茄遗传转化体系的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 番茄材料 |
| 3.1.1.2 菌株和质粒 |
| 3.1.1.3 实验仪器 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 番茄无菌苗的培养 |
| 3.1.2.2 番茄受体材料的准备 |
| 3.1.2.3 根癌农杆菌介导法转化番茄 |
| 3.1.2.4 转基因番茄的分子检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同番茄材料在MS基本培养基上的出芽率 |
| 3.2.2 不同材料愈伤组织的诱导 |
| 3.2.3 不同激素浓度对番茄外殖体诱芽分化的影响 |
| 3.2.4 愈伤组织对潮霉素耐受性的检测及筛选浓度的确立 |
| 3.2.5 农杆菌介导法转化番茄 |
| 3.2.5.1 抗性番茄愈伤组织和再生植株的获得 |
| 3.2.5.2 农杆菌法转化番茄的结果 |
| 3.2.6 再生植株PCR分子检测 |
| 3.3 讨论与结论 |
| 3.3.1 培养基对番茄愈伤组织的影响 |
| 3.3.2 提高分化率的措施 |
| 3.3.3 生根壮苗和移栽 |
| 3.3.4 PCR分子检测 |
| 第四章 结论和展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、番茄ACC合成酶基因的反义RNA-核酶嵌合基因植物表达载体的构建及对番茄的转化（论文参考文献）
- [1]桃成熟过程中的活性物质变化及PG、ACO基因的克隆表达与遗传转化[D]. 张伟. 甘肃农业大学, 2013(05)
- [2]改良品质的转基因番茄研制现状[J]. 李文桂,陈雅棠. 热带医学杂志, 2011(03)
- [3]反义技术及其在植物基因工程中的应用[J]. 关淑艳,王丕武,刘广娜,刘慧婧,赵丽娜,郭树成. 安徽农业科学, 2009(26)
- [4]草莓乙烯受体反义基因遗传转化的研究[D]. 朱海生. 福建农林大学, 2008(11)
- [5]乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和番茄中的表达[D]. 李田. 福建师范大学, 2008(01)
- [6]茶树ACS、ACO基因克隆与亲环素基因的鉴定及其表达分析[D]. 张亚丽. 中国农业科学院, 2007(05)
- [7]反义CCoAOMT基因转化苎麻和烟草的研究[D]. 黄春琼. 华南热带农业大学, 2007(03)
- [8]转基因技术在番茄遗传改良中的应用[J]. 李峰,曹刚强,梁会娟. 长江蔬菜, 2007(01)
- [9]Patatin、Wun1启动子驱动下的PPO反义基因植物表达载体构建及马铃薯、烟草的遗传转化研究[D]. 陈春艳. 甘肃农业大学, 2006(04)
- [10]纳豆激酶植物表达载体的构建及番茄遗传转化体系的建立[D]. 张锋. 西北农林科技大学, 2005(02)