一、A Suppressed Gene in Integument Cells of a Fiberless Seed Mutant in Upland Cotton（论文文献综述）
杨江涛[1]（2019）在《棉纤维发育相关基因的挖掘及优质转基因棉花的培育》文中研究表明棉花是我国重要的天然纤维作物和经济作物,其纤维品质的优劣直接决定着棉纺织品质量的好坏。纤维品质单一是制约棉花产业发展的主要因素之一,培育纤维品质优良的新品种已成为棉花育种的主要目标。当前,研究学者们已经克隆了多个纤维发育相关基因,并获得了一些转基因棉花,但仍然缺乏真正具有应用前景的基因和品种。挖掘棉纤维发育相关基因,探究其生物学功能,不仅有助于更好地研究棉花纤维的伸长发育机制,而且将为培育优良纤维品质的棉花新品种提供一定的理论基础。鉴于此,本研究开展了棉纤维发育相关基因的筛选及功能分析和优质纤维转基因棉花的培育两方面工作,以期为棉花纤维品质改良基因工程提供新的基因资源,同时培育出纤维品质改良的转基因棉花新种质。本研究获得的主要结果如下:1.本研究构建了陆地棉不同组织（根、叶、花药、柱头）和纤维不同发育时期（7 DPA、14 DPA、26 DPA）的转录组数据库。构建的7个转录组数据库大小为4.43 Gb5.20 Gb,是陆地棉基因组大小（2.5 Gb）的2倍左右,83.32%88.22%的Clean Reads可比对到陆地棉TM-1参考基因组上。对纤维组织与非纤维组织（根、叶、花药和柱头）的转录组文库进行基因差异表达分析,获得了在7 DPA、14 DPA、26 DPA中表达显着上调的基因数目分别为1,205、1,135和937个,对其进行了GO富集分析和KEGG代谢途径分析,发现这些基因主要参与了催化活性、碳水化合物代谢、细胞膜和细胞器、信号传导等功能和代谢途径。从纤维显着上调基因中随机挑选了36个基因,利用qRT-PCR技术进行表达模式分析,结果表明这些基因均为纤维特异或优势表达基因。2.在研究棉纤维优势表达基因Ghrack1时,首次发现棉花基因组中双向基因对（Ghrack1和Ghuhrf1）的存在。qRT-PCR结果表明这对双向基因具有相似的表达模式,均在纤维细胞分化起始初期优势表达。序列分析发现,双向基因Ghrack1和Ghuhrf1的间序列（GhRU）为1,073 bp,具有较高的GC含量（38.7%）,符合双向启动子的序列特征。以gus和gfp为报告基因,构建了一系列植物表达载体,通过蘸花法转化拟南芥,在拟南芥中初步证明GhRU为双向启动子,能同时启动gus和gfp在生长旺盛的分生组织表达,推测其可能为纤维优势表达的双向启动子。3.本研究对陆地棉基因组中的双向基因对及其双向启动子进行了系统性分析。通过对陆地棉基因组中的双向基因对进行搜寻,获得了1,383对双向基因,与棉花不同组织的转录组数据相结合,共筛选到1,986条双向基因具有组织表达信息,其中有236对双向基因在棉纤维中优势表达,随机克隆了30个双向基因的基因间序列,并在其两端分别连接gus和gfp报告基因构建植物表达载体。烟草瞬时表达发现有25个双向基因间序列表现出双向启动子活性。进一步分析海岛棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉基因组中的双向基因对的存在情况,分别发现了1,091、940和1,249对双向基因对。对这些双向基因对进行了功能富集分析和同源性比对分析,结果表明棉花不同亚种中的双向基因在功能和序列结构上均存在一定的保守性。4.本研究从上述36个棉纤维特异或优势表达基因中,选取了两个纤维优势表达基因CotAD24232（GhXET）和CotAD22544（GhKTN）作为重点研究对象。构建以纤维特异启动子E6驱动基因表达的植物表达载体,利用农杆菌介导法转化棉花,分别获得了16株和10株转GhXET和GhKTN基因棉花阳性植株。利用微滴数字PCR技术和Southern blot技术检测转基因棉花植株中目标基因的拷贝数,分别筛选到12株和8株单拷贝基因插入的转GhXET和GhKTN基因棉花植株。qRT-PCR实验结果表明这两个基因在转基因棉花的7 DPA、14 DPA和26 DPA纤维中的表达水平相比于受体植株均有显着提高。转GhXET和GhKTN基因棉花植株的成熟纤维长度与受体植株相比均显着增长,分别增长了4.7 mm和2.5 mm。利用接头连接法和巢式PCR方法获得了转GhXET和GhKTN基因棉花中外源基因在棉花基因组插入位点处的侧翼序列。依据获得的侧翼序列,建立了单一位点插入转化事件的特异性检测方法和纯合体检测方法,其中特异性PCR检测方法的灵敏度达到44个拷贝数,为后期转基因棉花的安全评价提供了科学数据和技术支撑。
曾健晏[2]（2019）在《细胞分裂素通过干扰胚珠表皮GhPIN3a介导的生长素不对称积累抑制棉花纤维起始》文中指出棉花是世界上最重要的天然纤维作物,其纤维是纺织工业主要原材料。我国是世界上最大的纺织品生产国和出口国,棉花生产在我国国民经济中占有十分重要的地位。棉花纤维从胚珠表皮分化发育而来,具有极度伸长的单细胞结构。这一特点使棉花纤维成为研究植物细胞分化和极性生长的理想材料。纤维细胞起始是棉花纤维发育的第一阶段,这一过程决定了纤维细胞的数量,进而影响纤维产量和品质。多种植物激素,如生长素（Auxin）、细胞分裂素（cytokinins,CKs）、赤霉素（gibberellins,GAs）、油菜素类固醇（brassinosteroids,BRs）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）等参与调控棉花纤维的起始。吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）是最主要的天然活性生长素。本实验室前期研究发现,生长素在棉花开花当天起始的纤维细胞中特异积累,通过时空精确调控IAA的生物合成,促进纤维细胞的起始,可同步提高棉花的产量和品质。但是,生长素在棉花胚珠表皮纤维与非纤维细胞间不对称分布的形成机制尚不清楚。细胞分裂素与生长素的互作参与调控了诸多植物生长发育的进程。但是细胞分裂素与生长素的互作在棉花纤维中的作用仍有待研究。针对上述问题,本文分析了纤维发育过程中细胞分裂素与生长素的动态变化,通过胚珠培养结合转基因技术研究了细胞分裂素、生长素和它们二者的拮抗对纤维发育的影响。同时研究了胚珠表皮细胞中生长素的来源和生长素外运载体在棉花胚珠中的表达模式。结果发现,生长素外运载体介导的生长素极性运输（polar auxin transport,PAT）调控了棉花胚珠表皮生长素的积累。生长素外运蛋白GhPIN3a是棉花纤维起始过程中生长素的重要运输载体,它极性定位于非纤维细胞的质膜上,而在纤维细胞的质膜上没有定位。GhPIN3a在非纤维与纤维细胞间的不同蛋白定位导致生长素在纤维细胞中的积累。另外,过量细胞分裂素能够破坏GhPIN3a在非纤维细胞中的极性定位,干扰棉花胚珠表皮生长素的极性运输和不对称分布的建立,从而抑制棉花纤维起始。论文的主要结果如下:1、细胞分裂素与生长素在棉花纤维起始过程中存在拮抗关系（1）利用LC-MS/MS分析了陆地棉（Gossypium hirsutum L.）栽培种“Jimian14”胚珠和纤维发育过程中细胞分裂素与IAA的动态变化。结果显示,细胞分裂素在开花后的棉花胚珠和纤维中呈现不断降低的趋势;IAA与细胞分裂素相反,呈现逐渐升高的趋势。（2）利用细胞分裂素诱导启动子proTCS和生长素诱导启动子proDR5控制GUS报告基因的转基因棉花,原位观察了细胞分裂素与生长素水平在胚珠和纤维中的动态变化。观察结果佐证了细胞分裂素与IAA在棉花胚珠和纤维发育过程中的相反变化趋势。（3）胚珠离体培养试验结果显示,生长素促进棉花纤维起始,而细胞分裂素抑制棉花纤维起始,并且都存在剂量效应。在棉花胚珠中干扰细胞分裂素氧化酶编码基因GhCKX3的表达,proPV:antisenseGhCKX3转基因棉花与野生型相比开花当天胚珠中细胞分裂素（ZT）含量明显增加,胚珠表面纤维起始密度显着降低,支持了离体培养时细胞分裂素抑制棉花纤维起始的结果。（4）用生长素诱导启动子和细胞分裂素诱导启动子分别控制细胞分裂素和生长素的生物合成（proDR5:IPT和proTCS:iaaM）,研究细胞分裂素与生长素在棉花纤维中的原位互作,结果表明生长素诱导产生的细胞分裂素可以削弱生长素对棉花纤维起始的促进作用;而细胞分裂素诱导产生的生长素可以缓解细胞分裂素对棉花纤维起始的抑制作用。上述结果表明,细胞分裂素与生长素在调控棉花纤维起始过程中存在拮抗关系。2、细胞分裂素干扰生长素在棉花胚珠表皮的积累并抑制纤维起始无纤维突变体xu142fl是研究棉花纤维细胞起始的良好材料。（1）激素检测结果表明,纤维起始时期无纤维突变体xu142fl胚珠中的生长素和细胞分裂素含量均明显高于野生型。（2）通过杂交将proDR5:GUS和proTCS:GUS报告系统分别导入无纤维突变体xu142fl,并在杂交F2代中分离出含有激素诱导报告系统的无纤维（proDR5:GUS xu142fl和proTCS:GUS xu142fl）和野生型（proDR5:GUS Xu142FL和proTCS:GUS Xu142FL）表型植株。开花当天胚珠的GUS染色结果显示,突变体胚珠外珠被和合点区域的细胞分裂素信号（用proTCS:GUS报告系统指示）明显强于野生型胚珠。对于生长素信号（用proDR5:GUS报告系统指示）,突变体胚珠表皮的信号缺失,但是在珠心的信号明显强于野生型胚珠。这些结果表明,胚珠表皮生长素的缺失而不是整个胚珠生长素含量的减少导致了xu142fl突变体的无纤维表型。无纤维突变体xu142fl胚珠外珠被中过量的细胞分裂素水平阻碍了胚珠表皮生长素的积累。（3）proDR5:GUS胚珠用ZT处理,其胚珠表皮proDR5:GUS表达和纤维生长的结果显示,生长素积累减少;同时纤维的起始被抑制。该结果表明过量的细胞分裂素能够干扰棉花胚珠表皮生长素的不对称积累,从而抑制纤维起始。3、生长素外运蛋白介导的生长素极性运输对棉花胚珠表皮中生长素的积累和纤维起始有至关重要的作用（1）生长素饥饿实验表明,从头合成的生长素不是供给棉花纤维起始的主要生长素来源。（2）在棉花开花前用1-N-氨甲酰苯甲酸萘酯（1-N-naphthylphthalamic,NPA）抑制花柄中生长素的运输,减少开花当天子房、珠心和胚珠表皮生长素的积累,抑制纤维起始。这表明供给棉花纤维起始的生长素主要通过花柄从外部组织运进子房。（3）离体实验显示,生长素外运抑制剂NPA和布雷菲德菌素A（brefeldin A,BFA）可明显抑制胚珠表皮生长素的积累和纤维起始;但生长素内运抑制剂萘氧基乙酸（1-naphthoxyacetic acid,1-NOA）对胚珠表皮生长素的积累和纤维起始无明显抑制作用。以上结果表明,生长素外运蛋白介导的生长素极性运输对棉花胚珠表皮中生长素的积累和纤维起始有至关重要的作用。4、GhPIN3a在非纤维与纤维细胞中的不同蛋白定位决定了棉花胚珠表皮生长素的不对称分布（1）mRNA原位杂交表明,在开花当天的胚珠外珠被中生长素外运蛋白基因GhPIN3a优势表达,可能参与纤维起始过程中胚珠表皮生长素的积累。（2）种皮特异性下调GhPIN3a的表达,严重甚至完全抑制proBAN:GhPIN3a-RNAi转基因棉花胚珠表皮纤维的起始,证明了纤维起始过程中GhPIN3a的关键作用。（3）GhPIN3a:YFP信号主要出现在非纤维细胞的质膜上,而在临近的纤维细胞的质膜上没有相应信号。该结果表明,生长素能够通过非纤维细胞在胚珠表皮运输;GhPIN3a在纤维细胞质膜上定位的缺失使进入纤维细胞中的生长素不能通过外运载体流出,从而导致生长素在其中不断积累。5、细胞分裂素通过干扰GhPIN3a的表达和蛋白定位拮抗生长素对纤维起始的促进作用（1）ZT处理胚珠中GhPIN3a的转录水平明显下降;同时,在细胞分裂素含量异常升高的无纤维突变体xu142fl外珠被中也检测到GhPIN3a转录水平下降的结果;此外,ZT处理proGhPIN3a:GUS转基因棉花开花当天的胚珠,其表皮的GUS信号也明显降低。这些结果表明,细胞分裂素可以抑制GhPIN3a转录。（2）ZT处理棉花开花当天的胚珠,其表皮细胞质膜上GhPIN3a的定位信号几乎消失。这表明,细胞分裂素不仅会抑制棉花胚珠中GhPIN3a的转录,还会破坏其编码蛋白在质膜上的定位,从而干扰生长素在棉花胚珠表皮的积累,抑制纤维起始。综上所述,本研究的结果表明,棉花纤维起始过程中GhPIN3a在非纤维与纤维细胞间的不同蛋白定位导致了生长素在胚珠表皮的不对称积累。过量的细胞分裂素能够通过干扰GhPIN3a的表达及其在细胞质膜上的定位破坏棉花胚珠表皮GhPIN3a介导的生长素极性运输,从而拮抗生长素对纤维起始的促进作用。GhPIN3a在棉花胚珠表皮细胞间的不同蛋白定位为进一步揭示生长素在单细胞中积累的潜在机制奠定了基础。
王怡[3]（2018）在《海岛棉GbTCP5和GbTCP10基因的克隆和功能分析》文中认为棉花是我国十分重要的农业经济作物之一,在全球经济中起着中流砥柱的作用。它不仅提供了世界上绝大部分的天然纤维,而且是一种重要的可再生资源。棉纤维是纺织工业的重要原料,但是我国纤维品质单一,且许多外界因素如低温、干旱、盐碱以及病虫害等,极大地抑制了棉花的生长发育,从而影响棉纤维的产量及品质,无法满足国内对优质棉纤维的需求。在纤维发育的不同时期,均有大量基因参与纤维细胞发育的调控,对纤维特异表达基因功能的研究,有助于揭示棉纤维发育的分子机制,为利用基因工程手段改良纤维品质提供候选的基因资源。TCP蛋白参与调控植物生长发育的进程,是植物所特有的一类转录因子,其编码蛋白包含一个保守的TCP结构域,含59个氨基酸（AA）残基的螺旋-环-螺旋（b HLH）,可以与DNA结合或者与蛋白质互作。在许多植物物种中TCP蛋白进化保守,并且参与植物从种子萌发到营养生长直至形成花和果实的过程。TCP转录因子是重要的生长调节物质,能够将多种内源性信号和环境信号转化为生长调节剂。本研究以海岛棉“新海21”5 DPA的棉纤维为材料,克隆获得了Gb TCP5和Gb TCP10基因的全长c DNA。利用荧光定量PCR方法分析了2个基因的表达模式。利用酵母系统分析了Gb TCP5和Gb TCP10的转录激活活性和结合特异性,并通过转化拟南芥进一步分析2个基因的生物学功能,主要研究结果如下:1.从海岛棉“新海21”5 DPA的棉纤维中克隆得到Gb TCP5基因,其开放阅读框（ORF）为945 bp,该基因编码314个氨基酸,蛋白分子质量34.95 k D,等电点为8.48,序列中含有1个高度保守的TCP结构域。荧光定量PCR分析表明,Gb TCP5基因在35 DPA棉纤维中表达量较高,暗示其可能参与棉花纤维的次生壁合成。在棉花不同组织中,Gb TCP5基因在花萼中表达量较高。转录激活实验表明Gb TCP5具有转录活性且转录激活区域在139-202aa之间。结合特异性实验发现Gb TCP5与TCP元件结合,且与TCP II元件结合特异性较高。Gh MYB（lrp）和Gh MYB（6286）与Gb TCP5启动子中的MBS元件均不结合。将Gb TCP5基因转化拟南芥,表型观察发现转Gb TCP5基因拟南芥株系相比野生型拟南芥根毛、叶片表皮毛和茎杆表皮毛显着增加。半定量RT-PCR结果表明转基因植株Gb TCP5-1相比野生型上调GL1,ETC2,ETC3基因的表达,下调GL2,GL3,TCL1基因的表达。Gb TCP5可以与拟南芥表皮毛相关基因CPC启动子中的TCP元件结合。利用人工mi RNA技术构建含有ami RTCP5前体的植物表达载体ami RTCP5-p CAMBIA3301,并转化棉花。2.从海岛棉“新海21”5 DPA的棉纤维中克隆得到Gb TCP10基因,其ORF为1386 bp,该基因编码461个氨基酸,蛋白分子量49.93 k D,等电点为6.74,序列中含有1个高度保守的TCP结构域。荧光定量PCR分析表明,Gb TCP10基因在5 DPA棉纤维中表达量较高,暗示其可能参与棉花纤维伸长期的发育。在棉花不同组织中,Gb TCP10基因在花中表达量最高。转录激活实验表明Gb TCP10不具有转录活性。结合特异性实验发现Gb TCP10与TCP元件结合。Gb TCP10上游启动子区域含有TCP元件,且Gb TCP10与TCP元件结合,暗示Gb TCP10转录因子可能调控自身的转录。Gh MYB（lrp）和Gh MYB（6286）与Gb TCP10启动子中的AC-I元件结合。将Gb TCP10基因转化拟南芥,表型观察发现Gb TCP10使拟南芥的根毛、叶片表皮毛和茎杆表皮毛显着增加。半定量RT-PCR结果表明转基因植株Gb TCP10-2相比野生型上调GL1,GL3,ETC1,ETC2,TCL1,TTG1基因的表达,下调GL2,CPC,TRY,ETC3基因的表达。Gb TCP10可以与拟南芥表皮毛相关基因CPC和TTG1启动子中的TCP元件结合。利用人工mi RNA技术构建含有ami RTCP10前体的植物表达载体ami RTCP10-p CAMBIA3301,并转化棉花。
秦爱[4]（2018）在《基于标记定量的陆地棉胚珠的磷酸化蛋白质组学研究》文中研究指明棉花不仅是世界上最主要的农作物之一,其纤维部分更是为纺织业提供了良好的材料基础。陆地棉（Gossypium hirsutum L）是世界上四大棉花栽培种中栽培最广的棉种,占世界棉纤维产量的90%以上。陆地棉有一个从自然界中筛选获得的无纤维突变体（fiberless lintless:fl）,其无纤维的表型可以稳定遗传,该突变体与野生型（Wild Type:WT）之间的差异探究一直是棉花研究者密切关注的问题。本文分别选取陆地棉野生型和突变体开花后的0天、3天和5天的胚珠材料作为研究对象,使用稳定同位素标记的双甲基化标记（stable isotope dimethyl labeling）技术对磷酸化蛋白质进行标记,同时应用TMT（tandem mass tags）标记的方法对全蛋白质进行标记,最后借助质谱鉴定和生物信息学分析等方法,帮助我们从蛋白质层面解析陆地棉野生型和突变体之间的差异。本文主要包括以下7个研究结果:（1）鉴定到大量非冗余的非磷酸化蛋白质（13394）、磷酸化蛋白质（4702）、磷酸化多肽（6814）和磷酸化修饰位点（9102）,并获得各个蛋白在野生型和突变体的不同胚珠样本中的相对定量值;（2）对获得的所有磷酸化位点进行特征分析;（3）通过磷酸化蛋白质的功能注释分析,筛选获得棉花特有的磷酸化蛋白质以及发生磷酸化的转录因子及激酶;（4）根据两次技术重复数据的t-test检验及差异倍数筛选,分别获得胚珠0天、3天和5天时野生型和突变体间差异表达的磷酸化蛋白质,并通过过表达分析挖掘出了存在富集的生物学过程;（5）从蛋白质水平验证了 BRs信号通路和RBR1参与的核内复制信号通路对棉纤维发育的重要性;（6）通过蛋白质定量数据的聚类分析以及与转录组定量数据的联合分析对数据进行分类整理;（7）结合差异表达倍数、蛋白质功能注释和序列解析等方面的综合分析以获得可深入研究的候选蛋白,如:EPS15、RBR1。
梅玉芹[5]（2018）在《陆地棉DAD基因启动子序列变异对其驯化的影响》文中指出细胞凋亡（Apoptosis,APO）是生物体在生长发育的过程中或外界刺激的影响下,通过启动自身的机制来调节细胞死亡的现象,在多细胞生物中普遍存在。抗细胞凋亡基因（Defender against Apoptotic Death,DAD）是广泛存在于动物和植物中的一个高度保守的抑制细胞凋亡的基因。目前有关DAD基因的研究主要集中在动物以及有限的模式植物上,其在植物中的整体进化规律和在特定植物中的功能还缺乏认识。棉花是世界上重要的纤维作物,其中异源四倍体陆地棉（Gossypium hirsutum L.,基因组为AADD）是最常见的商业棉花。本实验以其为研究对象,在全面理解植物DAD基因进化的基础上,通过对比陆地棉栽培品种（样品编号为Maxxa）和野生变种G.hirsutum var.yucatanense（样品编号为Tx2094）各器官中DAD基因的表达情况,具体探究了在棉花驯化过程中,DAD基因启动子上的部分序列变异对基因表达的影响,主要的研究内容及结果如下:1、为全面了解DAD基因在植物中的进化规律,利用GenBank中释放的拟南芥的抗细胞凋亡基因（DAD1,DAD2）的序列,分别在NCBI和PLAZA等植物全基因组数据库内进行搜索。最后获得58个DAD基因同源序列,通过生物信息学手段,分析了不同植物中DAD基因在拷贝组成、基因结构以及染色体定位等方面的具体特点及其在种子植物中的整体进化趋向。研究表明:DAD基因属于低拷贝基因,编码大约108201个氨基酸。系统发育研究发现DAD基因在不同植物类群中的进化趋势具有明显的谱系特异性。2、为比较DAD基因在棉花驯化过程中是否产生表达分歧,我们根据之前获取的陆地棉Maxxa和Tx2094的转录组数据,利用RPKM方法,全面比较了DAD基因在两种陆地棉不同器官（叶、花瓣、种子和纤维）中的相对表达情况。结果发现:陆地棉中DAD基因有两个位点分别是DAD1和DAD2,每个位点又同时包括来自A和D基因组的2个同源拷贝。DAD1在两种棉花中的表达相对较低且差异不大;而DAD2在栽培棉Maxxa各个器官中的表达量整体上要高于其在野生棉Tx2094中的表达。此外,对于来自不同基因组的同源拷贝而言,来自A基因组的DAD2拷贝在表达上要较来自D基因组的拷贝更占优势。3、植物基因的表达在各个环节都进行着精细的调控,其中启动子的作用尤为重要。之前的研究发现DAD2基因A基因组上的拷贝在调控两种棉花中的表达差异中起的作用相对较大,但编码区却相对保守。为明确这种表达差异是否与二者的启动子序列差异有关,本研究选取了DAD2基因上游1500bp左右的区域的片段进行克隆和测序研究。结果表明二者除存在17个SNP差异外,Maxxa的启动子上还比Tx2094多了一个30bp的插入序列（类TATA-box）。从功能的角度来看,这些序列变异中,有2个SNP导致栽培棉Maxxa中出现了与赤霉素响应或无氧诱导相关的新的顺式作用元件出现。4、为探究棉花Maxxa和Tx2094中DAD2基因的表达差异是否与基因上游的启动子上序列突变有关,本研究用仅存在这30bp差异的栽培和野生棉花的DAD2基因的启动子片段替换PBI121质粒载体中的CaMV 35S启动子,继而与GUS基因结合分别构建植物表达载体（PDAD2-M和PDAD2-T）,同时用含有CaMV 35S启动子的PBI121质粒载体做阳性对照。随后将三种载体转入农杆菌的感受态细胞,采用农杆菌转染的方法侵染烟草,通过检测GUS基因的表达情况来分析启动子的表达活性。GUS组织化学染色的结果与GUS酶活测定的结果显示一致,即Maxxa中DAD2基因启动子活性显着高于Tx2094中DAD2基因启动子的活性（P<0.05）。5、为探究栽培品种Maxxa中DAD2基因的启动子上游参与赤霉素响应的顺式作用元件是否具有功能,用50 ug/mL的赤霉素GA30按不同的时间段（30 min、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h）分别喷洒处理栽培棉Maxxa和野生棉Tx2094植株;并进一步通过荧光定量PCR的方法比较分析赤霉素处理后,栽培和野生陆地棉中DAD2基因表达的变化。数据结果显示赤霉素处理可以同时促进Maxxa和Tx2094中DAD2基因的表达,但栽培棉Maxxa中DAD2基因的相对表达水平要显着高于Tx2094（P<0.05）。
吴怀通[6]（2017）在《棉花纤维起始发育基因Li3的图位克隆和功能验证》文中进行了进一步梳理棉花是世界性的重要经济作物,产生的天然纤维是重要的纺织工业原料。我们克隆到一个调控棉花纤维起始的基因Li3。它属于MIXTA类基因,命名为GhMML4D12。该基因在726bp产生C/A突变,导致出现无纤维表型。通过VIGS体系沉默GhMML4基因的表达后,确定了该基因的功能。通过物种间的MIXTA类基因的进化分析,确定锦葵科在进化过程中产生两类调控胚珠表皮细胞分化的基因。本课题的研究内容和结果如下:1.通过构建隐形光子n2NSM和XZ142FLM的分离群体,对调控纤维起始基因li3进行精细定位。最终构建的F2群体有4662个单株,包含3487个有纤维的单株和1175个无纤维的单株。构建的BC1群体有4668个单株,包括2343个有纤维的单株和2325个无纤维的单株。首先利用实验室的8869对SSR公用引物进行初步定位,最终将li3定位在Chr.26（D12）染色体上。根据雷蒙德氏棉基因组序列,又开发了 544对SSR引物。最终将li3基因精细定位在79.8Kb范围内。距离最近的W1644/1654和W1824/1834的遗传距离只有0.071和0.284cM。定位区间内包含三个候选基因,分别是两个MIXTA类基因,一个是NAC类基因。即ORF1（GhMML3）,ORF2（GhMML4）和ORF3（GhNAC）。由于ORF1之前被报道是调控短绒发育的基因,并且ORF3基因的序列在两个亲本间没有差异。所以,ORF2（GhMML4）被认定是li3的候选基因。2.对区间内的候选基因进行基因克隆和表达分析。结果显示,ORF1和ORF3基因在两个亲本间没有序列差异,ORF2基因在两个亲本间存在A/C的SNP差异,导致在XZ142FLM材料中的该基因提前终止终止后的基因命名为GhMML4t。表达分析显示:ORF1和ORF2均在纤维起始期特异表达。ORF3在纤维起始期优势表达。并且ORF2基因在两个亲本间表达存在极显着差异。对GhMML4和GhMML4t的亚细胞定位在细胞核中。3.通过VIGS体系,确定GhMML4基因就是目标基因li3。选择GhMML4基因的特异区段（410～948 bp）构建TRV2载体,以n2NSM材料为沉默受体,沉默GhMML4基因。结果显示,沉默后植株的-1DPA的胚珠中该基因的表达量极显着降低。1DPA的胚珠表皮细胞凸起极显着减少,只有背部少量细胞凸起。吐絮后衣分极显着降低。并且在所有接菌植株的GhMML4表达量和衣分呈现极显着相关性。证明GhMML4基因即为li3基因。4.GhMML4基因序列进化分析。选取拟南芥,葡萄,可可,金鱼草,木槿和雷蒙德氏棉的MIXTA类基因进行进化树分析。结果显示10个棉花MML基因分布在4个不同的分支中（SBG9-1～SBG9-4）。其中SBG9-2和SBG9-3属于锦葵科类特有的两类。SBG9-2包括棉花的MML3,MM7和MML9基因;SBG9-3包括棉花的MML4,MML8和MML10基因。根据MML3和MML4的调控纤维发育的功能,推断该两类基因可能是锦葵科在进化过程中分化出调控胚珠表皮细胞分化的功能基因。本研究通过图位克隆的方法成功获得一个调控纤维起始发育的基因GhMML4。为棉花等基因组结构复杂的多倍体材料的图位克隆提供宝贵经验。Li3基因是调控纤维起始发育的一个关键基因,对于将来研究纤维的起始分化有重要价值。
俛萍[7]（2017）在《棉花（Gossypium hirsutum）HOX4的功能及其与PA结合的调控研究》文中提出棉花作为世界上最重要的经济作物之一,为纺织业提供重要的原材料。棉纤维是棉花胚珠表皮细胞极性伸长发育而来的一种单细胞结构的表皮毛,它与拟南芥表皮毛发育模式相似,AtGL2是调控拟南芥表皮毛发育的下游基因,我们在棉花中克隆到4个AtGL2的同源基因,GhHOX1-4,其中GhHOX3已经被报道是参与调控棉花纤维伸长的一个关键因子。磷脂酸（PhosphatidicAcid,PA）是一种信号分子,被报道能够通过与多种靶蛋白结合来调节其活性,能调控核蛋白的定位和功能。本文围绕棉花中与AtGL2同源的GhHOX4的功能以及PA与GhHOX4蛋白互作对其功能的调控进行了研究,获得了如下的结果:1. .pH对PA与GhHOX4蛋白互作的影响PA是一个pH生物感受器,机体内的pH及PA磷酸基头部的质子化会影响PA与靶蛋白的结合。体外设置了 4个pH条件,通过Lipid-Protein Blotting实验来研究不同pH条件下PA与GhHOX4蛋白的互作,结果发现随着pH的降低,GhHOX4与PA的结合作用越来越强,这可能说明在植物受到一定环境胁迫时,体内pH的改变会调节PA与靶蛋白GhHOX4的结合,从而影响其发挥生物学功能。2.GhHOX4蛋白的关键结构域（domain）分析及截短设计在我们之前的研究中,发现PA能够与GhHOX4蛋白发生相互作用,为了找到PA与GhHOX4蛋白互作的具体位置,于是我们将GhHOX4蛋白进行分段截短。由于GhHOX4是HD-ZIP Ⅳ家族的一个成员,所以我们就根据HD-ZIP Ⅳ家族转录因子的结构,将GhHOX4蛋白相应的截短成四段:第一段是第97位氨基酸到第155位氨基酸的HD结构域（domain）、第二段是第156到224位氨基酸的ZLZ结构域（domain）、第三段是第297到522位氨基酸的START结构域（domain）、第四段是第523到749位氨基酸的SAD结构域（domain）。3. START结构域（domain）是GhHOX4与PA结合的关键位点对设计的四段截短区域通过设计相应引物,构建到原核表达蛋白载体pET28a或者pMAL上,在大肠杆菌DE3菌株Rosetta中获得了可溶性的表达蛋白。通过Lipid-Protein Blotting实验来分析GhHOX4是通过哪个区域来与PA进行结合的,结果发现PA除了能够与START结构域结合外,并不与其它三个区域的蛋白HD、ZLZ、SAD结构域结合,说明GhHOX4能与PA结合的基序是START结构域。4.多碱性氨基酸序列KR-R-R对GhHOX4与PA结合是必需的在START结构域中找到了可能与PA结合的多碱性氨基酸序列KR-R-R,分别将这四个氨基酸位点定点突变为丙氨酸,命名为STARTK339A、 STARTR340A、STARTK339A+R340A、STARTR359A、STARTR367A,将它们构建到 pMAL 蛋白表达载体上,在大肠杆菌DE3菌株中诱导表达并纯化,获得可溶性的目的蛋白。Lipid-Protein Blotting实验发现突变后的五个蛋白均不与PA相互作用,说明KR-R-R对GhHOX4蛋白与PA的结合是必需的。5. PA处理影响GhHOX4转基因拟南芥叶片表皮毛的起始分化和发育在体外用PA喷洒处理GhHOX4转基因拟南芥,研究了 PA与GhHOX4互作对GhHOX4功能的调控作用。用20μM PA对生长两周的GhHOX4转基因拟南芥植株以及野生型拟南芥进行喷洒处理,观察处理后的拟南芥第五片莲座叶上的表皮毛,发现叶片表皮毛数量减少,四分支表皮毛所占比例也降低,结合我们之前PA处理GhHOX4过量表达裂殖酵母使其长度变短的结果,说明PA与GhHOX4结合可能抑制GhHOX4的转录活性,对GhHOX4在棉花纤维发育中的功能发挥负调控作用。6.GhHOX4RNAi转基因棉花的初步分析将构建的RNAi抑制表达载体转化棉花,获得GhHOX4 RNAi转基因棉花植株,通过gDNA水平检测,鉴定选取阳性转基因棉花小苗种植在大田或温室中,开花后挑取长势良好的棉花,收取开花后第6、9、12天的纤维材料提取RNA并逆转录成cDNA,进行qRT-PCR分析,结果显示GhHOX4基因在棉纤维快速伸长时期的表达量显着下降。体外胚珠培养结果显示GhHOX4基因沉默后会影响纤维伸长发育,与野生型相比,GhHOX4RNAi转基因棉花胚珠发育迟缓,纤维变短,这说明GhHOX4可能对棉纤维伸长有一定的调控作用。
马启峰[8]（2016）在《棉花纤维发育起始期蛋白质组和转录组学分析》文中提出棉花是我国最重要的经济作物之一,其中90%以上的价值体现在棉纤维上。棉纤维的分化和起始是影响棉花产量和质量的重要因素,开花前或开花当天所形成的突起以后发育成长纤维,因此纤维原始细胞突起的时间、多少直接决定棉花的产量。前人已经从细胞学、形态学、生理生化及遗传等方面探讨了棉纤维起始机制。目前,有关纤维起始的分子机制研究,大部分集中在对少数基因的克隆、功能研究,但纤维发育的机制需进一步研究。利用高通量测序的技术手段研究棉纤维起始（转录组学和蛋白组学）,有助于从整体上揭示其关键的代谢通路、从而筛选出关键基因。本研究利用同位素标记相对和绝对定量结合液相色谱串联质谱技术和RNA-seq技术,对徐州142及其突变体（开花前3天及开花当天的胚珠）开展了棉花纤维细胞起始期的蛋白质组、磷酸化蛋白质组和转录组进行分析,得到以下主要结果:1、通过质谱分析、库的搜索,共鉴定出5045个蛋白质,其中野生型和突变体的差异蛋白有202个,在野生型中121个蛋白高调表达,81个蛋白低调表达。这些差异蛋白主要参与脂肪酸代谢、核糖代谢、黄酮合成、信号转导等途径。比较分析可得,基因在转录水平和翻译水平存在较大差异。拟南芥同源比对可得,绝大数蛋白都能在拟南芥中找到同源序列,其中1/3的同源序列参与拟南芥表皮毛根毛发育,揭示了拟南芥表皮毛、根毛的发育与纤维的起始两者有相似调控机理。本研究综合分析了棉纤维起始相关蛋白,建立了一个完整的纤维起始相关蛋白库,为以后利用生物技术手段提高纤维突起、改良纤维特性提供参考。2、应用nano-UPLC-MS/MS串联质谱结合磷酸化肽段富集的方法,共鉴定了1592个磷酸化位点（1423个丝氨酸、151个苏氨酸和18个酪氨酸）和619个磷酸化蛋白。其中仅有492个磷酸化位点相对保守,表明可能存在与棉纤维起始相关的依赖磷酸化调控机制。获得8个棉花特有的显着富集的磷酸化基序,其中分别是酪氨酸激酶II底物基序、转化生长因子受体激酶底物基序、蛋白激酶B底物基序和胞外信号调节激酶底物基序,证实在棉纤维细胞起始期间这些蛋白激酶对含有上述基序的蛋白磷酸化起到了重要的作用。在619个磷酸化蛋白中,徐州142及其突变体在0 DPA和-3 DPA的差异蛋白共69个,这些差异的磷酸化蛋白主要参与信号转导,蛋白修饰,碳代谢以及细胞分裂和细胞增殖等代谢通路,表明磷酸化信号级联反应和蛋白翻译后修饰作用在棉纤维细胞起始的调控过程中具有十分重要的生物学意义。还发现一些与目前已知的纤维起始相关基因产物同源的磷酸化蛋白,如GTPase酶、UDP-葡萄糖脱氢酶,证实这些蛋白的磷酸化与纤维起始调控有一定的相关性。本研究首次通过纤维突变体材料进行棉纤维起始期磷酸化蛋白质组分析,为将来理解和揭示蛋白磷酸化对棉纤维细胞起始的调控机理研究提供了一个新的视角,为棉纤维品质的遗传改良打下了坚实的基础。3、构建转录组测序文库并进行Illumina RNA-seq双端测序及生物信息学分析。共获得有效数据57.23 Gb,并结合有参、无参两种方法论进行转录组分析。通过de novo拼接获得了长度大于200 bp的转录本166 963条;转录物总长度167.32 Mb,平均长度1051 bp。转录物注释结果显示,109 518条转录物序列具有同源比对信息;57 445条转录物序列无匹配（no hits）序列信息,可能为纤维起始特有的基因序列。采用COG、GO功能分类工具可将已注释转录物序列划分为25个或44个功能类别,共涉及物质及能量代谢、信号传导、转录调控及防卫反应等诸多生理生化过程。利用SSR检索程序从166 963条unigenes中筛选得到15 196个SSR位点（9.36%）,其发生频率为1/10kb,基序长度为12-24 bp之间。共设计了11 179对SSR位点特异引物,占总SSR位点的71.51%。野生型和突变体比较,共鉴定到193 755个SNP,其中142 800个来自于陆地棉基因组比对分析,50 955个来自于de novo拼接。通过比较分析在本研究中首次鉴定11 488个SSRs和181 981个SNPs。随机抽取75个SSR和25个SNP并验证结果的可靠性。初步确定8 503个差异表达基因,其中2 470个差异表达基因含有SNP或SSR并将这些基因定位到陆地棉26个染色体上。本研究利用徐州142野生型及其突变体旨在探索纤维起始阶段内在的分子机制,为深入开展棉纤维分化、起始发育相关基因功能及调控以及棉花分子标记开发等研究提供了丰富的数据资源。
毕志宏[9]（2016）在《小黑杨PsnSuSy1及PsnSuSy1、PsnSuSy2过表达烟草的次生性状研究》文中进行了进一步梳理蔗糖合成酶是植物蔗糖代谢过程中的关键酶之一,在植物淀粉及纤维素的合成,碳源的分配等方面具有重要作用,为探究小黑杨（Populus simonii x P. nigra）蔗糖合成酶基因在植物次生生长方面的作用,本项目从小黑杨中克隆了PsnSuSy1,并获得了过表达PsnSuSy1转基因烟草株系。在此基础上,以实验室前期得到的PsnSuSy2转基因株系为父本,PsnSuSy1转基因株系为母本,采用杂交方法得到了PsnSuSy1×PsnSuSy2杂交株系,对转基因PsnSuSy1株系及杂交株系生长性状与次生性状进行了初步研究。主要研究内容及结果如下：1小黑杨SuSy1基因的克隆及生物信息学分析本文从小黑杨中克隆得到片段长为2495bp的SuSy,命名为PsnSuSy1。生物信息学分析表明,PsnSuSy1基因编码805个氨基酸,理论等电点PI为6.07,分子量为92.57kDa。该蛋白的二级结构主要以α螺旋为主。该蛋白不具有信号肽切割位点,没有信号肽区域。亚细胞定位预测结果表明PsnSuSy1定位在细胞质中,属于胞质型。2.小黑杨SuSy1组织特异性表达及亚细胞定位利用R T-PCR和荧光定量PCR技术分析了PnsSuSy 1表达特异性,PsnSuSv1在过度木质部中表达丰度最高,在次生木质部表达量次之,在过度形成层、次生形成层的表达丰度中等,而在根、叶柄、初生叶、过度叶、次生叶、初生木质部、初生形成层中表达丰度均相对较低。本文构建了pGWB5-SuSy1-GFP植物表达载体,利用基因枪法瞬时表达洋葱表皮细胞,分析了PsnSuSy1表达产物的亚细胞定位情况,结果显示PsnSuSy1编码蛋白定位在细胞质与细胞核中。3. PsnSuSy1过表达烟草及PsnSuSy1× PsnSuSy2杂交烟草的功能分析对PsnSuSv1过表达转基因烟草及PsnSuSy1×PsnSuSy2杂交烟草的研究发现,转基因烟草及杂交烟草的株高,叶片长宽,生物量及茎秆强度等生长性状明显高于野生型；利用环境扫描电子显微镜对PsnSuSy1过表达烟草及PsnSuSy1×PsnSuSy2杂交烟草的茎段超微结构进行观察,发现转基因烟草及杂交烟草的茎部次生细胞壁与WT相比厚度增厚。对PsnSuSy1过表达烟草及PsnSuSy1×PsnSuSy2杂交烟草的SuSy酶活进行测量,结果表明PsnSuSy1转基因烟草及PsnSuSy1×PsnSuSy2杂交烟草与WT相比SuSy酶活均有不同程度的增加。转基因烟草及杂交烟草的叶绿素含量增多均高于野生型,茎部半纤维素和纤维素的含量与野生型相比均有不同程度的增加,而木质素较野生型有所减少。在以上这些性状中,转基因烟草与杂交烟草之间无明显变化趋势,这表明PsnSuSy1基因过表达及过表达PsnSuSy1、PsnSuSy2基因植株杂交均能够促进植株的高生长,提高生物产量,并对植物次生生长具有一定的影响。
张志远[10]（2015）在《杀菌蛋白基因（Hcm1）和陆地棉固醇载体蛋白基因（GhSCP2D）在棉花中的功能分析》文中研究说明棉花是世界性的重要经济作物,产生的天然纤维是重要的纺织工业原料。然而,由于环境恶化,棉花在其生长区域频繁遭受着干旱、高盐、低温等非生物以及病害等生物胁迫的侵袭,特别是棉花的黄萎病,被誉为棉花的癌症,严重影响了棉花的生长发育和产量。陆地棉是我国棉花的主栽品种,占棉花栽培面积的95%以上,然而在这些陆地棉主栽品种中,抗逆性好、抗病性强和纤维品质优良的品种并不多。特别是抗黄萎病品种的培育,由于在陆地棉中找不到免疫或高抗的黄萎病抗源,一直是棉花育种家的一大难题。通过研究棉花抗逆抗病机制,利用基因工程的方法来培育优良的棉花新品种将是今后棉花育种的主要方向。杀菌蛋白Hcm1是一个由诱导植株产生过敏反应的Harpinxooc蛋白和抑制病菌生长的抗菌肽（CecropinA）与蜂毒肽（Melittin）通过活性结构域结合的一种新型蛋白,该蛋白在烟草上能够诱导产生过敏性反应,在体外能够抑制多种病原菌的生长。利用基因枪的技术,我们在洋葱表皮细胞瞬时表达Hcm1-GFP的融合表达载体,实验结果显示该蛋白定位于植物细胞的整个膜系统上。为了验证Hcm1的抗病性,把含有Hcm1基因的CaMV35S组成性表达启动子驱动的植物过量表达载体,通过农杆菌介导的方.法导入到陆地棉W0中,获得四个转基因纯合株系。Southern杂交分析表明,这四个转基因株系含有一个至三个拷贝不等。Western杂交表明,四个转基因株系中Hcm1都能够得以表达出蛋白。温室和田间的枯萎病和黄萎病抗病性鉴定表明,四个转基因株系的抗病性都得到明显提高,说明转Hcm1基因赋予了转基因植株多种抗病性。H2O2含量测定发现,相对于受体W0,转基因植株中的H2O2含量提高,然而抗病基因NPR1,PR1,HSR203J和HIN1的表达量并没有明显的提高。在接种黄萎病菌后,转基因植株活性氧的含量在0-12小时迅速提高,出现两个峰值,而受体W0的过氧化氢含量缓慢提高。转基因植株在第二个峰值后出现坏死性细胞（过敏性反应）,并且抗病基因NPR1,PR1,HSR203J和HIN1的表达量与对照相比迅速升高。这些结果说明,杀菌蛋白Hcm1中的Harpinxooc蛋白可能使植物处于一种抗病的引发态（priming）,当病原菌侵染时,转Hcm1植物快速启动植物的抗病反应,以阻止病原菌进一步侵染。为了研究Hcm1蛋白抑制枯萎病菌和黄萎病菌的能力,我们在大肠杆菌中原核表达Hcm1,发现粗提蛋白对枯萎病菌和黄萎病菌的生长有显着的抑制作用。我们提取转基因植株的蛋白,实验表明从转Hcm1基因植株中提取的蛋白同样具有抑制枯萎病菌和黄萎病菌生长的作用。为了研究Hcm1蛋白在植物体内抑制病菌的能力,我们使用带绿色荧光蛋白（Green fluorescentprotein,GFP）的V991分别接种转基因植株和受体W0,通过观察荧光信号的强弱确定黄萎病菌在植物体内的含量。结果显示,转基因植株体内的荧光信号明显弱于受体W0,说明转基因植株中的黄萎病菌的量少于对照W0。我们以接黄萎病菌15天的转基因植株和对照W0植株的基因组DNA为模板,利用定量RT-PCR的方法研究转基因棉花和对照各个组织器官中的黄萎病菌的含量的差异,结果显示转基因植株中的黄萎病菌的量少于对照W0,说明Hcm1能够有效抑制黄萎病菌在棉花体内的扩展。棉纤维是世界上最重要的纺织原料之一,是由种子胚珠外表皮细胞经过一系列发育调控形成,其单细胞结构为研究相关基因在发育中的功能提供了一个良好的实验系统。阐明棉纤维发育重要基因功能对理解单细胞结构的棉纤维发育机理,进而通过分子育种手段改良棉纤维品质具有重要意义。我们筛选陆地棉标准系TM-1纤维起始、伸长及次生壁加厚时期的差异表达基因,获得了一个与棉纤维发育相关的CDS序列,28K178ALL。经BLAST发现该序列是一个与拟南芥固醇载体蛋白（AtSCP2）高度相似的陆地棉固醇载体蛋白。利用本实验室测序的陆地棉TM-1序列,我们共发现六个固醇载体蛋白。我们从陆地棉共克隆出四个表达的固醇载体蛋白基因,分别命名为GhSCP1D、GhSCP2D、GhSCP3A 和 GhSCP3D,其中GhSCP2D是我们发现的28K178ALL。氨基酸序列分析发现,GhSCP2D、GhSCP3A和GhSCP3D含有过氧化物酶体信号肽1（PTS1）,而GhSCP1D则由于终止密码子的突变导致无法预测出信号肽。我们构建GhSCP-GFP融合表达载体,利用PEG介导的方法导入到棉花原生质体中,发现GhSCP1D定位于叶绿体,其它三个基因定位于过氧化物酶体。RNA-seq数据分析和定量结果显示GhSCP2D在棉纤维特异表达,在5DPA的表达量最高,其它三个基因在子叶中优势表达。这四个基因都受蔗糖诱导,特别是GhSCP2D基因。为了研究陆地棉固醇载体蛋白在棉纤维发育中的功能,我们构建GhSCP2D的反义表达载体,通过农杆菌介导的方法导入到陆地棉W0中,获得上述载体转化的转基因棉花植株。对每个再生单株进行NPTⅡ和启动子-基因特异引物的PCR检测,经过连续3个世代的选择,共获得3个转基因纯合株系。定量RT-PCR分析发现3个转基因株系表达均显着下降,说明在转基因株系中,该基因在纤维发育时期的表达被抑制。纤维品质检测发现,与受体W0相比,转基因棉花纯系其纤维强度和细度有小幅降低,而纤维长度显着变短。根据拟南芥的报道,我们推测固醇载体蛋白与蔗糖的运输有关。蔗糖含量测定发现,转基因棉花5DPA纤维中的蔗糖含量与W0相比显着降低,说明抑制GhSCP2D的表达导致蔗糖运输受阻。蔗糖通过共质体途径（胞间连丝）或者质外体途径（需要蔗糖转运蛋白的协助）进入棉纤维细胞。植物中蔗糖转运蛋白分为蔗糖载体蛋白和SWEETs蛋白,在四倍体陆地棉中,共有六个蔗糖载体蛋白基因和21个SWEETs基因。RNA-seq数据分析和定量结果发现,转运蔗糖的蔗糖载体蛋白基因和SWEETs基因在陆地棉的5DPA的纤维中表达量极低,所以GhSCP2D调控共质体途径的蔗糖运输。在转GhSCP2D基因的植株和受体W0中,我们发现蔗糖载体蛋白基因和SWEETs基因的表达显着升高,这些结果进一步说明GhSCP2D通过共质体途径而非质外体途径影响蔗糖的运输。通过以上结果我们推测蔗糖进入蔗糖细胞两个途径具有相互补偿效应,当共质体途径的蔗糖运输受阻时,质外体途径（蔗糖载体蛋白的表达量提高）补偿共质体途径蔗糖运输的损失。共质体途径的蔗糖运输取决于胞间连丝通透性,而胞间连丝通透性由胼胝质和H202调节。H2O2可以通过增加分枝和孪生的胞间连丝的数量增加胞间连丝通透性或者诱导胼脉质在胞间连丝的沉积降低胞间连丝的通透性。通过测定转基因植株和受体W0纤维中H202含量发现,H202含量与对照W0相比显着提高,说明GhSCP2D很有可能通过调节胼胝质的在胞间连丝的沉积影响蔗糖的运输。GhMYB9编码一个R2R3MYB转录因子。定量RT-PCR结果显示,GhMYB9在棉花纤维和花器官中优势表达。为了研究该基因的调节机制,我们分离出这个基因1487bp的启动子序列。调控元件分析发现1487bp区域内含有启动子核心的调控元件（TATA-box,CAAT-box）和转录起始位点（TSS）。我们把一个全长和两个缺失片段驱动GUS的pBI121载体导入到陆地棉W0中,研究其表达模式。GUS染色结果显示,GUS基因主要在转基因棉花的种子,纤维和花器官中表达。GUS活性也测定,在纤维、雄蕊和雌蕊中,GUS活性显着高于其它组织器官。通过启动子的缺失片段分析,我们发现GhMYB9受生长素诱导,并且受生长素诱导的区域位于启动子-1,231到-860之间。
二、A Suppressed Gene in Integument Cells of a Fiberless Seed Mutant in Upland Cotton（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、A Suppressed Gene in Integument Cells of a Fiberless Seed Mutant in Upland Cotton（论文提纲范文）
（1）棉纤维发育相关基因的挖掘及优质转基因棉花的培育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 棉纤维发育相关基因的筛选及功能分析 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 棉花纤维伸长发育过程的研究进展 |
| 1.1.1 纤维原始细胞分化起始过程相关研究 |
| 1.1.2 棉纤维伸长过程的相关研究 |
| 1.1.3 棉纤维次生壁增厚过程的相关研究 |
| 1.1.4 棉纤维脱水成熟过程的相关研究 |
| 1.2 棉花纤维发育相关基因的研究进展 |
| 1.2.1 转录组测序技术在棉花纤维发育研究中的应用 |
| 1.2.2 棉纤维发育相关基因的研究 |
| 1.3 棉花纤维启动子的研究进展 |
| 1.3.1 植物启动子的基本结构、功能与分类 |
| 1.3.2 双向启动子在植物中的研究现状 |
| 1.3.3 棉纤维特异或优势表达启动子的研究进展 |
| 1.4 本课题研究的目的意义 |
| 第二章 棉花纤维发育相关基因的筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验仪器及试剂 |
| 2.1.3 引物序列及测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品准备 |
| 2.2.2 RNA的提取 |
| 2.2.3 RNA质量检测 |
| 2.2.4 文库构建 |
| 2.2.5 生物信息数据分析流程 |
| 2.2.6 转录组数据的qRT-PCR分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 棉花不同组织样品总RNA质量检测 |
| 2.3.2 棉花不同组织转录组测序数据的质量评估 |
| 2.3.3 基因总体表达水平分析 |
| 2.3.4 7 DPA纤维与非纤维组织转录组之间的差异表达基因分析 |
| 2.3.5 14 DPA纤维与非纤维组织转录组之间的差异表达基因分析 |
| 2.3.6 26 DPA纤维与非纤维组织转录组之间的差异表达基因分析 |
| 2.3.7 利用qRT-PCR方法对转录组数据进行验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 陆地棉双向启动子的序列分析及功能鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验仪器和试剂 |
| 3.1.3 菌体和质粒载体 |
| 3.1.4 培养基和常规试剂 |
| 3.1.5 引物序列及测序 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 SqRT-PCR和 qRT-PCR分析双向基因对Ghrack1和Ghuhrf1 的表达模式 |
| 3.2.2 5 ˊRACE技术确定双向基因的转录起始位点 |
| 3.2.3 双向基因间区域的克隆与序列分析 |
| 3.2.4 植物表达载体的构建与农杆菌转化 |
| 3.2.5 拟南芥的稳定表达转化 |
| 3.2.6 转基因拟南芥阳性植株的检测及拷贝数分析 |
| 3.2.7 转基因植株的组织化学染色和绿色荧光蛋白观察 |
| 3.2.8 转基因拟南芥中gus和 gfp基因的表达量差异分析 |
| 3.2.9 转基因拟南芥的Western blot检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 双向基因间序列分析 |
| 3.3.2 Ghrack1和Ghuhrf1 基因在陆地棉不同组织中的差异表达分析 |
| 3.3.3 双向基因间序列的克隆及分析 |
| 3.3.4 转基因拟南芥阳性植物的检测及其拷贝数分析 |
| 3.3.5 双向启动子GhRU在转基因拟南芥中的功能分析 |
| 3.3.6 报告基因在转基因拟南芥中的转录水平差异分析 |
| 3.3.7 Western blot检测转基因拟南芥中GUS蛋白和GFP蛋白的表达水平 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 陆地棉基因组中双向启动子的挖掘及功能分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 陆地棉双向基因对的筛选 |
| 4.2.2 陆地棉双向基因对的功能注释和聚类分析 |
| 4.2.3 陆地棉双向基因对的同源性分析 |
| 4.2.4 纤维特异或优势表达双向基因对的筛选 |
| 4.2.5 双向启动子的获得及其序列特征分析 |
| 4.2.6 双向启动子的克隆及功能分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 陆地棉双向基因对的全基因组筛选及功能聚类分析 |
| 4.3.2 双向启动子的序列特征及其基因组分布分析 |
| 4.3.3 棉纤维特异或优势表达双向启动子的筛选及克隆 |
| 4.3.4 棉纤维特异或优势表达双向启动子的功能分析 |
| 4.3.5 四个棉花亚种的双向基因对及其双向启动子的比较分析 |
| 4.3.6 双向基因的系统进化分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第二部分 优质纤维转基因棉花的培育 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTH)蛋白家族的研究进展 |
| 1.1.1 XTH蛋白的分类 |
| 1.1.2 XET在植物细胞壁重塑过程中的研究 |
| 1.2 微管切割蛋白(KTN)在植物中的研究 |
| 1.3 特异表达启动子在纤维品质改良研究中的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 转GhXET基因棉花植株的获得及特异性检测分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验仪器及试剂 |
| 2.1.3 菌体和质粒载体 |
| 2.1.4 培养基和常规试剂 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 GhXET基因及编码蛋白的生物信息学分析 |
| 2.2.2 GhXET基因植物表达载体的构建与农杆菌转化 |
| 2.2.3 棉花的遗传转化 |
| 2.2.4 转GhXET基因棉花中目标基因的拷贝数分析 |
| 2.2.5 转基因棉花植株中GhXET基因在不同组织中的表达量分析 |
| 2.2.6 转GhXET基因棉花成熟纤维的品质测定 |
| 2.2.7 转GhXET基因棉花侧翼序列克隆与分析 |
| 2.2.8 转GhXET基因转化事件特异性PCR检测方法的建立 |
| 2.2.9 转GhXET基因棉花植株纯合体筛选方法的建立 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 GhXET基因在陆地棉中的表达模式分析 |
| 2.3.2 GhXET蛋白的生物信息学分析结果 |
| 2.3.3 转GhXET基因棉花植株的获得 |
| 2.3.4 转GhXET基因棉花的PCR检测 |
| 2.3.5 转GhXET基因棉花植株中目标基因的拷贝数分析 |
| 2.3.6 利用qRT-PCR分析转基因棉花的mRNA表达量分析 |
| 2.3.7 转GhXET基因棉花的成熟纤维品质测定 |
| 2.3.8 转GhXET基因棉花中目标基因的侧翼序列分析 |
| 2.3.9 转GhXET基因转化事件特异性PCR检测方法的建立 |
| 2.3.10 转GhXET基因棉花植株纯合体筛选方法的建立 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 纤维特异性启动子在棉花纤维发育相关基因研究中的应用 |
| 2.4.2 木葡聚糖内转糖苷酶XET在纤维发育过程中的功能分析 |
| 2.4.3 转GhXET基因棉花的分子特征分析 |
| 第三章 转GhKTN基因棉花植株的获得及特异性检测分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 GhKTN基因及编码蛋白的生物信息学分析 |
| 3.2.2 GhKTN基因植物表达载体的构建与农杆菌转化 |
| 3.2.3 棉花的遗传转化 |
| 3.2.4 转GhKTN基因棉花中目标基因的拷贝数分析 |
| 3.2.5 转GhKTN基因棉花中目标基因的mRNA表达量分析 |
| 3.2.6 转GhKTN基因棉花的成熟纤维品质测定 |
| 3.2.7 转GhKTN基因棉花的侧翼序列克隆与分析 |
| 3.2.8 转GhKTN基因转化事件特异性PCR检测方法的建立 |
| 3.2.9 转GhKTN基因棉花植株纯合体筛选方法的建立 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 GhKTN基因在陆地棉中的表达模式分析 |
| 3.3.2 GhKTN蛋白的生物信息学分析结果 |
| 3.3.3 转GhKTN基因棉花的PCR检测 |
| 3.3.4 转GhKTN基因棉花中目标基因的拷贝数分析 |
| 3.3.5 利用qRT-PCR分析转基因棉花的mRNA表达量分析 |
| 3.3.6 转GhKTN基因棉花的成熟纤维品质测定 |
| 3.3.7 转GhKTN基因棉花中目标基因的侧翼序列分析 |
| 3.3.8 转GhKTN基因转化事件特异性PCR检测方法的建立 |
| 3.3.9 转GhKTN基因棉花植株纯合体筛选方法的建立 |
| 3.4 讨论 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（2）细胞分裂素通过干扰胚珠表皮GhPIN3a介导的生长素不对称积累抑制棉花纤维起始（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 棉花纤维的重要性 |
| 1.1.1 棉花纤维的经济价值 |
| 1.1.2 棉花纤维的科研价值 |
| 1.2 生长素在植物组织中的不对称积累及其调控方式 |
| 1.2.1 生长素在植物组织中的不对称积累 |
| 1.2.2 原位合成调控植物组织中生长素的不对称积累 |
| 1.2.2.1 依赖色氨酸的生长素合成途径 |
| 1.2.2.2 不依赖色氨酸的生长素合成途径 |
| 1.2.3 生长素极性运输调控植物组织中生长素的不对称积累 |
| 1.2.4 代谢调控植物组织中生长素的不对称积累 |
| 1.3 细胞分裂素在植物组织中的浓度调控和信号转导 |
| 1.3.1 细胞分裂素在植物组织中的浓度调控 |
| 1.3.1.1 合成调控植物组织中细胞分裂素的浓度 |
| 1.3.1.2 降解调控植物组织中细胞分裂素的浓度 |
| 1.3.2 细胞分裂素在植物组织中的信号转导 |
| 1.4 生长素与细胞分裂素在调控植物生长发育中的互作关系 |
| 1.4.1 生长素与细胞分裂素在调控植物生长发育中的协同关系 |
| 1.4.2 生长素与细胞分裂素在调控植物生长发育中的拮抗关系 |
| 1.5 棉花纤维起始的研究进展 |
| 1.5.1 棉花纤维的发育过程 |
| 1.5.2 植物激素在棉花纤维起始中的作用 |
| 1.5.2.1 生长素在棉花纤维起始中的作用 |
| 1.5.2.2 细胞分裂素在棉花纤维起始中的作用 |
| 1.5.2.3 其它植物激素在棉花纤维起始中的作用 |
| 1.5.3 棉花纤维起始相关基因的研究进展 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究意义及立题依据 |
| 2.2 技术路线 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株和载体 |
| 3.1.3 主要药品试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 主要培养基和缓冲液配方 |
| 3.1.5.1 棉花遗传转化和组织培养 |
| 3.1.5.2 棉花胚珠离体培养 |
| 3.1.5.3 GUS酶活测定 |
| 3.1.5.4 mRNA原位杂交 |
| 3.1.5.5 IAA和细胞分裂素的原位杂交 |
| 3.1.5.6 植物激素提取 |
| 3.1.5.7 其它溶液和培养基配方 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 载体构建 |
| 3.2.2 棉花遗传转化 |
| 3.2.3 胚珠培养 |
| 3.2.4 植物激素提取和检测 |
| 3.2.5 总纤维单元检测 |
| 3.2.6 植物总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 3.2.7 RT-qPCR分析 |
| 3.2.8 棉花胚珠显微解剖 |
| 3.2.9 组织化学染色和GUS酶活测定 |
| 3.2.10 mRNA原位杂交 |
| 3.2.11 棉花纤维生长、GUS信号和蛋白定位的显微观察 |
| 3.2.12 生长素极性运输抑制剂处理 |
| 3.2.13 IAA原位杂交 |
| 3.2.14 细胞分裂素原位杂交 |
| 3.2.15 棉花每粒种子成熟纤维数目统计 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 棉花纤维起始过程中细胞分裂素与生长素存在拮抗关系 |
| 4.1.1 棉花胚珠和纤维中细胞分裂素与生长素含量的动态变化 |
| 4.1.2 利用激素诱导报告系统原位观察棉花胚珠和纤维中细胞分裂素与生长素的动态分布 |
| 4.1.2.1 细胞分裂素报告系统proTCS:GUS在棉花中的活性和特异性 |
| 4.1.2.2 生长素报告系统proDR5:GUS在棉花中的活性和特异性 |
| 4.1.2.3 利用激素诱导报告系统指示棉花纤维起始阶段胚珠和纤维中细胞分裂素与生长素的动态分布 |
| 4.1.3 细胞分裂素与棉花纤维起始的关系 |
| 4.1.3.1 离体添加细胞分裂素对棉花纤维起始的影响 |
| 4.1.3.2 内源增加胚珠中细胞分裂素含量对棉花纤维起始的影响 |
| 4.1.4 生长素与棉花纤维起始的关系 |
| 4.1.5 棉花纤维起始过程中细胞分裂素与生长素的拮抗关系 |
| 4.1.6 小结 |
| 4.2 细胞分裂素干扰生长素在棉花胚珠表皮的积累并抑制纤维起始 |
| 4.2.1 无纤维突变体xu142fl胚珠中生长素和细胞分裂素的积累模式 |
| 4.2.2 细胞分裂素干扰生长素在棉花胚珠表皮的积累抑制纤维起始 |
| 4.2.3 小结 |
| 4.3 生长素在棉花胚珠表皮不对称积累的调控模式 |
| 4.3.1 生长素原位合成和极性运输在棉花胚珠表皮生长素积累及纤维起始中的作用 |
| 4.3.1.1 生长素原位合成在棉花胚珠表皮生长素积累及纤维起始中的作用 |
| 4.3.1.2 生长素极性运输在棉花胚珠表皮生长素积累及纤维起始中的作用 |
| 4.3.1.3 生长素内运和外运蛋白在棉花胚珠表皮生长素积累及纤维起始中的作用 |
| 4.3.2 生长素外运蛋白GhPIN3a在棉花胚珠表皮生长素不对称积累和纤维起始中的作用 |
| 4.3.2.1 GhPINs在棉花开花前后的花柄、果枝、子房和花柱中的表达分析 |
| 4.3.2.2 GhPIN3a在棉花胚珠外珠被中特异性优势表达 |
| 4.3.2.3 干扰GhPIN3a的表达抑制棉花纤维细胞的起始 |
| 4.3.2.4 GhPIN3a的定位与生长素在棉花胚珠表皮中的不对称积累 |
| 4.3.3 小结 |
| 4.4 细胞分裂素干扰棉花胚珠表皮生长素不对称积累的作用机理 |
| 4.4.1 细胞分裂素对GhPIN3a基因表达的影响 |
| 4.4.2 细胞分裂素对GhPIN3a蛋白定位的影响 |
| 4.4.3 小结 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 生长素调控棉花纤维的起始而不是分化 |
| 5.2 棉花纤维起始所需的生长素主要源于通过花柄的外运 |
| 5.3 棉花纤维起始期生长素在胚珠中的运输 |
| 5.4 GhPIN3a在棉花胚珠表皮的蛋白定位与生长素在纤维细胞中的积累 |
| 5.5 细胞分裂素与生长素的拮抗关系与棉花纤维起始 |
| 5.6 细胞分裂素通过干扰生长素在棉花胚珠表皮的不对称积累抑制纤维起始 |
| 5.7 细胞分裂素水平与xu142fl突变体无纤维表型 |
| 5.8 调控生长素和细胞分裂素含量在棉花育种中的应用 |
| 第6章 主要结论、创新点和展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 ：缩略词表 |
| 附录2 ：攻读学位期间参与的课题 |
| 附录3 ：攻读学位期间已发表的学术论文 |
| 附录4 ：攻读学位期间即将发表的学术论文 |
| 附录5 ：攻读学位期间参编的学术专着(英文) |
| 附录6 ：攻读学位期间申请的专利 |
| 致谢 |
（3）海岛棉GbTCP5和GbTCP10基因的克隆和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 棉花纤维发育研究进展 |
| 1.1.1 棉纤维起始发育的研究 |
| 1.1.2 棉纤维伸长发育的研究 |
| 1.1.3 棉纤维的次生细胞壁增厚 |
| 1.1.4 棉纤维的成熟期 |
| 1.2 植物表皮毛发育研究进展 |
| 1.2.1 拟南芥表皮毛发育过程 |
| 1.2.2 调控拟南芥表皮毛发育的相关基因 |
| 1.3 棉花纤维发育相关基因研究进展 |
| 1.4 TCP转录因子研究进展 |
| 1.4.1 TCP家族的起源 |
| 1.4.2 TCP转录因子的结构和分类 |
| 1.4.3 TCP转录因子与DNA结合特性的研究 |
| 1.4.4 TCP基因的转录后调控 |
| 1.4.5 植物TCP转录因子与植物生长发育 |
| 1.4.6 植物TCP转录因子与纤维发育 |
| 1.5 研究目的、意义及研究内容 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.6 技术路线 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 生化试剂与酶 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 常用培养基和溶液配制 |
| 2.1.6 试验中所用到的引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 棉花总RNA的提取及cDNA第一链的合成 |
| 2.2.2 GbTCP5和GbTCP10 基因的克隆 |
| 2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 酵母单杂交 |
| 2.2.6 GbTCP5和GbTCP10 基因过表达转化拟南芥 |
| 2.2.7 利用人工mi RNA沉默GbTCP5和GbTCP10 基因 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 GbTCP5基因克隆及功能分析 |
| 3.1.1 GbTCP5基因的克隆及序列分析 |
| 3.1.2 GbTCP5的表达模式分析 |
| 3.1.3 酵母单杂交分析 |
| 3.1.4 棉花GbTCP5基因的功能鉴定 |
| 3.1.5 过量表达GbTCP5影响表皮毛发育相关基因表达量 |
| 3.1.6 拟南芥表皮毛发育相关基因启动子结合特性分析 |
| 3.1.7 利用人工mi RNA沉默GbTCP5 基因 |
| 3.2 GbTCP10基因克隆及功能分析 |
| 3.2.1 GbTCP10基因的克隆及序列分析 |
| 3.2.2 GbTCP10的表达模式分析 |
| 3.2.3 酵母单杂交分析 |
| 3.2.4 棉花GbTCP10基因的功能鉴定 |
| 3.2.5 GbTCP10转基因植株表皮毛发育相关基因表达量分析 |
| 3.2.6 拟南芥表皮毛发育相关基因启动子结合特性分析 |
| 3.2.7 利用人工mi RNA沉默GbTCP10 基因 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 全文结论 |
| 4.1 海岛棉GbTCP5基因的克隆与功能分析 |
| 4.1.1 基因特性研究结论 |
| 4.1.2 表达模式研究结论 |
| 4.1.3 功能验证研究结论 |
| 4.2 海岛棉GbTCP10基因的克隆与功能分析 |
| 4.2.1 基因特性研究结论 |
| 4.2.2 表达模式研究结论 |
| 4.2.3 功能验证研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）基于标记定量的陆地棉胚珠的磷酸化蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质组学简介 |
| 1.2 磷酸化蛋白质组学简介 |
| 1.3 基于质谱的蛋白质组学常用研究方法简介 |
| 1.4 常用标记方法简介 |
| 1.4.1 代谢标记:SILAC和~(15)N稳定同位素标记 |
| 1.4.2 非标记定量 |
| 1.4.3 化学标记:双甲基标记、iTRAQ和TMT |
| 1.5 选题依据和研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 蛋白质的提取 |
| 2.2.2 蛋白质的溶液内酶解 |
| 2.2.3 C18柱脱盐 |
| 2.2.4 肽段标记及脱盐处理 |
| 2.2.5 富集磷酸化多肽片段 |
| 2.2.6 样本分级分离 |
| 2.2.7 质谱数据鉴定及进一步筛选 |
| 第三章 磷酸化蛋白质组学数据分析结果 |
| 3.1 磷酸化蛋白质组学鉴定结果 |
| 3.1.1 组学数据初步统计分析 |
| 3.1.2 本次研究新鉴定到的磷酸化蛋白 |
| 3.2 磷酸化位点的特征分析 |
| 3.2.1 磷酸化位点所处motif分析 |
| 3.2.2 磷酸化位点与保守结构域的位置关系分析 |
| 3.2.3 表面可及性与二级结构预测 |
| 3.3 磷酸化蛋白质的功能分析 |
| 3.3.1 功能分析及亚细胞定位 |
| 3.3.2 磷酸化修饰的转录因子、激酶、磷酸酶 |
| 3.4 WT与fl间差异表达的磷酸化蛋白质 |
| 3.4.1 筛选差异表达的磷酸化蛋白质 |
| 3.4.2 过表达分析 |
| 3.4.3 EPS15: Epidermal growth factor receptor substrate 15 |
| 3.4.4 查找拟南芥同源 |
| 3.5 信号通路分析 |
| 3.5.1 油菜素内酯(BRs)信号通路分析 |
| 3.5.2 RBR1参与的核内复制信号通路分析 |
| 第四章 蛋白质组学数据分析结果 |
| 4.1 定量数据的聚类分析 |
| 4.2 转录组定量与蛋白质组定量的联合分析 |
| 4.2.1 定量数据相关性分析 |
| 4.2.2 qPCR定量与质谱定量联合分析 |
| 4.3 棉花纤维发育相关基因的定量分析 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）陆地棉DAD基因启动子序列变异对其驯化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 启动子概述 |
| 1.1.1 启动子的概念与主要结构 |
| 1.1.2 启动子的类型 |
| 1.1.3 启动子的主要研究方法 |
| 1.2 DAD基因简述 |
| 1.2.1 细胞凋亡简介 |
| 1.2.2 DAD基因的研究进展 |
| 1.2.3 DAD基因的主要功能 |
| 1.3 棉花概述 |
| 1.4 本研究的技术路线 |
| 第二章 植物DAD基因的结构与系统发育分析 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 DAD序列收集与基因结构 |
| 2.1.2 DAD系统发育关系 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 DAD基因的结构与定位 |
| 2.2.2 DAD基因的系统发育关系分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 陆地棉各器官中DAD基因表达的相对定量 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 DAD1和DAD2在陆地棉叶中的表达 |
| 3.3.2 DAD1和DAD2在陆地棉花瓣中的表达 |
| 3.3.3 DAD1和DAD2在陆地棉种子中的表达 |
| 3.3.4 DAD1和DAD2在陆地棉种子纤维中的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 陆地棉DAD2启动子的克隆 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株与载体 |
| 4.1.3 药品试剂 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.1.5 主要溶液与培养基的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 棉花总DNA的提取 |
| 4.2.2 DAD2基因启动子的引物设计 |
| 4.2.3 DAD2基因启动子的PCR扩增 |
| 4.2.4 DAD2基因启动子的纯化回收 |
| 4.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 4.2.6 DAD2基因启动子与T载体连接 |
| 4.2.7 连接产物转化大肠杆菌 |
| 4.2.8 单克隆菌体的PCR检测及测序 |
| 4.2.9 DAD2基因启动子序列的生物信息学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 棉花总DNA的提取 |
| 4.3.2 DAD2基因启动子PCR扩增 |
| 4.3.3 DAD2基因启动子克隆测序 |
| 4.3.4 DAD2基因启动子序列的序列分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 陆地棉DAD2启动子上序列差异对基因表达的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株与载体 |
| 5.1.2 药品试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 主要溶液与培养基的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 重组质粒的提取 |
| 5.2.2 DAD2基因启动子与GUS融合基因植物表达载体的构建 |
| 5.2.3 农杆菌感受态的制备 |
| 5.2.4 重组质粒转化农杆菌 |
| 5.2.5 单克隆菌体挑取,培养及PCR检测 |
| 5.2.6 烟草的种植 |
| 5.2.7 烟草的侵染 |
| 5.2.8 GUS组织化学染色与观察 |
| 5.2.9 GUS酶活测定 |
| 5.2.10 棉花总RNA的提取 |
| 5.2.11 总RNA的质量的检测 |
| 5.2.12 RNA反转录 |
| 5.2.13 荧光定量PCR的引物设计 |
| 5.2.14 荧光定量PCR的引物检测 |
| 5.2.15 荧光定量PCR的扩增体系及程序 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 质粒的提取 |
| 5.3.2 表达载体的构建及鉴定 |
| 5.3.3 重组质粒转化农杆菌的鉴定 |
| 5.3.4 GUS组织化学染色结果分析 |
| 5.3.5 GUS酶活测定结果分析 |
| 5.3.6 总RNA的提取 |
| 5.3.7 荧光定量PCR引物的检测 |
| 5.3.8 DAD2基因在陆地棉叶片中的相对表达 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 在读研究生期间发表的学术论文及研究成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）棉花纤维起始发育基因Li3的图位克隆和功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文所用主要缩略词 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 棉花纤维突变体的研究进展 |
| 1 无短绒有长绒突变体的研究进展 |
| 2 无短绒无长绒突变体研究进展 |
| 3 极端纤维突变体研究进展 |
| 第二章 棉纤维起始的相关基因研究进展 |
| 1 植物表皮毛的发育模型 |
| 1.1 调控表皮发育的正向调控因子 |
| 1.2 表皮毛发育的负向调控因子 |
| 2 棉花纤维细胞发育概述 |
| 3 棉纤维初始发育相关基因 |
| 下篇 研究报告 |
| 第三章 棉花纤维起始基因Li3的精细定位和功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及表型观察 |
| 1.2 定位群体的构建 |
| 1.3 纤维性状调查 |
| 1.4 棉花DNA的提取 |
| 1.5 SSR引物的开发与标记分析 |
| 1.6 分离比检测 |
| 1.7 标记基因型数据收集和图谱的构建 |
| 1.8 RNA提取 |
| 1.9 细菌菌株和质粒 |
| 1.10 培养基 |
| 1.11 目的基因克隆 |
| 1.12 连接产物的转化和检测 |
| 1.13 序列分析 |
| 1.14 农杆菌的转化 |
| 1.15 亚细胞定位 |
| 1.16 部分同源基因的Pyrosequencing检测 |
| 1.17 病毒介导基因沉默(VIGS)方法 |
| 1.18 序列进化树的构建 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 实验材料表型观察 |
| 2.2 纤维突变体n_2NSM和XZ142FLM间存在隐性基因突变 |
| 2.3 纤维起始基因Li_3的精细定位 |
| 2.4 定位区间内三个候选基因在两个亲本间的序列比较 |
| 2.5 定位区间内三个候选基因在在棉花不同组织中的表达分析 |
| 2.6 定位区间内三个候选基因在两个亲本间的qPCR表达分析 |
| 2.7 候选基因GhMML4在不同材料中的基因组序列比对 |
| 2.8 候选基因GhMML4的Pyrosequencing检测 |
| 2.9 候选基因GhMML4的启动子克隆和表达活性 |
| 2.10 候选基因GhMML4的亚细胞定位 |
| 2.11 候选基因GhMML4基因的VIGS验证 |
| 2.12 MIXTA类基因家族的进化分析 |
| 2.13 MIXTA类基因在棉花,可可和葡萄间的进化关系 |
| 2.14 可可中MIXTA类基因的表达分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 调控棉花纤维起始的遗传 |
| 3.2 调控纤维起始基因的分子定位 |
| 3.3 候选基因的选择 |
| 3.4 VIGS体系的优化 |
| 3.5 验证GhMML4基因即为Li3基因 |
| 3.6 MIXTA类基因在锦葵科中的分化 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表及待发表论文 |
（7）棉花（Gossypium hirsutum）HOX4的功能及其与PA结合的调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 一、引言 |
| 1.1 拟南芥表皮毛发育 |
| 1.1.1 拟南芥表皮毛发育起始模式 |
| 1.1.2 拟南芥表皮毛发育相关的基因 |
| 1.1.3 拟南芥表皮毛发育的调控机制 |
| 1.2 棉花纤维发育 |
| 1.1.1 棉纤维发育过程 |
| 1.1.2 棉纤维发育机制 |
| 1.3 磷脂酸(PA) |
| 1.3.1 磷脂酸(PA)的结构特征 |
| 1.3.2 植物中磷脂酸(PA)水平的动态变化 |
| 1.3.3 磷脂酸(PA)的生物合成途径 |
| 1.3.4 磷脂酸(PA)的调控 |
| 1.3.5 磷脂酸(PA)的降解途径 |
| 1.3.6 磷脂酸(PA)的功能 |
| 1.3.7 磷脂酸(PA)的功能及作用机制 |
| 1.4 立题依据及研究意义 |
| 二、实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体和菌种 |
| 2.1.3 工具酶及药品试剂 |
| 2.1.4 常用储存液和缓冲液 |
| 2.1.5 本论文所用培养基 |
| 三、实验方法 |
| 3.1 GhHOX4四个截短蛋白表达载体构建 |
| 3.2 原核重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.2 重组蛋白的可溶性验证 |
| 3.2.3 重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 Lipid-Protein Blotting |
| 3.4 磷脂酸PA喷洒处理拟南芥以及叶片表皮毛洗脱 |
| 3.5 CTAB法提取棉花基因组DNA |
| 3.6 PCR检测GhHOX4转基因棉花gDNA |
| 3.7 GhHOX4转基因棉花表达分析 |
| 3.7.1 棉纤维材料收取 |
| 3.7.2 棉纤维RNA提取 |
| 3.7.3 棉纤维RNA完整性、浓度检测及逆转录 |
| 3.7.4 PCR检测cDNA的质量 |
| 3.7.5 qRT-PCR分析表达量 |
| 3.8 棉花离体胚珠培养 |
| 四、实验结果 |
| 4.1 pH对PA与GhHOX4体外互作的影响 |
| 4.2 GhHOX4关键结构域分析及截短蛋白片段的设计 |
| 4.3 GhHOX4截短蛋白片段的表达纯化 |
| 4.3.1 GhHOX4截短蛋白表达载体构建 |
| 4.3.2 GhHOX4-HD-MBP融合蛋白诱导及纯化 |
| 4.3.3 GhHOX4-ZLZ-His融合蛋白诱导及纯化 |
| 4.3.4 GhHOX4 START-MBP融合蛋白诱导及纯化 |
| 4.3.5 GhHOX4 SAD-MBP融合蛋白诱导及纯化 |
| 4.4 四个GhHOX4截短蛋白与磷脂酸(PA)的互作 |
| 4.5 PA与GhHOX4互作的位点的精细化 |
| 4.5.1 GhHOX4 START区域的定点突变 |
| 4.5.2 GhHOX4-START点突变蛋白诱导 |
| 4.5.3 GhHOX4-START点突变蛋白不与PA互作 |
| 4.6 PA与GhHOX4互作对转基因拟南芥的表型影响 |
| 4.6.1 体外PA处理GhHOX4转基因拟南芥使表皮毛数量减少 |
| 4.6.2 体外PA处理GhHOX4转基因拟南芥使表皮毛四分支比例减少 |
| 4.7 GhHOX4转基因棉花的鉴定与初步分析 |
| 4.7.1 GhHOX4转基因棉花 |
| 4.7.2 gDNA水平鉴定GhHOX4转基因棉花阳性苗 |
| 4.7.3 GhHOX4 RNAi转基因棉花的表达量分析 |
| 4.7.4 GhHOX4 RNAi胚珠体外培养 |
| 4.7.5 GhHOX4 RNAi棉纤维表型分析 |
| 4.7.6 外源PA处理棉花胚珠 |
| 五、讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）棉花纤维发育起始期蛋白质组和转录组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物表皮毛发育机制 |
| 1.1.1 植物表皮毛功能 |
| 1.1.2 单细胞表皮毛调控机理 |
| 1.1.3 多细胞表皮毛调控机理 |
| 1.2 棉纤维长绒和短绒 |
| 1.3 棉纤维发育过程 |
| 1.3.1 分化起始期 |
| 1.3.2 伸长及初生壁合成期 |
| 1.3.3 次生壁加厚期 |
| 1.3.4 脱水成熟期 |
| 1.4 纤维起始期分子研究进展 |
| 1.5 蛋白质组与转录组研究进展 |
| 1.5.1 蛋白质组学研究进展 |
| 1.5.2 磷酸化蛋白质组研究进展 |
| 1.5.3 转录组学研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基于iTRAQ的蛋白质学分析棉纤维起始 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 蛋白提取、酶解、iTRAQ标记 |
| 2.2.3 数据库搜索与蛋白定量 |
| 2.2.4 iTRAQ数据分析 |
| 2.2.5 荧光定量分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 突变体形态学鉴定 |
| 2.3.2 纤维起始蛋白鉴定 |
| 2.3.3 差异表达蛋白分析 |
| 2.3.4 差异表达蛋白参与脂肪酸代谢 |
| 2.3.5 差异表达蛋白参与黄酮代谢 |
| 2.3.6 差异表达蛋白参与氨糖、核糖代谢 |
| 2.3.7 差异表达蛋白参与其他代谢途径 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 定量磷酸化蛋白质组分析棉纤维分化和起始 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 植物材料和试剂 |
| 3.2.2 扫描电镜 |
| 3.2.3 蛋白提取，酶切和iTRAQ标记 |
| 3.2.4 磷酸化肽段富集 |
| 3.2.5 质谱分析 |
| 3.2.6 库的搜索和定量 |
| 3.2.7 生物信息学和模体分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 磷酸化肽段的鉴定 |
| 3.3.2 磷酸化蛋白质组的鉴定和分类 |
| 3.3.3 磷酸化肽段模体的发掘 |
| 3.3.4 差异磷酸化蛋白分析 |
| 3.3.5 差异磷酸化蛋白参与信号转导 |
| 3.3.6 差异磷酸化蛋白参与蛋白修饰 |
| 3.3.7 差异磷酸化蛋白参与碳代谢 |
| 3.3.8 差异磷酸化蛋白参与细胞周期和细胞增殖 |
| 3.3.9 蛋白质组、磷酸化蛋白质组比较分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 RNA-seq分析棉纤维起始及相关分子标记开发 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 RNA提取及转录组测序 |
| 4.2.3 RNA-seq的有参、无参分析 |
| 4.2.4 SNPs与SSRs鉴定与验证 |
| 4.2.5 差异表达基因 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 有参比对与de novo拼接分析 |
| 4.3.2 序列注释及生物信息学分析 |
| 4.3.3 基因相关的分子标记鉴定 |
| 4.3.4 相关分子标记的验证 |
| 4.3.5 差异表达基因分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）小黑杨PsnSuSy1及PsnSuSy1、PsnSuSy2过表达烟草的次生性状研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 木材的形成 |
| 1.2.1 木材的结构与组成 |
| 1.2.2 木材的形成过程 |
| 1.2.3 植物的糖代谢过程 |
| 1.3 植物蔗糖合成酶研究进展 |
| 1.3.1 蔗糖合成酶概述 |
| 1.3.2 蔗糖合成酶(SuSy)的生物学功能 |
| 1.3.3 蔗糖合成酶(SuSy)基因的遗传转化 |
| 1.4 植物双价转基因 |
| 1.4.1 植物转基因的研究 |
| 1.4.2 植物双价转基因 |
| 1.5 本文研究目的及意义 |
| 1.6 本技术路线 |
| 2 小黑杨SuSy1的克隆及表达分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种与载体 |
| 2.1.3 试剂和药品 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小黑杨RNA的提取与纯化 |
| 2.2.2 cDNA第一链的合成 |
| 2.2.3 小黑杨SuSy1基因的克隆及pMD18-SuSy1的构建 |
| 2.2.4 小黑杨SuSy1的生物信息学分析 |
| 2.2.5 小黑杨SuSy1基因的表达特异性分析 |
| 2.2.6 小黑杨SuSy1基因的表达特异性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 小黑杨RNA的提取 |
| 2.3.2 小黑杨SuSy1基因的克隆及pMD18-SuSy1的构建 |
| 2.3.3 PsnSuSy1的生物信息学分析 |
| 2.3.4 PsnSuSy1组织特异性表达分析 |
| 2.3.5 小黑杨PsnSuSy1亚细胞定位 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 PsnSuSy1载体构建、烟草遗传转化及杂交植株的获得 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌种及载体 |
| 3.1.3 主要药品及试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 植物过表达载体ProkⅡ-PsnSuSyl构建 |
| 3.2.2 植物表达载体ProkⅡ-PsnSuSyl转化烟草 |
| 3.2.3 PsnPsnSuSy1烟草转化后验证 |
| 3.2.4 PsnSuSy1×PsnSuSy2杂交植株的获得 |
| 3.2.5 PsnSuSy1×PsnSuSy2杂交植株验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 植物过表达载体ProkⅡ-PsnSuSy1构建 |
| 3.3.2 植物表达载体ProkⅡ-PsnSuSy1烟草转基因验证 |
| 3.3.3 PsnSuSy1×PsnSuSy2杂交植株验证 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 PsnSuSy1过表达烟草及转基因杂交植株生长及次生性状研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要药品及试剂 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 过表达烟草及杂交烟草表型和生长性状分析 |
| 4.2.2 过表达烟草及杂交烟草生理生化相关分析 |
| 4.2.3 过表达烟草及杂交烟草次生生长性状的测定 |
| 4.2.4 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 过表达烟草及杂交烟草表型及生长性状分析 |
| 4.3.2 过表达烟草及杂交烟草生理生化相关分析 |
| 4.3.3 过表达烟草及杂交烟草次生生长性状分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）杀菌蛋白基因（Hcm1）和陆地棉固醇载体蛋白基因（GhSCP2D）在棉花中的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文所用主要缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 杀菌蛋白基因(HCM1)的研究进展 |
| 1 HARPIN类激发子 |
| 1.1 Harpins的一般特征 |
| 1.2 Harpins作为病原菌的致病因子 |
| 1.3 Harpins作为过敏性细胞死亡的激发子 |
| 1.4 部分Harpins可以诱导植物产生防卫反应,但是不能激发植物的过敏性反应 |
| 1.5 Harpins促进植物生长 |
| 1.6 Harpins与寄主植物的互作 |
| 2 抗菌肽(CECROPIN A)和蜂毒肽(MELITTIN)概述 |
| 2.1 家蚕抗菌肽(CecropinA) |
| 2.2 蜂毒肽(Melittin) |
| 2.3 抗菌肽(Cecropin A)和蜂毒肽(Melittin)杂交肽的植物基因工程 |
| 3 植物过敏性反应的研究进展 |
| 3.1 过敏性反应 |
| 3.2 过敏性反应的诱导 |
| 4 棉花抗枯、黄萎病研究进展 |
| 4.1 棉花枯萎病菌及其症状 |
| 4.2 棉花黄萎病菌及其症状 |
| 4.3 转基因棉花抗枯萎病和黄萎病的研究进展 |
| 第二章 固醇载体蛋白基因的研究进展 |
| 1 棉纤维伸长机制研究进展 |
| 1.1 棉纤维细胞的发育过程 |
| 1.2 控制棉纤维伸长的因素 |
| 1.3 棉纤维伸长机制假说 |
| 2 固醇载体蛋白研究进展 |
| 2.1 固醇载体蛋白简介 |
| 2.2 固醇载体蛋白的进化 |
| 2.3 固醇载体蛋白在植物中的研究进展 |
| 第三章 GHMYB9启动子的研究进展 |
| 1 MYB转录因子在棉纤维发育中的研究进展 |
| 2 植物启动子研究进展 |
| 2.1 启动子的类型及其特点 |
| 2.2 启动子的研究方法 |
| 本研究的目的和意义 |
| 1 杀菌蛋白Hcm1 |
| 2 陆地棉固醇载体蛋白基因GhSCP2D |
| 3 GhMYB9启动子 |
| 第二部分 研究报告 |
| 第四章 转杀菌蛋白基因HCM1棉花提高了枯萎病和黄萎病的抗性 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 枯萎病菌和黄萎病菌菌株的培养条件 |
| 1.3 细菌菌株和质粒 |
| 1.4 培养基 |
| 1.5 基因枪介导的瞬时表达载体在植物细胞的转化 |
| 1.6 农杆菌介导的棉花遗传转化 |
| 1.7 Southern杂交 |
| 1.8 目的蛋白的Western印迹检测 |
| 1.9 荧光实时定量RT-PCR分析 |
| 1.10 棉花黄萎病和枯萎病的室内抗性鉴定 |
| 1.1 棉花黄萎病和枯萎病的田间抗性鉴定 |
| 1.12 转基因棉农艺性状调查 |
| 1.13 微过敏检测 |
| 1.14 转基因叶片H_2O_2的测定 |
| 1.15 棉花体内黄萎病菌的定性和定量检测 |
| 1.16 原核表达 |
| 1.17 抑制真菌平板实验 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 转Hcm1基因棉花的获得 |
| 2.2 转基因植株的PCR检测和纯合株系的获得 |
| 2.3 转基因棉花染色体中Hcm1的拷贝数检测 |
| 2.4 转基因棉花中Hcm1蛋白表达检测 |
| 2.5 转Hcm1基因棉花提高了对于枯萎病和黄萎病的抗病性 |
| 2.6 转Hcm1基因棉花在大田和病圃中的主要农艺性状调查 |
| 2.7 Hcm1基因在植物细胞中的定位 |
| 2.8 转Hcm1基因棉花在生物胁迫下活性氧爆发并诱导抗病基因的表达 |
| 2.9 转Hcm1基因棉花在生物胁迫下产生微过敏性反应 |
| 2.10 转Hcm1基因棉花具有抑制黄萎病菌扩展的能力 |
| 3 讨论 |
| 3.1 Hcm1基因作用于植物细胞的膜系统 |
| 3.2 转Hcm1基因棉花可能有广谱的抗病性 |
| 3.3 Hcm1可能使植物处于一种引发态从而激发植物产生抗病性反应 |
| 3.4 Hcm1在植物体内能够抑制病菌的生长 |
| 第五章 陆地棉固醇载体蛋白基因GHSCP2D在棉花纤维发育过程中的功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 RNA的提取及定量RT-PCR验证 |
| 1.5 PCR扩增产物的电泳、回收、连接 |
| 1.6 连接产物的转化与检测 |
| 1.7 序列分析 |
| 1.8 SNP引物设计 |
| 1.9 亚细胞定位 |
| 1.10 植物表达载体的农杆菌转化 |
| 1.11 农杆菌介导的棉花遗传转化 |
| 1.12 转基因植株表达分析 |
| 1.13 转基因株系纤维品质测定 |
| 1.14 拟南芥的转化 |
| 1.15 棉花纤维细胞中单糖和总糖含量测定 |
| 1.16 棉花纤维细胞中过氧化氢(H_2O_2)含量测定 |
| 1.17 家族基因数据与分析方法 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 棉花固醇载体蛋白(GhSCP)家族基因的寻找和序列特征分析 |
| 2.2 固醇载体蛋白(SCP)的进化分析 |
| 2.3 棉花固醇载体蛋白(GhSCP)家族基因在棉花不同组织中的表达分析 |
| 2.4 棉花固醇载体蛋白(GhSCP)基因在蔗糖诱导下的表达分析 |
| 2.5 棉花固醇载体蛋白(GhSCP)基因的亚细胞定位 |
| 2.6 GhSCP2D的组成性过量表达不影响拟南芥的幼苗发育 |
| 2.7 转GhSCP2D基因棉花的获得、PCR检测和表达分析 |
| 2.8 转GhSCP2D基因棉花的纤维品质测定 |
| 2.9 转GhSCP2D基因棉花纤维中的糖含量测定 |
| 2.10 蔗糖转运蛋白在转GhSCP2D基因棉花中的表达分析 |
| 2.11 转GhSCP2D基因棉花纤维中的过氧化氢含量测定 |
| 2.12 棉花纤维发育相关基因在转GhSCP2D基因棉花中的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 棉花固醇载体蛋白基因GhSCP2D调控棉花纤维发育机制 |
| 3.2 植物在生长发育过程中,蔗糖在韧皮部中的装载存在不同的方式 |
| 3.3 过量表达GhSCP2D不影响拟南芥的幼苗发育 |
| 第六章 GHMYB9启动子在棉花中的功能分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 棉花遗传转化 |
| 1.4 定量RT-PCR |
| 1.5 GUS组织化学检测 |
| 1.6 GUS活性测定 |
| 1.7 转基因后代生长素处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GhMYB9和GhMYB7在不同组织器官中的表达分析 |
| 2.2 GhMYB9启动子序列分析 |
| 2.3 GhMYB9基因启动子的表达特性 |
| 2.4 GhMYB9启动子受生长素诱导 |
| 3. 讨论 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
四、A Suppressed Gene in Integument Cells of a Fiberless Seed Mutant in Upland Cotton（论文参考文献）
- [1]棉纤维发育相关基因的挖掘及优质转基因棉花的培育[D]. 杨江涛. 内蒙古大学, 2019(09)
- [2]细胞分裂素通过干扰胚珠表皮GhPIN3a介导的生长素不对称积累抑制棉花纤维起始[D]. 曾健晏. 西南大学, 2019(01)
- [3]海岛棉GbTCP5和GbTCP10基因的克隆和功能分析[D]. 王怡. 新疆农业大学, 2018
- [4]基于标记定量的陆地棉胚珠的磷酸化蛋白质组学研究[D]. 秦爱. 武汉大学, 2018(06)
- [5]陆地棉DAD基因启动子序列变异对其驯化的影响[D]. 梅玉芹. 曲阜师范大学, 2018(12)
- [6]棉花纤维起始发育基因Li3的图位克隆和功能验证[D]. 吴怀通. 南京农业大学, 2017(07)
- [7]棉花（Gossypium hirsutum）HOX4的功能及其与PA结合的调控研究[D]. 俛萍. 华中师范大学, 2017(02)
- [8]棉花纤维发育起始期蛋白质组和转录组学分析[D]. 马启峰. 西北农林科技大学, 2016(09)
- [9]小黑杨PsnSuSy1及PsnSuSy1、PsnSuSy2过表达烟草的次生性状研究[D]. 毕志宏. 东北林业大学, 2016(02)
- [10]杀菌蛋白基因（Hcm1）和陆地棉固醇载体蛋白基因（GhSCP2D）在棉花中的功能分析[D]. 张志远. 南京农业大学, 2015(06)