一、乳腺癌组织中金属硫蛋白表达的意义（论文文献综述）
吕美怡[1]（2021）在《姜黄素对黏液表皮样癌MEC-1细胞体外侵袭能力及MMP-9、CD44、E-cadherin表达的影响》文中认为目的:通过研究姜黄素对黏液表皮样癌MEC-1细胞体外侵袭能力及MMP-9、CD44、E-cadherin蛋白表达的影响,为姜黄素应用于黏液表皮样癌的临床治疗提供实验依据。方法:实验以黏液表皮样癌MEC-1细胞株为研究对象,复苏后进行常规体外培养,取对数生长期细胞进行实验。实验组为姜黄素组,并设立对照组（含0.1%DMSO的PBS液）。（1）采用CCK-8法检测各浓度姜黄素（5、10、20、40、80μmo1/L）分别作用于MEC-1细胞（12h、24h、36h）后的增殖抑制率。将实验数据进行整理,分析,并运用SPSS软件计算出姜黄素24h的IC30浓度值,筛选低于IC30的姜黄素浓度5、10、20μmo1/L作为后续实验浓度。（2）Transwell侵袭实验测定各浓度姜黄素（5、10、20μmo1/L）作用于MEC-1细胞24 h后,MEC-1细胞体外侵袭能力情况。（3）实时定量PCR检测各浓度姜黄素（5、10、20μmo1/L）作用于MEC-1细胞24h后,MMP-9、CD44、E-cadherin的mRNA表达水平。（4）Western blot分别检测各浓度姜黄素（5、10、20μmo1/L）作用于MEC-1细胞24h后,MMP-9、CD44、E-cadherin的蛋白表达水平。结果:（1）姜黄素作用12h、24h、36h后,随着姜黄素浓度的增加,黏液表皮样癌MEC-1细胞增殖抑制率逐渐升高（P<0.05）,姜黄素呈浓度依赖性抑制MEC-1细胞增殖。同浓度姜黄素作用下,其对MEC-1细胞的增殖抑制作用,随时间的延长而增强（P<0.05）,呈时间依赖性。（2）姜黄素作用MEC-1细胞24h后,姜黄素各组穿过微孔膜的MEC-1数目与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）,姜黄素可抑制体外培养MEC-1细胞的侵袭能力。一定浓度范围内,随着姜黄素作用浓度增加,其对MEC-1细胞侵袭抑制作用逐渐增强,呈浓度依赖性。（3）实时定量PCR检测结果发现,姜黄素作用24h后的MEC-1细胞,随着姜黄素作用浓度增加,细胞中MMP-9mRNA、CD44 mRNA的相对表达量逐渐降低（P<0.05）,E-cadherin mRNA的相对表达量逐渐升高（P<0.05）。（4）Western blot检测结果发现姜黄素作用MEC-1细胞24h后,随着姜黄素浓度的增加,MEC-1细胞侵袭转移相关蛋白MMP-9、CD44蛋白的表达量逐渐降低（P<0.05）,E-cadherin的表达量逐渐升高（P<0.05）。结论:（1）姜黄素对黏液表皮样癌MEC-1细胞的增殖具有抑制作用,并在一定范围内呈时间、浓度依赖性。（2）在一定浓度范围内,姜黄素可以抑制体外培养的MEC-1细胞的侵袭能力,并呈浓度依赖性。（3）姜黄素抑制MEC-1细胞侵袭转移的作用机制,可能与下调MMP-9、CD44及上调E-cadherin的蛋白表达水平有关。
金延玲[2]（2021）在《乳腺癌循环肿瘤细胞生物学特性及其在血液中存活的机制研究》文中提出肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要因素,目前对于肿瘤转移的分子机制仍未被阐明。循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）是脱离于肿瘤原发部位和远处转移灶进入血液中的肿瘤细胞,在远处靶器官滞留形成肿瘤转移灶。循环肿瘤细胞在血道转移中扮演了重要角色,研究循环肿瘤细胞生物学特性对于阐明肿瘤转移分子机制至关重要。目的:本课题以乳腺癌循环肿瘤细胞和黑色素瘤循环肿瘤细胞作为研究对象,体内外实验研究循环肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移、化疗药物敏感性和血液中的存活情况等生物学特性,探讨循环肿瘤细胞在血液中存活的机制;进一步阐明循环肿瘤细胞在肿瘤血道转移中的作用和相关分子机制。方法:1.4T1乳腺癌细胞建立乳腺癌原位肿瘤模型,B16黑色素瘤细胞建立黑色素瘤实验性肺脏转移模型;Ficoll密度梯度离心方法分离循环肿瘤细胞,并命名为4T1-CTCs和B16-CTCs;分别用免疫组化染色、RT-PCR检测上皮标记物和体内致瘤实验鉴定CTCs。蛋白质免疫印迹法检测CTCs中E-cadherin和Vimentin表达,流式细胞术检测CTCs上皮标记物Ep CAM和间叶标记物Vimentin阳性率,鉴定CTCs EMT不同表型。2.MTT实验和细胞克隆形成实验检测CTCs增殖和克隆形成能力;流式细胞术检测CTCs周期分布情况;蛋白质免疫印迹法检测CTCs周期相关蛋白CDK6表达;体内致瘤实验检测CTCs生长情况;免疫组织化学方法检测组织中Ki-67表达情况;MTT法检测CTCs对化疗药物敏感性。3.划痕实验和Transwell迁移实验检测CTCs迁移能力;Transwell侵袭实验检测CTCs侵袭能力;激光共聚焦显微镜检测肿瘤细胞CTCs骨架蛋白F-actin分布情况;肺脏转移实验检测CTCs肺转移情况。4.悬浮培养和流体剪切力处理细胞后检测细胞EMT标记物（E-cadherin,Ep CAM和Vimentin）表达情况。5.定量iTRAQ蛋白组学分析乳腺癌CTCs差异蛋白,使用GO数据库、KEGG数据库和String网站进行生物信息学分析;Kaplan-Merier Plotter数据库（http://kmplot.com/analysis）分析MT2与乳腺癌患者预后之间的关系;String数据库在线分析MT2与凋亡自噬相关蛋白之间的相互作用,Gene MANIA数据库分析MT2与凋亡相关信号通路相关蛋白之间的相互作用。6.流式细胞术检测CTCs血液存活情况、细胞失巢凋亡抵抗能力;剪切力诱导凋亡实验检测细胞对流体剪切力抵抗情况;Transwell趋化外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）实验检测细胞对CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞的趋化能力;流式细胞术检测细胞表面免疫逃逸相关蛋白PD-L1和CD47表达。7.蛋白质免疫印迹方法和细胞免疫组化方法检测CTCs中MT2表达水平;慢病毒干扰CTCs MT2蛋白,蛋白质免疫印迹方法检测慢病毒干扰效率、凋亡相关蛋白caspase-3和自噬相关蛋白LC3 I及LC3 II;流式细胞术检测PI阳性细胞百分比。结果:1.分离和鉴定不同EMT表型的4T1乳腺癌CTCs:建立4T1乳腺癌原位肿瘤模型30天,心脏采血后,使用Ficoll密度梯度离心分离血液中CTCs,从18只小鼠血液中分离出以上皮细胞为主的CTCs和以间叶细胞为主的CTCs,本实验中以4T1CTC-1作为上皮细胞为主CTCs的代表,4T1CTC-2作为间叶细胞为主CTCs的代表。（1）通过细胞标记物鉴定4T1乳腺癌CTCs:4T1CTC-1中Ep CAM+Vimenin+细胞占85.8%,4T1CTC-2中Ep CAM-Vimentin+细胞占69.4%;RT-PCR结果显示4T1CTC-1高表达上皮标记物（E-cadherin,Ep CAM和CK）（p<0.05或p<0.001）,4T1CTC-2低表达上皮标记物（E-cadherin,Ep CAM和CK）（p<0.001）;蛋白质免疫印迹法结果显示4T1CTC-1高表达E-cadherin和Vimentin（p<0.05）,4T1CTC-2低表达E-cadherin而高表达Vimentin（p<0.001）。证实分离的细胞来源于4T1乳腺癌,且具有不同EMT表型。（2）通过皮下成瘤能力鉴定乳腺癌CTCs:体内致瘤实验显示4T1CTC-1和4T1CTC-2均可形成肿瘤,且肿瘤组织HE染色结果显示4T1CTC-1和4T1CTC-2形成的肿瘤组织核大深染、异型明显,并且可见病理性核分裂像。皮下致瘤实验表明4T1CTCs具有致瘤能力,4T1CTC-1和4T1CTC-2均为肿瘤来源细胞。2.分离和鉴定B16黑色素瘤CTCs:使用Ficoll密度梯度离心方法分离循环肿瘤细胞,HMB45免疫组化染色B16CTCs阳性;体内致瘤实验显示B16CTCs可形成肿瘤,且肿瘤组织HE染色结果显示B16CTCs形成的肿瘤组织核大深染、异型性明显、可见病理性核分裂像。证实分离的细胞来源于B16黑色素瘤。3.CTCs对化疗药物敏感性降低:4T1CTCs表现为对表柔比星化疗药物敏感性降低（p<0.01或p<0.001）,B16CTCs表现为对顺铂化疗药物敏感性降低（p<0.05,p<0.01或p<0.001）。4.CTCs表现为体外增殖缓慢,体内肿瘤生长缓慢:与4T1原位细胞比较,4T1CTCs表现为慢的体外增殖、克隆形成和体内肿瘤生长能力（p<0.01或p<0.001）;4T1CTC-2体外增殖、克隆形成和体内肿瘤生长能力均较4T1CTC-1慢（p<0.05,p<0.01或p<0.001）;与4T1原位细胞比较,4T1CTC-1中G1期细胞多且CDK6表达低（p<0.05）。与B16亲本细胞比较,B16CTCs表现为慢的体外增殖、克隆形成和体内肿瘤生长能力,B16CTCs细胞中G1期细胞多且CDK6表达低（p<0.05或p<0.001）。5.CTCs表现为弱的侵袭迁移能力,但具有一定的肺转移能力:与4T1原位细胞比较,4T1CTCs表现为弱的体外侵袭能力和体内肺转移能力（p<0.01或p<0.001）;4T1CTC-2的体外侵袭迁移能力和体内肺转移能力均较4T1CTC-1强（p<0.01或p<0.001）。与B16亲本细胞比较,B16CTCs侵袭迁移能力弱（p<0.001）。6.悬浮培养对细胞EMT标记物无明显影响（p>0.05）,流体剪切力可以明显降低细胞上皮标记物E-cadherin和Ep CAM表达（p<0.01或p<0.001）,增加细胞间叶标记物Vimentin表达（p<0.05）。7.定量iTRAQ蛋白组学分析显示:与原位细胞比较,4T1CTC-1中有1483个蛋白下调,791个蛋白上调（fold-change<-1.5 or>1.5,p<0.05）;与原位细胞比较,4T1CTC-2中有179个蛋白下调,233个蛋白上调（fold-change<-1.5 or>1.5,p<0.05）;与4T1CTC-2比较,4T1CTC-1中有1473个蛋白下调,1006个蛋白上调（fold-change<-1.5 or>1.5,p<0.05）;4T1CTC-1中差异蛋白GO（生物学进程）主要富集在防御反应的正向调节,起始免疫反应的正向调节,41T1CTC-2中差异蛋白GO（生物学进程）主要富集在上皮细胞分化,细胞与细胞之间的连接和细胞对细胞因子刺激的反应。8.乳腺癌CTCs表现为强的血液存活能力:与4T1原位细胞和4T1肺脏转移细胞比较,4T1CTCs在血液中存活细胞数目多,表现为强的血液存活能力（p<0.05）、强的失巢凋亡抵抗能力和流体剪切力诱导凋亡抵抗能力（p<0.01）。9.4T1CTCs具有免疫逃逸表型:与4T1原位细胞和4T1肺脏转移细胞比较,4T1CTCs对CD4T淋巴细胞趋化能力强（p<0.05）,对CD8T淋巴细胞趋化能力弱（p<0.05）;与4T1原位细胞和4T1肺脏转移细胞比较,4T1CTCs中CD47表达增高（p<0.001）,PD-L1表达无明显差异（p>0.05）。10.4T1CTCs表现为高的基础自噬水平和低的凋亡水平（p<0.05或p<0.01）,且抑制4T1CTCs自噬水平可增加细胞凋亡率,抑制细胞血液存活（p<0.001）。4T1CTCs高表达MT2（p<0.01）,抑制MT2可以降低4T1CTCs自噬水平（p<0.05）、增加凋亡水平（p<0.05）和抑制细胞存活（p<0.001）;抑制MT2联合抑制细胞自噬明显抑制细胞存活（p<0.001）。结论:1.成功分离了4T1乳腺癌CTCs和B16黑色素瘤CTCs。2.4T1乳腺癌CTCs表现为不同EMT表型,提示4T1乳腺癌CTCs具有异质性。3.CTCs表现为对顺铂和表柔比星化疗药物敏感性降低、体外增殖和体内生长缓慢、体外侵袭能力和体内肺脏转移能力弱,但血液存活能力强的生物学特性。4.流体剪切力可诱导CTCs发生EMT。5.定量iTRAQ蛋白组学分析显示不同EMT表型CTCs在蛋白水平和功能富集存在明显差异。6.4T1CTCs在血液中的存活能力与细胞具有强的失巢凋亡抵抗能力、剪切力诱导凋亡抵抗能力和免疫逃逸表型有关,MT2通过调控细胞自噬和凋亡介导CTCs存活。
吴钟华[3]（2021）在《CRIP1在胃癌组织中的表达及其通过CREB1/VEGFC轴促进胃癌淋巴管新生的机制研究》文中研究表明前言:胃癌是严重影响我国居民健康的恶性疾病之一。2021年发表在“CA:A Cancer Journal for Clinicians”杂志的最新统计数据显示每年新发胃癌病例已超过100万,居所有癌种第五位;每年胃癌死亡病例约76万,列在所有癌种第四位。进展期胃癌病人预后差的主要原因是局部侵袭和淋巴结转移。淋巴结转移的发生也是胃癌远处转移的重要初始步骤。淋巴结转移是胃癌中最常见的转移方式之一,可以发生在早期胃癌中,进展期胃癌中更易见。胃癌病人存在淋巴结转移与其治疗方式选择及病人预后密切相关。现有研究证据表明,原发肿瘤及局部淋巴结中存在新生的淋巴管,能够在一定程度上促进肿瘤转移。肿瘤中淋巴管生成主要是指原发癌灶、癌旁或远处转移等部位在原有淋巴管基础上产生新的淋巴管的过程,包括淋巴管的增生和增大。研究表明,淋巴管生成在胃癌、结直肠癌、乳腺癌、食管癌等多种癌症中均与肿瘤转移或预后相关。CRIP1（富含半胱氨酸的肠蛋白1）是含LIM结构域的蛋白家族成员之一,在多种肿瘤中存在异常表达。目前已经发现CRIP1在宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌等多癌种中高表达。CRIP1可以激活Wnt/β-catenin通路促进c-myc、cyclin D-1和β?catenin蛋白的表达进而调控EMT促进肿瘤细胞的侵袭与转移;转运锌离子到细胞内促进GSK-3β磷酸化激活GSK-3β/m TOR信号通路诱导EMT;促进Fas蛋白的降解从而提高癌细胞对氟尿嘧啶的耐受能力。此外,也有研究显示CRIP1在乳腺癌与食管鳞状细胞癌中发挥抑癌作用,CRIP1可以降低MAPK与Akt的磷酸化、增加cdc2的磷酸化从而抑制肿瘤细胞的增殖。与此同时,很多研究报道了肿瘤组织中CRIP1的高表达与淋巴结转移密切相关。本研究中,我们应用高通量基因芯片检测10对胃癌及配对癌旁组织中的m RNA表达谱,寻找到胃癌淋巴结转移的相关标志物CRIP1。我们接下来应用一系列体内外的功能实验探索了CRIP1基因在胃癌中的功能及其可能的作用机制。研究方法:1、运用定量PCR及免疫组化分别检测胃癌组织及癌旁组织中CRIP1m RNA和蛋白的表达。2、western blot:应用凯基生物公司的全蛋白提取试剂盒提取胃癌细胞蛋白,应用BCA蛋白定量法进行蛋白定量。进一步利用western blot检测各实验组之间蛋白的差异表达。3、增殖相关检测方法:应用CCK8、EDU增殖检测、集落形成等增殖相关检测方法体外探索增殖能力改变,并且利用裸鼠皮下成瘤实验在体内水平检测基因对于增殖的调控作用。4、侵袭转移相关实验:Transwell实验检测CRIP1等基因对于胃癌细胞迁移、侵袭能力的调控作用。5、利用尾静脉注射肿瘤细胞,构建肺转移模型,在体内水平检测基因对于胃癌细胞转移能力的调控作用;构建腘窝淋巴结转移模型检测各干预组之间对于淋巴结转移的影响。6、统计学分析:所有统计学分析都基于SPSS第19版软件及Graph Pad Prism第八版软件完成。应用秩和检验分析CRIP1在胃癌组织和癌旁非癌组织中的差异表达。采用卡方检验分析比较CRIP1表达与临床病理特征之间的关系。结果:1、利用高通量芯片技术在10对胃癌及癌旁组织中筛选差异表达的基因,我们发现CRIP1在胃癌组织中的表达显着高于癌旁非癌组织、且在淋巴结转移阳性胃癌组织中表达明显高于未发生淋巴结转移的胃癌组织（Fold change>2.0,p<0.05）。在本单位胃癌生物样本库,进一步运用定量PCR验证了CRIP1 m RNA在胃癌组织中的高表达（p=0.037）,并且CRIP1高表达与淋巴结转移阳性正相关（p=0.034）。与此同时,运用免疫组化实验在大规模的胃癌组织芯片标本中验证CRIP1蛋白的表达,发现CRIP1蛋白在胃癌组织中表达明显高于正常组织（p<0.0001）,并且CRIP1高表达与淋巴结转移（p<0.001）、T分期（p<0.001）以及TNM分期（p<0.001）显着相关。这些结果提示CRIP1可能是胃癌中的重要生物标志物,可以作为淋巴结转移的标志物。2、运用淋巴管形成实验以及皮下成瘤组织淋巴管密度检测CRIP1对于淋巴管新生的调控作用,证实CRIP1在体内体外可以促进淋巴管新生。构建腘窝淋巴结转移模型观察CRIP1对于体内淋巴结转移形成的影响,发现过表达CRIP1能够显着增大淋巴结的体积（p=0.0003）以及淋巴结转移率（80%VS 40%）;敲减CRIP1能够显着抑制淋巴结的体积（p=0.0037）以及淋巴结转移率（0%VS 40%）。进一步利用增殖、侵袭相关功能实验证实过表达CRIP1能够促进胃癌细胞的增殖、侵袭与迁移,相反,敲减CRIP1则抑制上述表型。体内皮下成瘤实验结果发现过表达CRIP1能够促进皮下成瘤的生长（p=0.026）以及成瘤的最终质量（p=0.028）;敲减CRIP1则抑制皮下成瘤的生长（p=0.042）以及成瘤的最终质量（p=0.034）。尾静脉肺转移模型实验结果发现CRIP1能够促进肺转移的形成。3、ELISA实验结果显示过表达CRIP1能够增加胃癌细胞培养基上清中VEGFC水平（p=0.0085）,敲减CRIP1则抑制VEGFC的分泌（p=0.0028）。进一步运用定量PCR和western blot实验证实CRIP1能在RNA和蛋白层面提高细胞内VEGFC的表达水平。接下来运用免疫沉淀联合质谱分析寻找CRIP1可能互作的蛋白,质谱数据显示CRIP1与CREB1具有相互作用,Co-IP实验结果证实CRIP1与CREB1可以相互作用。Western blot实验结果显示CRIP1可以提高CREB1蛋白133位丝氨酸磷酸化水平,改变CREB1的转录活性。我们进一步在CRIP1过表达细胞中敲减CREB1的表达,发现其能够逆转CRIP1促进CREB1磷酸化和VEGFC的水平。相反,在敲减CRIP1的细胞中过表达CREB1也能恢复CRIP1的作用。结论:1、CRIP1在10对胃癌及配对癌旁组织基因芯片结果中呈现高表达,且在淋巴结转移阳性胃癌组织中显着高于未发生淋巴结转移的胃癌组织。在本单位大规模胃癌组织标本验证中,相比于癌旁非癌组织,CRIP1 m RNA和CRIP1蛋白在胃癌组织中明显高表达。病理特征分析显示CRIP1高表达与胃癌淋巴结转移阳性呈现正相关,CRIP1高表达胃癌病人发生淋巴结转移比例越高。2、CRIP1在体外、体内促进胃癌细胞的增殖、侵袭,同时增加淋巴管新生、淋巴结转移。机制上,CRIP1通过与CREB1互作,提高其磷酸化水平及转录活性,在蛋白和RNA水平上调VEGFC水平。
许霞青[4]（2020）在《PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究》文中认为研究背景:卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,其发病率在我国位居第三位仅次于宫颈癌和宫体癌,严重影响人类健康。近年来,ADP核糖聚合酶（Poly ADP-ribose Polymerase,PARP）抑制剂在卵巢癌的治疗中取得显着成效,开启了小分子抑制剂靶向治疗卵巢癌的大门。目前,PARP抑制剂主要被批准用于BRCA（Breast cancer）突变的卵巢癌患者。然而,随着临床试验数据的累积,研究者发现不论患者是否存在BRCA突变,使用PARP抑制剂Niraparib Rucaparib治疗的卵巢癌患者均能获益,显着改善了患者的无疾病生存期。因此,如何从PARP1（Poly ADP-ribose Polymerase 1）的生物学功能出发理解临床上这一现象成为该领域的研究热点。随着PARP1研究的深入关于它的其他生物学功能也开始受到关注。近年来的研究发现PARP1可以通过激活转录因子、抑制转录因子活性的方式或直接作为转录因子调控基因表达,从而调控肿瘤细胞的多种生物学功能。本研究通过分析TCGA数据库（The cancer genome atlas）发现PARP1 m RNA高度表达与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+（Estrogen receptor-positive）乳腺癌以子宫体癌患者的无疾病生存期（Progress free survival,PFS）呈显着负相关,并将这四种肿瘤中与无疾病生存期相关的基因进行重合分析,发现91个基因的表达与PARP1 m RNA的高度表达呈负相关。同时,在卵巢癌细胞上分别敲除PARP1、过表达PARP1和给予PARP抑制剂Olaparib,采用全基因组芯片检测基因变化,发现13个基因与PARP1的高度表达呈显着负相关。进而将从TCGA数据分析获得的91个基因与芯片分析获得的13个基因进行重合对比分析,发现PARP1蛋白表达与金属硫蛋白-1M（Metallothionein 1M,MT1M）基因转录呈显着负相关,这提示MT1M可能是PARP1调控的靶基因。那么,PARP1是否通过负性调控MT1M,从而调控卵巢癌的哪些生物学行为?金属硫蛋白-1M（MT1M）是半胱氨酸富集的小分子蛋白,属于金属硫蛋白（MT-1）家族成员,特异性结合金属离子,在金属解毒氧化应激保护方面发挥重要作用。近年来研究表明MT1M能够显着抑制多种肿瘤的增殖与转移,如肝细胞癌、甲状腺乳头状癌,是潜在的抑癌基因。考虑到MT1M在肿瘤细胞中抑制肿瘤细胞增殖与转移的作用,本研究推断PARP1可能通过负性调控MT1M参与肿瘤细胞的增殖与转移。本研究将围绕PARP1负性调控MT1M表达这一生物学现象,考察PARP1负性调控MT1M在卵巢癌增殖与转移中的作用具体的分子机制:（1）分析TCGA数据库中PARP1 m RNA的高度表达与多种肿瘤无疾病进展期的相关性,结合卵巢癌细胞基因芯片的数据,发现PARP1负性调控卵巢癌细胞中MT1M的表达;（2）明确MT1M的表达对卵巢癌细胞增殖与迁移的影响,并寻找PARP1调控MT1M表达的具体分子机制;（3）MT1M的表达在PARP抑制剂抗卵巢癌转移的作用。本研究发现了PARP1新的靶基因MT1M以调控卵巢癌转移的新机制即PARP1通过抑制MT1M表达促进卵巢癌转移,并为PARP抑制剂在卵巢癌治疗中的应用提供新的理论依据。第一部分PARP1抑制MT1M转录促进卵巢癌转移的作用研究研究方法:（1）采用TCGA数据库分析在PARP1 m RNA表达与与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌、子宫体癌、膀胱癌、睾丸生殖细胞肿瘤、头颈鳞状细胞癌、以胰腺导管腺癌患者的无疾病生存期的相关性;（2）进一步采用Kmplot数据库分析,找到与PARP1 m RNA表达呈负相关性的基因;（3）在非BRCA突变的卵巢细胞OVCAR8上分别敲除PARP1、过表达PARP1和给予PARP抑制剂Olaparib,采用全基因芯片检测基因变化,寻找与PARP1表达呈负相关的基因;（4）将TCGA数据库分析出与PARP1表达呈负相关的基因,与卵巢癌细胞OVCAR8中与PARP1表达呈负相关的基因进行重合对比分析,发现了PARP1调控新的靶基因MT1M;（5）在非BRCA突变的卵巢癌SKOV3、Ca OV3和OVCAR8,沉默PARP1,采用Western blotting法、荧光实时定量PCR法以Elisa法验证PARP1对MT1M表达的影响。（6）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3中过表达MT1M,采用SRB实验考察过表达MT1M对卵巢癌细胞增殖的影响;（7）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3中过表达MT1M或敲除MT1M,采用Transwell实验和划痕愈合实验考察MT1M的表达对卵巢癌细胞迁移的影响;（8）在SKOV3细胞中过表达MT1M,并收集上清作条件培养基,考察MT1M的分泌对卵巢癌细胞迁移的影响;（9）在卵巢癌细胞OVCAR8上过表达PARP1,采用划痕实验考察PARP1的高度表达对卵巢癌细胞迁移的影响;同时在SKOV3和Ca OV3上敲除PARP1,采用Transwell实验考察沉默PARP1对卵巢癌细胞迁移的影响。研究结果:（1）PARP1 m RNA表达与与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌、子宫体癌等的无疾病生存期呈负相关。而PARP1 m RNA的表达与膀胱癌、睾丸生殖细胞肿瘤、头颈鳞状细胞癌、以胰腺导管腺癌患者的无疾病生存期没有明显的相关性。（2）采用Kmplot数据库分析卵巢癌、子宫体癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌,这四种肿瘤中与PARP1表达呈负相关的基因,发现91个基因与PARP1的表达呈负相关。（3）在卵巢癌细胞OVCAR8上,分析过表达PARP1转录表达显着降低的基因,沉默PARP1转录表达显着增加的基因以给予Olaparib转录表达显着增加的基因,发现13个基因与PARP1的表达呈负相关。（4）对比重合分析TCGA数据库得到的91个基因与卵巢癌细胞OVCAR8基因芯片得到的13个基因,发现了与PARP1表达呈负相关的靶基因-MT1M。（5）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3和OVCAR8,沉默PARP1,MT1M的转录表达显着增加,其蛋白表达也显着增加。同时发现敲除PARP1,能够促进MT1M的分泌。（6）过表达MT1M不影响卵巢癌细胞的增殖。在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3上,过表达MT1M,通过SRB法检测细胞增殖,结果显示MT1M的高度表达对卵巢肿瘤细胞增殖没有影响。（7）MT1M的表达可影响卵巢癌细胞的迁移。在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3上,过表达MT1M能够显着抑制卵巢癌细胞的迁移;而敲除MT1M,SKOV3的迁移能力显着增强。（8）MT1M的分泌可影响卵巢细胞的迁移。在SKOV3上,首先过表达MT1M,并收集过表达成功后的细胞上清作为条件培养基,再通过Traswell法发现过表达MT1M的条件培养基可显着抑制SKOV3细胞的迁移。（9）PARP1的表达可影响卵巢癌细胞的迁移。在卵巢癌细胞OVCAR8上,过表达PARP1,通过划痕实验法发现PARP1的高度表达可显着抑制卵巢细胞迁移;而敲除PARP1则明显抑制卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3的迁移能力。第二部分PARP1抑制卵巢癌MT1M转录的分子机制研究研究方法:（1）采用数据库预测分析潜在调控MT1M表达的转录因子,采用q RT-PCR实验考察在卵巢癌细胞SKOV3中,沉默预测的转录因子在Olaparib上调MT1M转录表达中的作用,筛选到转录因子FOXP3（Forkhead box 3）;（2）考察FOXP3的表达对MT1M转录表达蛋白表达的影响;（3）采用免疫共沉淀方法,考察PARP1与FOXP3的结合情况;（4）采用检测PAR修饰的实验方法,考察PARP1对FOXP3核糖基化修饰的情况;（5）采用检测PAR修饰的实验方法,考察给予Olaparib对PARP1核糖基化FOXP3的影响;（6）采用核糖基化位点突变的PARP1（Flag-PARP1-E988K）,考察位点突变Flag-PARP1-E988K对FOXP3核糖基化修饰的影响;（7）采用荧光素酶报告基因法,考察PARP1和Flag-PARP1-E988K对FOXP3介导的MT1M转录表达的影响;（8）采用Western blotting实验方法考察在卵巢癌细胞OVCAR8上,给予Olaparib和敲除PARP1对FOXP3蛋白表达的影响。研究结果:（1）PARP1通过FOXP3调控MT1M的转录首先,采用数据库预测分析MT1M潜在的转录因子,发现STAT1、STAT3、FOXP3和E2F1等转录因子可能是调控MT1M表达的转录因子,进一步采用q RT-PCR实验考察在卵巢癌细胞SKOV3中,沉默这些转录因子考察其在Olaparib上调MT1M转录表达中的作用,筛选到转录因子FOXP3即沉默FOXP3,Olaparib上调MT1M的作用消失。（2）FOXP3调控MT1M的转录表达蛋白表达在SKOV3细胞中过表达FOXP3和敲除FOXP3,采用western blotting和q RT-PCR实验方法考察过表达FOXP3和沉默FOXP3对MT1M转录蛋白表达的影响,发现过表达FOXP3能够显着增加MT1M的转录水平和蛋白水平;而敲除FOXP3则明显下调MT1M的转录蛋白水平。（3）PARP1与FOXP3直接结合。在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,采用免疫沉淀的方法,发现PARP1与FOXP3之间存在结合。（4）PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,采用检测PAR修饰的方法,发现PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰。（5）Olaprib能够抑制由PARP1介导FOXP3发生核糖基化修饰在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,并给予Olaparib作用6h,采用检测PAR修饰的方法,发现给予PARP抑制剂Olaparib后则抑制PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰。（6）核糖基化活性突变的质粒Flag-PARP1-E988K不能使FOXP3发生核糖基化修饰。同时在293T细胞上,过表达Flag-PARP1-E988K和HA-FOXP3,采用检测PAR修饰的方法,发现Flag-PARP1-E988K不能使FOXP3发生核糖基化修饰。（7）PARP1通过调控FOXP3的核糖基化修饰从而调控MT1M的转录表达。在卵巢癌细胞SKOV3上,过表达Vector、HA-FOXP3、Flag-PARP1、Flag-PARP1-E988K、HA-FOXP3+Flag-PARP以HA-FOXP3+Flag-PARP1-E988K,采用荧光素酶报告基因法,发现HA-FOXP3促进MT1M的转录表达,而PARP1则抑制由FOXP3介导的MT1M的转录表达;PARP1-E988K由于其核糖基化功能缺失不影响由FOXP3介导的MT1M的转录表达。（8）在卵巢癌细胞中,给予Olaparib以沉默PARP1对FOXP3表达的影响在卵巢癌细胞OVCAR8上,给予Olaparib,发现FOXP3的蛋白表达随着Olaparib浓度的增加而增加;而在SKOV3和Ca OV3上敲除PARP1,则促进FOXP3的蛋白表达。第三部分PARP抑制剂促进MT1M表达抗卵巢癌转移的作用研究研究方法:（1）在卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR8中,给予不同浓度的Olaparib,采用Western blotting法、q RT-PCR法以Elisa法来考察Olaparib对MT1M蛋白表达、转录表达以分泌的影响;（2）在卵巢细胞SKOV3和Ca OV3上,给予不同的PARP抑制剂Olaparib、Veliparib和Niraparib,采用划痕愈合实验和Transwell小室法来考察不同的PARP抑制剂对卵巢细胞迁移的影响;（3）采用慢病毒构建MT1M稳定敲除的卵巢癌细胞SKOV3（sh-MT1M）,再给予PARP抑制剂Olaparib,考察MT1M在PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞迁移中的作用;（4）采用尾静脉接种Ca OV3形成转移的裸鼠模型,给予Olaparib,考察PARP抑制剂对卵巢癌细胞转移的影响;（5）采用人源高转移卵巢癌PDX模型,通过腋下接种方式,并给予Olaparib,考察Olaparib对卵巢癌转移的影响,以MT1M在PARP抑制剂抗肿瘤转移中的作用。研究结果:（1）PARP抑制剂可以上调卵巢癌细胞MT1M转录表达以分泌在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3和OVCAR8上,给予浓度梯度的Olaparib,Western blotting法和q RT-PCR法检测MT1M的表达分泌,发现Olaparib浓度依赖上调MT1M的转录蛋白表达。同时给予不同的PARP抑制剂,采用Elisa法检测对MT1M分泌的影响,发现这些PARP抑制剂均能促进MT1M的分泌。（2）不同的PARP抑制剂均能明显抑制卵巢癌细胞的迁移在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3,采用划痕愈合实验和Transwell小室法,考察不同抑制剂对卵巢癌细胞迁移的影响。结果显示不同的PARP抑制剂均能显着抑制卵巢癌细胞的迁移。（3）敲除MT1M能够显着抑制PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞迁移的能力构建稳定敲除MT1M的卵巢癌细胞株,在此基础上给予Olaparib作用,采用Transwell法检测对卵巢癌细胞迁移的影响。结果显示,敲除MT1M的卵巢癌细胞的迁移能力明显增强,而在敲除MT1M的卵巢癌细胞中给予Olaparib,发现Olaparib抑制卵巢癌细胞迁移的作用消失。（4）体内动物实验显示Olaparib可以显着卵巢癌转移,并促进MT1M的表达在尾静脉接种Ca OV3卵巢癌转移模型中,H&E染色结果显示Olaparib明显抑制肺内肿瘤转移灶点的形成。采用Elisa法检测血清中的MT1M,发现Olaparib促进MT1M的分泌。在人源高转移卵巢癌PDX模型,Olaparib抑制剂不影响肿瘤的生长。采用包氏固定法以H&E染色结果显示,Olaparib可以抑制卵巢细胞的肺转移。采用Western blotting法、q RT-PCR法以Elisa法来考察Olaparib对肿瘤内MT1M蛋白表达、转录表达以分泌的影响,结果显示Olaparib可以上调肿瘤内MT1M的转录表达以蛋白表达,并促进MT1M的分泌。研究结论:本研究发现PARP1新的靶基因MT1M,且在卵巢癌细胞中PARP1负性调控卵巢癌细胞MT1M的表达;而MT1M的高度表达能够抑制卵巢癌细胞迁移但不影响肿瘤细胞增殖;进一步研究发现FOXP3调控MT1M的表达并参与PARP1负性调控MT1M的转录表达,即PARP1与FOXP3结合使FOXP3发生核糖基化修饰,抑制FOXP3的转录活性,进而抑制MT1M的转录表达。体内动物实验验证了PARP抑制剂Olaparib确实能够抑制卵巢癌细胞的转移,促进肿瘤细胞表达MT1M。本研究不仅发现了调控卵巢癌转移的新机制,也为PARP抑制剂在卵巢癌治疗中的应用提供新的理论依据。
徐伟[5]（2020）在《金属硫蛋白1M通路与非小细胞肺癌关系的研究》文中指出【研究目的】1、利用实时荧光定量PCR与Western Blot分析,金属硫蛋白1M（MT1M）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达特征。2、利用细胞增殖能力、细胞侵袭以及细胞迁移实验等研究,分析MT1M在NSCLC中的作用。研究MT1M参与肺癌形成的机制,为治疗药物研发提供新的研究方向。3、生物信息学分析筛选,MT1M表达所受转录调控因子调控的信号通路。研究MT1M构成的信号通路是否影响了NSCLC细胞增殖和细胞迁移,并探讨其可能的作用机制。【研究方法】通过基因芯片数据分析差异表达的基因,筛选出MT1M（GSE81292）在肺腺癌（LUAD）中呈现出低表达。我们收集了6例肺腺癌患者的癌组织与癌旁组织,分别运用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和Western Blot技术,在转录水平和蛋白水平层面检测MT1M的表达量。进一步我们选取了NSCLC细胞株A549进行MT1M相关功能实验研究,在A549细胞中转染MT1M质粒,分别检测过表达MT1M后的细胞,对细胞增殖、细胞侵袭以及细胞迁移愈合能力的影响,以及高表达MT1M后对其他凋亡蛋白表达量的检测。我们通过基因相关性分析,MT1M基因的上游信号通路为p53,与MT1M基因启动子有结合位点。通过对A549分别转染MT1M质粒、p53抑制剂以及MT1M和p53抑制剂联合,验证细胞增殖能力、细胞侵袭以及细胞迁移愈合能力,同时对转染组细胞进行细胞相关迁移蛋白的检测。由于鼠双微体2（MDM2）对p53有调控作用,且在NSCLC中高表达,故排除其对p53的影响。首先,我们在A549细胞中敲低MDM2的表达,验证转染细胞株相关的细胞增殖能力、细胞侵袭和细胞迁移愈合能力;然后,对MDM2敲低组细胞联合MT1M过表达,验证细胞的增殖能力、细胞侵袭和细胞迁移愈合能力,以及对其他一些相关的细胞迁移蛋白表达量的检测;最后,进行免疫组化和免疫共沉淀实验验证MT1M、p53和MDM2蛋白之间是否存在调控作用。【研究结果】1、MT1M在NSCLC中的作用通过细胞转染MT1M质粒,培养48h后细胞增殖能力较对照组有所降低,继续培养72h后,实验组细胞的增殖能力则显着降低;实验组细胞的迁移愈合能力和细胞侵袭能力,均较对照组显着降低。Western Blot结果亦显示,在转染MT1M质粒的实验组细胞中,细胞迁移相关蛋白（MMP2、MMP9、MMP14）的表达量下降。2、p53对MT1M的调控p53可与MT1M启动子结合,加强MT1M双荧光素酶的荧光强度。抑制p53的功能,可拮抗过表达MT1M对细胞增殖、细胞迁移愈合能力和细胞侵袭能力的抑制作用。3、MDM2对p53-MT1M的调控在细胞中,敲低MDM2联合高表达MT1M后,对细胞增殖、细胞迁移愈合能力和细胞侵袭能力具有协同抑制作用。【结论】1、MT1M在NSCLC中低表达,且具有抑制肿瘤细胞活性的作用,可以考虑作为治疗的新靶点。2、MT1M基因的启动子序列存在和p53结合的位点,受到p53调控参与细胞增殖与迁移过程。3、MDM2-p53-MT1M构成的信号通路,与NSCLC细胞增殖和迁移能力密切相关。
甘俊英[6]（2020）在《重组人金属硫蛋白Ⅲα短肽一般毒性评价及功能研究》文中研究指明随着生活节奏加快和环境中污染物的增多,人们经常处于紧张和压力的亚健康状态,此外饮食习惯发生变化、大气层破坏导致紫外线辐射对人类健康造成威胁以及医药品的过度使用,使机体抵抗氧化损伤能力下降,超氧化物的侵袭超过机体耐受程度,最终出现炎症、衰老及代谢调节功能的紊乱,甚至诱发基因突变和癌症。目前对于过氧化和脂质过氧化反应引起的疾病研究,已成为人类对健康的新诉求。而另一重要方面则是环境中有害重金属蓄积所带来的严重后果,危及人类及动植物,亟待解决。金属硫蛋白（metallothionein,MT）是一类富含半胱氨酸、相对分子质量小（6-7k Da）可结合金属的蛋白,生物界中广泛存在,独特的结构使MT具有结合金属功能,包括镉,银,锌,铅,铁等。MT通过结合金属离子从而降低重金属蓄积对机体的毒害,起到调节机体功能维持机体生理稳态的作用。有研究认为,MT还具有清除活性氧（reactive oxygen species,ROS）的功能,但其作用机制仍不明确,一般认为其可以通过清除体内过多的自由基,从而降低机体氧化损伤程度。安全性评价是化学物应用的基础与保障,随着MT研究的发展,其毒性评价远远落后于MT的应用开发及功能,加之MT新制备方式的出现使产品本身更具多样化。本研究使用的重组人金属硫蛋白-Ⅲα短肽（Rrecombinant Human Mmetallothionein Ⅲ-α,rh-MT-Ⅲα）为基因工程技术制备的新MT短肽,该技术解决了原始生产方式制备的MT产量供应不足的问题,但作为新化学物,缺乏基本的毒性及功能评价,故迫切需要对这一有希望的领域进行进一步的研究。在进行实验研究前,通过文献检索与分析了解了MT在医药化妆品领域相关应用和效果,梳理国内外MT实验室反馈资料时发现,目前MT的主要获取方式为动物肝组织提取,纯度低,产品单一性差,安全性评价相关研究较少。根据MT实验室研究进展及产品市场情况,本研究选取重组人金属硫蛋白-Ⅲα短肽（Rrecombinant Human Mmetallothionein Ⅲ-α,rh-MT-Ⅲα）作为研究对象,这类基因工程制备的MT短肽纯度高,产品单一性好,并且与人体具有高度同源性,分子量小更易被吸收的特点为其未来在医药化妆品等领域的应用奠定了基础。本研究首先以细胞和线虫两种模型综合探究rh-MT-Ⅲα的一般毒性,在功能研究方面,利用化学共孵育的方法,评价了rh-MT-Ⅲα体外自由基清除能力,进一步选用人永生化表皮（Ha Ca T）细胞,建立紫外线损伤细胞模型后用rh-MT-Ⅲα处理,进行rh-MT-Ⅲα抗氧化损伤功能细胞水平评价。在前期实验基础上,以20 nm的纳米银（Ag NPs）和不同浓度rh-MT-Ⅲα共同处理线虫,进行rh-MT-Ⅲα重金属解毒功能的初探。主要研究内容和结果如下:1.rh-MT-Ⅲα细胞毒性评价:利用Ha Ca T细胞和L929细胞,经不同浓度（25～400μg/m L）rh-MT-Ⅲα染毒24小时后,检测两种细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）释放率、细胞形态及细胞凋亡率,以探讨rh-MT-Ⅲα的细胞毒性。（1）细胞存活率结果显示,与对照组相比,实验组两种细胞存活率无明显改变。在400μg/m L剂量下,细胞存活率稍有降低,但改变均未达到统计学上的显着性差异。（2）细胞形态学观察结果显示,与对照组相比,最高剂量下（400μg/m L）rh-MT-Ⅲα对两种细胞形态未产生显着影响。（3）LDH释放率结果显示,与对照组相比,两种细胞LDH释放率在400μg/m L时显着升高,25～200μg/m L剂量下,LDH释放率与对照组无明显差异。（4）细胞凋亡率检测结果显示,与对照组相比,两种细胞凋亡率均在400μg/m L剂量下明显上升,尤其是早期凋亡率,为对照组4～5倍。以上研究表明,在400μg/m L以下实验剂量水平,rh-MT-Ⅲα对Ha Ca T和L929细胞无明显毒性。2.rh-MT-Ⅲα对秀丽线虫一般毒性评价:野生秀丽线虫经5,50,500μg/m L的rh-MT-Ⅲα暴露48小时后,检测线虫一般毒性评价指标,包括线虫运动行为（头部摆动频率和身体弯曲频率）,摄食行为（咽泵频率）,寿命,致死率,发育（体长）和生殖功能（后代数目）。结果显示,与对照组相比,线虫各生物学终点未显示出明显差异,表明rh-MT-Ⅲα在实验剂量下对线虫无明显毒性效应。3.rh-MT-Ⅲα抗氧化功能研究:（1）体外自由基清除研究:1.5 m L rh-MT-Ⅲα样品（25,50,100,200,400μg/m L）与1.5 m L 1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH,80μg/m L）体外共孵育,测得rh-MT-Ⅲα各剂量下体外自由基清除率后,计算IC50（DPPH清除率达到50%时需要的rh-MT-Ⅲα浓度）。结果显示,随着rh-MT-Ⅲα浓度升高,其对DPPH自由基清除率也随之增加,IC50为184.32μg/m L。（2）紫外线B（UVB）诱导Ha Ca T细胞损伤模型的构建:以一定辐射强度（100μw/cm2）不同辐照时间（1 min,2 min,3 min,4 min,5 min）处理Ha Ca T细胞,利用MTT法检测各组细胞存活率（%）分别为99.27±0.11、94.34±0.03、59.39±12.03、39.80±8.75、8.95±0.68。选择辐照时间为3 min,以确保（1）UVB辐射剂量能够对Ha Ca T细胞产生氧化损伤;（2）经UVB损伤后的Ha Ca T细胞,其细胞存活率恢复具有生物学意义,降低过度损伤造成弱化抗氧化功能的效应;以兔肝MT检测建立的模型,在75μg/m L剂量时显示出抗氧化损伤作用,提示模型有效。（3）抗氧化功能研究:经UVB处理的Ha Ca T细胞,加入不同浓度（25,50,100,200μg/m L）rh-MT-Ⅲα继续培养24小时后,细胞存活率结果显示,单一UVB处理组细胞存活率明显降低,rh-MT-Ⅲα处理组细胞,在25～100μg/m L剂量下,细胞存活率呈上升趋势,200μg/m L剂量存活率略有下降,50和100μg/m L剂量下细胞存活率与对照组相比无明显差异且在100μg/m L剂量下,细胞存活率显着高于单一UVB处理组。细胞形态,细胞凋亡及ROS含量指标与细胞存活率结果一致,均在100μg/m L剂量下显着改善,与单一UVB处理组细胞相比,100μg/m L剂量组细胞连接更加紧密,细胞凋亡率及ROS含量均显着降低,说明rh-MT-Ⅲα对UVB致Ha Ca T细胞氧化损伤具有拮抗作用,且在100μg/m L剂量下作用显着。4.rh-MT-Ⅲα对纳米银诱导线虫毒性的缓解作用研究:课题组前期研究表明10μg/m L剂量下纳米银（Ag NPs）对秀丽线虫具有明显毒性,可导致线虫氧化损伤。本章采用10μg/m L纳米银作为阳性对照,与不同浓度（5,50,500μg/m L）rh-MT-Ⅲα共同处理线虫48小时后,检测线虫运动行为、生长发育指标及ROS指标,探讨在整体动物模型上rh-MT-Ⅲα对Ag NPs致秀丽线虫毒性的缓解作用。（1）运动行为结果显示,与对照组相比,Ag NPs处理组线虫头部摆动频率及身体弯曲频率均显着降低（P<0.05）,与Ag NPs处理组相比,rh-MT-Ⅲα与Ag NPs共同处理组线虫头部摆动频率及身体弯曲频率在50μg/m L时即明显升高,表明rh-MT-Ⅲα对纳米银致线虫运动行为降低具有恢复作用,且恢复作用随着rh-MT-Ⅲα剂量的增加而增加,线虫头部摆动频率在50μg/m L剂量下即恢复至正常水平,身体弯曲频率在500μg/m L剂量下恢复至正常水平。（2）生长发育指标结果显示,与对照组相比,Ag NPs组线虫体长体宽均显着降低,rh-MT-Ⅲα与Ag NPs共同处理组线虫体长体宽,随着rh-MT-Ⅲα剂量的增加逐渐增加,在50μg/m L时较Ag NPs组线虫体长体宽显着增加且体宽可恢复至正常水平;（3）ROS检测结果显示,与对照组相比,Ag NPs处理组线虫ROS显着升高,rh-MT-Ⅲα与Ag NPs共同处理组线虫ROS水平随着rh-MT-Ⅲα剂量的增加而降低,与Ag NPs处理组线虫相比,共同处理组线虫活性氧水平在50μg/m L剂量下显着降低,表明rh-MT-Ⅲα具有降低Ag NPs诱导线虫氧化损伤水平的作用。综合运动行为、生长发育指标及ROS指标结果,初步判定rh-MT-Ⅲα对Ag NPs致线虫毒性具有解毒作用。本课题采用的rh-MT-Ⅲα,由苏州汇涵生物科技有限公司利用大肠杆菌基因工程高密度表达并纯化获得的人源金属硫蛋白Ⅲα短肽,产品单一性好、纯度高。研究结果显示rh-MT-Ⅲα在25～200μg/m L剂量下对两种细胞的细胞活力、细胞形态学、细胞膜及细胞凋亡率无明显影响,并在5～500μg/m L剂量下对线虫的运动、摄食、生长发育、寿命和生殖功能无明显毒性效应。抗氧化损伤功能探究结果显示,rh-MT-Ⅲα在100μg/m L剂量时可有效保护UVB对Ha Ca T细胞造成的氧化损伤,体外自由基清除结果及ROS检测结果提示,rh-MT-Ⅲα可能通过清除活性氧来降低细胞氧化损伤水平,从而起到抗氧化损伤作用。重金属解毒功能结果显示,rh-MT-Ⅲα在50μg/m L剂量下可有效缓解Ag NPs致秀丽线虫毒性,且可恢复至正常水平。本研究从体外（细胞）和体内（线虫）不同水平探讨了rh-MT-Ⅲα可能存在的毒性效应,并初步评价了rh-MT-Ⅲα的抗氧化损伤及重金属解毒功能,可为rh-MT-Ⅲα产品的毒性评价及功能应用提供有价值的参考。
司曼飞[7]（2020）在《高级别浆液性卵巢癌生物标志物的筛选及金属硫蛋白调控浆液性卵巢癌发生发展的机制研究》文中研究说明第一部分 鉴定高级别浆液性卵巢癌诊断及预后评估的生物标志物目的由于缺乏有效的早期诊断和治疗策略,卵巢癌致死率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢癌发病隐匿,进展迅速,多数患者就诊时已进展至临床晚期,而早期诊断卵巢癌可以显着改善患者的预后。因此鉴定可用于卵巢癌早期诊断和预后评估的生物标志物有着重要意义。由于高级别浆液性卵巢癌是卵巢癌中最常见且恶性程度最高的类型,占死亡病例的大部分,因此本部分研究以高级别浆液性卵巢癌为研究对象,旨在筛选可能用于高级别浆液性卵巢癌诊断和预后评估的潜在生物标志物。方法下载GEO数据库中符合纳入标准的6个数据集（GSE14001、GSE18520、GSE26712、GSE27651、GSE40595、GSE54388）,整合分析筛选出高级别浆液性卵巢癌和正常卵巢表面上皮之间的差异表达基因。通过DAVID对共有的差异表达基因进行功能富集分析,包括GO功能注释和KEGG通路富集分析。使用STRING在线构建蛋白质相互作用（PPI）网络,通过Cytoscape对PPI网络进行可视化分析并鉴别hub基因,同时识别PPI网络中的功能模块,并对关键模块1进行了功能富集分析。应用Kaplan-Meier Plotter数据库评估10个hub基因在高级别浆液性卵巢癌中的预后价值。hub基因的表达水平不仅通过Oncomine数据库进行了确认,也通过qRT-PCR和Western Blot进行了临床样本验证。结果1.本研究成功筛选出103个共有差异表达基因,包括28个表达上调的基因和75个表达下调的基因;2.富集分析结果显示,上调的差异基因主要与细胞增殖和细胞分裂等生物学过程相关,而下调的差异基因主要富集于Wnt信号通路及多个与代谢相关的通路;3.构建PPI网络后,鉴定出10个hub基因—EPCAM、ALDH1A1、ZWINT、BUB1B、NEK2、DLGAP5、MELK、CEP55、CKS2、KDR,其中 ALDH1A1 和 KDR在高级别浆液性卵巢癌中表达下调;4.7个hub基因被分配到关键模块1中,该模块显着富集于DNA复制和细胞周期通路;5.生存分析结果显示,MELK、CEP55和KDR的表达与高级别浆液性卵巢癌患者的总生存期显着相关。结论基于生物信息学分析的结果,MELK、CEP55和KDR可能成为高级别浆液性卵巢癌诊断和预后评估的潜在生物标志物。第二部分 MT1G通过PI3K/AKT通路促进浆液性卵巢癌发生发展的机制研究目的卵巢癌在妇科恶性肿瘤中致死率最高。浆液性卵巢癌是卵巢癌中最常见的类型。金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白,在维持金属离子稳态、重金属解毒、抗氧化应激等方面发挥着重要作用。MT家族包含至少11个有功能的成员,可分为4个亚型:MT1（MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1M 及 MT1X）、MT2（MT2A）、MT3 及 MT4。越来越多的研究表明,MT与肿瘤的发生发展、耐药及预后密切相关。本研究旨在确定MT各亚型在浆液性卵巢癌中的表达水平及预后价值,探讨MT1G在浆液性卵巢癌发生发展中所发挥的生物学功能及相关分子机制,为卵巢癌的靶向治疗提供新的思路。方法使用qRT-PCR检测MT各亚型在浆液性卵巢癌与正常卵巢组织中的mRNA表达水平;通过Western Blot和免疫组化法检测MT在浆液性卵巢癌、正常卵巢组织及正常输卵管伞组织中的蛋白表达。分析本中心临床样本及TCGA数据库中浆液性卵巢癌的临床病理特征及与MT表达的相关性。使用Oncomine数据库分析MT各亚型在浆液性卵巢癌组织与正常卵巢组织中的表达差异,同时结合qRT-PCR结果,确定差异表达最为显着的MT1G亚型为课题研究对象。通过平板克隆形成实验、CCK-8细胞增殖检测以及EdU细胞增殖实验研究MT1G异常表达对浆液性卵巢癌细胞生长和增殖的影响;通过流式细胞术分析MT1G异常表达对浆液性卵巢癌细胞周期和凋亡的影响;通过细胞划痕实验和Transwell实验检测MT1G对浆液性卵巢癌细胞迁移能力的影响。通过Western Blot检测MT1G表达改变时PI3K/AKT通路下游靶基因的表达变化。通过体内实验验证MT1G对肿瘤生长的影响。应用Kaplan-Meier Plotter数据库分析MT各亚型表达对浆液性卵巢癌总生存期和无进展生存期的影响。结果1.qRT-PCR结果表明MT1A、MT1F、MT1G及MT2A在浆液性卵巢癌组织中的mRNA表达水平显着高于正常卵巢组织;Oncomine数据库分析结果显示,MT1G在浆液性卵巢癌中的表达量最高且差异最显着;2.Western Blot结果显示MT蛋白在浆液性卵巢癌组织中的表达显着高于正常卵巢组织;免疫组化结果显示MT在浆液性卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢上皮组织及正常输卵管伞组织,且MT以细胞质表达为主;3.分析浆液性卵巢癌的临床病理特征发现:患者的诊断年龄中位数在50岁以上;绝大多数浆液性卵巢癌患者初次就诊时已为III期;超过90%的浆液性卵巢癌类型为高级别浆液性卵巢癌;浆液性卵巢癌的淋巴结转移率较高;多数浆液性卵巢癌患者初次手术不能达到R0切除;4.MT表达水平与浆液性卵巢癌的组织学分级显着相关,即MT在高级别浆液性卵巢癌组织中的表达明显高于低级别浆液性卵巢癌组织;5.细胞功能实验结果表明:过表达MT1G后卵巢癌细胞的增殖、克隆形成及迁移能力增强;相反,干扰MT1G表达后细胞的增殖、克隆形成及迁移能力明显减弱;流式细胞术结果显示MT1G过表达可能促进浆液性卵巢癌细胞由G1向S期转变以加快细胞周期进展,并抑制细胞的凋亡;6.MT1G过表达可能激活PI3K/AKT信号通路,而干扰MT1G表达后PI3K/AKT信号通路被抑制,表明了 MT1G可能通过调控PI3K/AKT信号通路进而影响浆液性卵巢癌的发生发展;7.皮下成瘤实验中,MT1G过表达组的皮下肿瘤体积、重量明显大于对照组;同样MT1G过表达组的肿瘤生长速度也显着快于对照组;腹腔种植实验中,MT1G过表达组较对照组有明显更高的肿瘤负荷;8.生存分析结果显示,MT1M和MT2A高表达的浆液性卵巢癌患者的总生存期及无进展生存期均显着缩短;此外,MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT3及MT4的高表达显着缩短患者的无进展生存期。结论MT在浆液性卵巢癌中多呈现高表达;MT1G可能通过调控PI3K/AKT信号通路促进浆液性卵巢癌的发生发展;MT的高表达可能预示着浆液性卵巢癌患者的不良预后;MT有望成为卵巢癌临床治疗的新靶点。本研究创新点1.本研究重点阐述了 MT在浆液性卵巢癌发生发展中的作用和机制。首次全面分析了 MT各亚型在浆液性卵巢癌中的表达及其与生存预后的相关性,并探讨了 MT1G对浆液性卵巢癌细胞生物学行为的影响;2.首次提出了 MT1G可能通过调控PI3K/AKT信号通路参与浆液性卵巢癌的进展,可能为卵巢癌的靶向治疗提供新的方向。不足之处1.MT各亚型在不同癌症类型中存在着不同的差异表达,如MT在肝细胞癌、甲状腺乳头状癌中的表达多是下调的,其机制可能是启动子甲基化,但本研究尚未阐明MT在浆液性卵巢癌中异常表达的机制;2.既往多个研究均显示MT与肿瘤化疗耐药性的产生密切相关。本研究缺乏对MT与化疗耐药关系的研究,需进一步探讨。
葛东峰[8]（2020）在《宫颈癌细胞和正常上皮细胞对锌离子胁迫耐受性差异的机制研究》文中研究指明背 景锌做为一种可降解医用金属受到越来越广泛的关注。锌属于过渡金属元素,其原子轨道外层的两个电子容易被氧捕获形成活性氧自由基ROS。正常细胞发生恶性转化后,低氧环境和Warburg效应代谢特征使癌细胞具有相对较高的ROS水平基础,以适应调节肿瘤细胞的无限制增生与侵袭转移等恶性特征。ROS同时是一把双刃剑,当其水平超过细胞的耐受极限,可以引起细胞死亡,目前许多化疗药便是利用这一特征来杀伤肿瘤细胞。锌基生物材料植入人体后的最终腐蚀降解产物为锌离子,利用锌离子引发活性氧自由基增高进而杀伤肿瘤细胞,这对于拓展锌基生物材料的临床应用范围具有重要意义。目的比较研究肿瘤细胞与正常细胞对锌离子胁迫产生耐受性差异的生物学机制,为实现锌基生物材料的潜在临床肿瘤治疗应用提供相应的基础理论。方法首先,通过CCK8检测比较分析外源性锌离子干预下人体不同肿瘤细胞和正常细胞的活度变化,确立锌离子具有杀伤人体多种肿瘤细胞的表型特征。然后,选择宫颈癌细胞为研究对象,通过锌离子荧光探针FluoZinTM-3,ROS荧光探针DCFHDA,流式细胞术建立Zn2+-ROS-Regulated Cell Death关联分析,然后通过AnnexinV PI FITC检测细胞凋亡情况并利用实时荧光定量（qPCR）检测锌转运蛋白家族、氧化还原系统和细胞死亡相关重要基因mRNA水平分子变化,推测锌引起细胞死亡的可能途径及机制;通过检测氧化应激关键指标如氧化还原调节分子、抗氧化酶、ROS与抑制ROS能力,分析锌离子导致宫颈癌细胞ROS升高的重要机理;最后,通过转录组测序分析,提出Zn2+-ROS-Ferroptosis信号通路假设,进而通过多种抑制剂干预、qPCR、蛋白免疫印迹（Western blot）、免疫组化和RNA干扰等方法,找到锌离子诱导铁死亡的关键性分子,进一步探索锌离子引起宫颈癌细胞发生铁死亡的主要信号通路。结果第一部分 锌离子作用下宫颈癌细胞和正常上皮细胞的表型变化1.160μM锌离子,可诱导人生殖、消化和呼吸系统源性12种癌细胞发生死亡。2.宫颈癌细胞的ROS基础水平较高,外源性锌离子干预下,宫颈癌细胞的ROS水平随其作用时间延长呈现明显升高趋势,而正常细胞则无明显变化。3.锌离子促进宫颈癌细胞锌转运蛋白Zip4、ZnT1的mRNA转录上调,ZnT7则转录下调,而宫颈正常上皮细胞中,Zip1、Zip4、Zip6、Zip7、Zip9、Zip10、Zip14、ZnT1、ZnT4和ZnT7的mRNA均转录上调。4.宫颈正常上皮细胞发生恶性转化即正常上皮组织向癌前病变与浸润癌进展的过程中,临床宫颈组织标本免疫组化结果显示:恶性转化细胞的Zip4表达不断升高,ZnT1逐渐降低,提示发生恶性转化的宫颈上皮细胞对锌的依赖性增强。第二部分锌离子作用下宫颈癌细胞和正常上皮细胞的氧化应激指标改变1.锌离子导致宫颈癌细胞的谷胱甘肽GSH不断耗竭,而宫颈正常上皮细胞的GSH含量不断增加,这是锌离子引起宫颈癌细胞ROS水平不断升高的关键原因之一。2.宫颈癌细胞锰超氧化物歧化酶（SOD2）、谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）、过氧化氢酶（CAT）和硫氧蛋白还原酶（TrxR）等抗氧化酶的活性均低于宫颈正常上皮细胞;锌离子作用下,宫颈癌细胞的SOD2、CAT与TrxR活性水平不断上升,这表明锌离子引起宫颈癌细胞O2.-和H2O2等活性氧自由基成分不断升高,进而引起抗氧化酶活性不断升高以中和消除其不断产生的ROS。3.锌离子作用下,宫颈癌细胞抑制OH·-能力下降十分显着（P<0.01）,其抑制OH·-能力约是正常上皮细胞的一半,这间接表明OH·-升高是锌离子导致宫颈癌细胞死亡的重要原因。4.临床宫颈组织标本免疫组化结果显示:Keap1表达逐渐升高,Nrf2表达降低,说明发生恶性转化的宫颈上皮细胞抗氧化能力下降。第三部分 宫颈癌细胞和正常上皮细胞转录组测序分析及铁死亡分子机制研究1.在无外源性锌离子胁迫情况下,转录组学测序结果显示:与宫颈正常上皮细胞相比,宫颈癌细胞的铁死亡相关分子COX2、ALOX15、ACSL4的mRNA转录水平均升高2倍以上,Keap1升高近50倍,细胞膜铁出胞转运蛋白Ferroportin（FPN1）降低10倍。2.锌离子作用下,KEEG富集通路分析显示:铁死亡信号通路关键分子HO-1、SLC7A11、TF、Ferritin、GCL和ACSL4均明显表达上调,其中HO-1在4h和8h分别上调约50和30倍。提示HO-1可能是锌诱导宫颈癌细胞发生铁死亡的关键信号分子。3.添加铁离子螯合剂（DFO）、铁死亡抑制剂（Fer-1）和维生素E,均可使细胞死亡受到明显抑制;添加坏死抑制剂（Nec1）,部分细胞死亡受到抑制,提示部分细胞通过坏死途径死亡;添加凋亡抑制剂（Z-VAD）和自噬抑制剂（Apocynin）,细胞死亡均未受抑制。这提示,锌离子引起的宫颈癌细胞死亡可能主要为铁死亡。4.qPCR和WB结果显示锌离子导致TF、HO-1、COX2和ALOX15等铁死亡关键分子的转录表达均明显上调,细胞膜铁出胞转运蛋白FPN1的mRNA转录水平则显着下调,这些分子可能是锌离子引起宫颈癌细胞发生铁死亡的重要分子。5.HO-1siRNA实验结果显示:HO-1被干扰后,锌离子作用下宫颈癌细胞的ROS水平明显降低,这说明HO-1基因在锌离子诱导宫颈癌细胞ROS升高方面起着关键作用。6.临床宫颈组织组织标本免疫组化结果显示:在宫颈正常上皮细胞发生恶性转化过程中,ALOX15、ALOXE3和COX2等促进铁死亡的信号分子表达升高;TF表达升高,FPN1表达降低,提示发生恶性转化的宫颈上皮细胞对铁的依赖性升高;SLC7A11和Gpx4表达升高,提示恶性转化细胞的抗氧化能力增强以适应其自身较高的氧化应激水平。结论 宫颈癌Siha细胞和宫颈正常上皮HcerEpic细胞对锌离子胁迫的耐受性存在差异,锌离子导致宫颈癌细胞内GSH耗竭和ROS生成增多是其杀伤宫颈癌细胞的关键机制,并通过Zn2+-Keap1-Nrf2-HO-1通路诱导癌细胞铁死亡。
葛婷雯[9]（2019）在《金属硫蛋白对三氧化二砷和肥胖共同诱导心肌损伤的保护作用及机制研究》文中提出目的:三氧化二砷是临床常见的抗肿瘤药物,其主要应用于急性早幼粒细胞白血病的治疗,以及乳腺癌等实体瘤的治疗,并且其在实体肿瘤治疗策略中的应用目前已被广泛研究。但其在应用过程中引起的心脏毒性,严重阻碍了治疗方案的实施。与此同时,随着人们物质水平的逐渐提高,肥胖诱导的心脏损伤在临床也十分常见。不幸的是肿瘤患者也常常存在肥胖诱发的心脏损伤,这对选择三氧化二砷作为抗肿瘤治疗方案造成了极大的限制。金属硫蛋白是一种有效的内源性抗氧化剂,可有效保护心肌细胞免受氧化应激损伤,故本研究的目的旨在证明金属硫蛋白在肥胖和治疗剂量三氧化二砷的双重打击下,是否可以保护心肌细胞,抑制心脏毒性的发生。方法:金属硫蛋白心脏特异性高表达转基因小鼠与同种系野生型对照组小鼠,在4周龄时开始暴露于高脂饮食和正常对照饮食。4个月后进行糖耐量实验,检测暴露于高脂饮食的小鼠是否出现肥胖和胰岛素抵抗。随后尾静脉注射三氧化二砷（5mg/kg/day）,持续1个月后处死各组小鼠,收集心脏组织,检测细胞凋亡、氧化应激、炎症反应与纤维化等各项分子指标。结果:单纯肥胖小鼠模型中,没有金属的参与不能启动MT的保护机制。三氧化二砷单因素打击下,MT可抑制氧化应激反应,并可通过抑制P53信号通路和细胞三大凋亡途径保护心肌细胞凋亡。同时,也可抑制NF-kB信号通路的活化,从而使其下游的炎症因子,趋化分子和黏附分子的分泌减少,从而进一步抑制巨噬细胞的招募。双重因素打击下,心肌细胞氧化应激损伤和其导致的细胞凋亡、炎症反应更重,同时肥胖增加了三氧化二砷诱导心肌细胞纤维化的敏感性,使心肌纤维化提早出现。但双重打击下,MT对心肌细胞损伤的保护作用也更强。结论:金属硫蛋白对三氧化二砷及合并肥胖的双重打击诱导的心肌损伤有保护作用。但在无金属离子参与的条件下,单纯MT高表达对肥胖诱导的心肌损伤无保护作用。
王瑜,俞乔[10]（2020）在《浸润性导管型乳腺癌中金属硫蛋白3的表达及意义》文中提出[目的]探讨金属硫蛋白3（MT-3）在浸润性导管型乳腺癌中的表达,并分析MT-3表达与肿瘤临床病理及预后之间的关系。[方法]选取2012年3月至2014年3月在南京江北人民医院和江苏省肿瘤医院接受治疗的浸润性导管型乳腺癌手术标本112例,采用免疫组织化学检测肿瘤组织和癌旁组织中MT-3的表达,并分析MT-3表达与乳腺癌患者临床病理之间相关性;采用Kaplan-Meier法分析MT-3表达与乳腺癌患者预后的关系。[结果] MT-3蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率（72.3%）高于癌旁组织中的阳性表达率（25.9%）（P<0.05）。MT-3表达与乳腺癌组织的TNM临床分期、组织学分级以及淋巴结转移呈正相关（P<0.05）,而与乳腺癌患者的年龄及其肿瘤大小无明显相关性（P>0.05）。生存分析结果显示,与MT-3低表达乳腺癌患者5年生存率（83.3%）相比,MT-3高表达患者的5年生存率显着性降低（62.8%）（P<0.05）。[结论] MT-3在浸润性导管型乳腺癌中过表达,并与肿瘤的发生发展密切相关,有望为浸润性导管型乳腺癌的临床诊疗及预后评估提供新的思路。
二、乳腺癌组织中金属硫蛋白表达的意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乳腺癌组织中金属硫蛋白表达的意义（论文提纲范文）
（1）姜黄素对黏液表皮样癌MEC-1细胞体外侵袭能力及MMP-9、CD44、E-cadherin表达的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:黏液表皮样癌侵袭转移相关分子的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）乳腺癌循环肿瘤细胞生物学特性及其在血液中存活的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 乳腺癌研究现状 |
| 1.1.2 循环肿瘤细胞研究现状 |
| 1.1.3 金属硫蛋白MT2 在肿瘤中的研究现状 |
| 1.2 研究思路 |
| 1.3 技术路线 |
| 第二章 循环肿瘤细胞系的分离鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 4T1 乳腺癌原位肿瘤细胞和肺脏肿瘤转移灶细胞的分离和鉴定 |
| 2.3.2 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和鉴定 |
| 2.3.3 B16 黑色素瘤循环肿瘤细胞分离和鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 循环肿瘤细胞生物学特性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞的异质性 |
| 3.3.2 不同EMT表型的4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞的鉴定 |
| 3.3.3 短期传代次数对4T1CTCs EMT表型的影响 |
| 3.3.4 循环肿瘤细胞对化疗药物的敏感性研究 |
| 3.3.5 循环肿瘤细胞增殖、克隆形成能力和体内致瘤能力研究 |
| 3.3.6 循环肿瘤细胞侵袭迁移能力及肺转移能力 |
| 3.3.7 悬浮培养和流体剪切力对4T1CTCs EMT表型的影响 |
| 3.3.8 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞表现为强的血液存活能力 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 乳腺癌循环肿瘤细胞定量iTRAQ蛋白组学分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 不同EMT表型4T1CTCs的差异蛋白 |
| 4.3.2 不同EMT表型4T1CTCs的差异蛋白的GO富集分析 |
| 4.3.3 不同EMT表型4T1CTCs差异蛋白的蛋白-蛋白相互作用网络分析 |
| 4.3.4 不同EMT表型4T1CTCs差异蛋白的KEGG分析 |
| 4.3.5 间叶表型4T1CTCs的候选标记物 |
| 4.3.6 中间表型 4T1CTC-1 和间叶表型 4T1CTC-2 共同高表达蛋白分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 金属硫蛋白2(MT2)通过诱导CTCs发生自噬促进失巢凋亡抵抗和存活 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 4T1乳腺癌循环肿瘤细胞表现为强的失巢凋亡抵抗能力 |
| 5.3.2 乳腺癌循环肿瘤细胞表现为强的流体剪切力诱导凋亡抵抗能力 |
| 5.3.3 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞表现为免疫逃逸表型 |
| 5.3.4 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞通过增加自噬水平抑制凋亡水平促进细胞存活 |
| 5.3.5 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞通过 MT2 增加自噬水平促进细胞存活 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 一、主要结论 |
| 二、特色与创新 |
| 三、局限性与不足 |
| 四、展望 |
| 参考文献 |
| 研究成果 |
| 中英文缩略表 |
| 致谢 |
（3）CRIP1在胃癌组织中的表达及其通过CREB1/VEGFC轴促进胃癌淋巴管新生的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:CRIP1在胃癌中的表达及其与临床病理特征的关系研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床组织样本 |
| 2.1.2 胃癌组织芯片 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 m RNA微阵列芯片检测 |
| 2.2.2 RNA提取 |
| 2.2.3 总RNA反转录 |
| 2.2.4 实时定量PCR |
| 2.2.5 免疫组化 |
| 2.2.6 免疫组化染色结果评分 |
| 2.2.7 Oncomine数据库分析 |
| 2.2.8 TCGA在线分析网站 |
| 2.2.9 Cell counting kit-8(CCK-8) |
| 2.2.10 Transwell实验 |
| 2.2.11 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 芯片检测胃癌组织及癌旁组织中差异表达的基因 |
| 3.2 敲减各个基因检测胃癌细胞增殖能力改变 |
| 3.3 敲减各个基因检测胃癌细胞迁移能力改变 |
| 3.4 CRIP1在胃癌组织标本中的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:CRIP1通过上调VEGFC促进胃癌淋巴结转移 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 胃癌细胞系 |
| 2.1.2 裸鼠 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.1.6 抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA提取 |
| 2.2.2 RNA浓度及纯度检测 |
| 2.2.3 总RNA反转录 |
| 2.2.4 实时定量PCR |
| 2.2.5 蛋白提取 |
| 2.2.6 蛋白定量 |
| 2.2.7 免疫印迹实验 |
| 2.2.8 细胞转染 |
| 2.2.9 慢病毒转染 |
| 2.2.10 Cell counting kit-8(CCK-8) |
| 2.2.11 Transwell实验 |
| 2.2.12 Edu增殖实验 |
| 2.2.13 淋巴内皮细胞成管实验 |
| 2.2.14 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.2.15 裸鼠尾静脉注射肺转移模型 |
| 2.2.16 小动物PET扫描 |
| 2.2.17 集落形成实验 |
| 2.2.18 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CRIP1能够促进淋巴管新生 |
| 3.2 CRIP1在体内促进淋巴结转移 |
| 3.3 CRIP1促进胃癌细胞增殖 |
| 3.4 CRIP1能够促进胃癌细胞迁移与侵袭 |
| 3.5 体内实验证实CRIP1能够促进胃癌细胞增殖 |
| 3.6 体内实验证实CRIP1能够促进胃癌细胞转移 |
| 3.7 CRIP1能够上调VEGFC的表达 |
| 3.8 CRIP1通过促进CREB1 的转录活性上调VEGFC的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 富含半胱氨酸肠蛋白的生理功能及其在良性疾病和肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 1 第一部分PARP1 抑制MT1M转录促进卵巢癌转移的作用研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料与仪器 |
| 1.2.1 细胞株 |
| 1.2.2 感受态细菌 |
| 1.2.3 质粒 |
| 1.2.4 药物与主要试剂 |
| 1.2.5 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 siRNA转染 |
| 1.3.3 质粒扩增 |
| 1.3.4 质粒转染 |
| 1.3.5 Western blotting法检测蛋白含量 |
| 1.3.6 蛋白质免疫印迹实验(Western blotting) |
| 1.3.7 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 1.3.8 Elisa检测 |
| 1.3.9 SRB实验检测细胞增殖 |
| 1.3.10 划痕愈合实验 |
| 1.3.11 Transwell小室迁移实验 |
| 1.3.12 条件培养基制备 |
| 1.3.13 数据分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 PARP1 调控的潜在靶基因MT1M |
| 1.4.2 卵巢癌基因芯片数据 |
| 1.4.3 PARP1 负性调控MT1M的表达 |
| 1.4.3.1 敲除PARP1对MT1M转录表达与蛋白表达的影响 |
| 1.4.3.2 过表达PARP1对MT1M转录表达与蛋白表达的影响 |
| 1.4.4 敲除PARP1对MT1M分泌的影响 |
| 1.4.5 PARP2和PARP3对MT1M表达的影响 |
| 1.4.6 MT1M表达对卵巢细胞增殖的影响 |
| 1.4.7 MT1M的表达对卵巢细胞迁移影响 |
| 1.4.7.1 MT1M高度表达抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.4.7.2 MT1M的低表达促进卵巢细胞迁移 |
| 1.4.8 分泌的MT1M抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.4.9 PARP1的表达对卵巢细胞迁移的影响 |
| 1.4.9.1 高度表达PARP1促进卵巢细胞迁移 |
| 1.4.9.2 敲除PARP1抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.5 讨论 |
| 2 第二部分PARP1 抑制卵巢癌MT1M转录的分子机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 药物与主要试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 siRNA转染 |
| 2.3.3 质粒扩增 |
| 2.3.4 质粒转染 |
| 2.3.5 Western blotting法检测蛋白含量以Western blotting方法 |
| 2.3.6 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 2.3.7 免疫共沉淀实验 |
| 2.3.8 PAR修饰实验 |
| 2.3.9 荧光素酶报告基因法(Dual-Luciferase reporter assay) |
| 2.3.10 荧光素酶报告基因信号测定 |
| 2.3.11 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 PARP1 通过FOXP3 调控MT1M的转录表达 |
| 2.4.2 FOXP3 调控MT1M的转录表达 |
| 2.4.3 PARP1与FOXP3 相互结合 |
| 2.4.4 FOXP3发生核糖基化修饰 |
| 2.4.5 PARP1 抑制由FOXP3 介导的MT1M的转录表达 |
| 2.4.6 敲除PARP1 增强卵巢癌细胞FOXP3 的表达 |
| 2.4.7 PARP抑制剂增强卵巢癌细胞FOXP3 的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 3 第三部分PARP抑制剂促进MT1M表达抗卵巢癌转移的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 药物与主要试剂 |
| 3.2.4 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 Western blotting法检测蛋白含量以Western blotting方法 |
| 3.3.3 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 3.3.4 SRB实验检测细胞增殖 |
| 3.3.5 Elisa实验法 |
| 3.3.6 划痕愈合实验 |
| 3.3.7 Transwell小室实验 |
| 3.3.8 苏木素(Hematoxylin)和伊红(Eosin)染色:H&E染色 |
| 3.3.9 免疫组化染色: |
| 3.3.10 包装慢病毒与感染慢病毒 |
| 3.3.11 动物实验 |
| 3.3.12 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 PARP抑制剂促进MT1M的转录表达与分泌 |
| 3.4.2 PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞的迁移 |
| 3.4.3 MT1M在 PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞的迁移中的作用 |
| 3.4.4 Olaparib抑制尾静脉接种卵巢癌细胞CaOV3 的肺转移 |
| 3.4.5 Olaparib抑制原代卵巢癌HO-8910PM PDX的动物模型的肺转移 |
| 3.5 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 综述 PARP1的其他生物学功能:DNA修复之外 |
| 参考文献 |
| 作者简历在学期间所取得的科研成果 |
（5）金属硫蛋白1M通路与非小细胞肺癌关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 MT1M在NSCLC中的作用 |
| 材料和方法 |
| 一、实验试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 1、确立MT1M为研究目标基因 |
| 2、MT1M表达量的验证 |
| 3、细胞株的选取 |
| 4、构建MT1M过表达细胞稳定株 |
| 5、MT1M功能验证 |
| 第二部分 在NSCLC中 p53对MT1M的调控作用 |
| 材料和方法 |
| 一、实验试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 1、MT1M基因相关性分析 |
| 2、荧光素酶检测 |
| 3、构建抑制p53功能的细胞株 |
| 4、p53基因功能验证 |
| 第三部分 MDM2/p53/MT1M信号通路在NSCLC中的作用 |
| 材料和方法 |
| 一、实验试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 1、构建MDM2敲低细胞株 |
| 2、MDM2功能验证 |
| 3、敲低MDM2 联合MT1M过表达对细胞功能影响 |
| 4、抑制MDM2对相关细胞蛋白表达验证 |
| 5、免疫荧光检测 |
| 6、免疫共沉淀实验 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 免疫抑制剂治疗在非小细胞肺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（6）重组人金属硫蛋白Ⅲα短肽一般毒性评价及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 重组人金属硫蛋白Ⅲα短肽对细胞毒性评价 |
| 第一节 rh-MT-Ⅲα对HaCaT及 L929 细胞活力影响 |
| 第二节 rh-MT-Ⅲα对HaCaT及 L929 细胞形态影响 |
| 第三节 rh-MT-Ⅲα对Ha CaT及 L929 细胞LDH释放率及细胞凋亡率影响 |
| 本章小结 |
| 第二章 重组人金属硫蛋白Ⅲα短肽对秀丽线虫毒性评价 |
| 第一节 rh-MT-Ⅲα对线虫运动行为及摄食行为影响 |
| 第二节 rh-MT-Ⅲα对线虫存活率及寿命影响 |
| 第三节 rh-MT-Ⅲα对线虫发育及生殖功能影响 |
| 本章小结 |
| 第三章 重组人金属硫蛋白Ⅲα短肽抗氧化损伤功能评价 |
| 第一节 rh-MT-Ⅲα体外自由基清除率测定 |
| 第二节 UVB诱导HaCaT细胞损伤模型的构建 |
| 第三节 rh-MT-Ⅲα对UVB致 HaCaT细胞氧化损伤的抗氧化作用探究 |
| 本章小结 |
| 第四章 重组人金属硫蛋白Ⅲα短肽对纳米银诱导线虫毒性的缓解作用研究 |
| 第一节 rh-MT-Ⅲα对Ag NPs致线虫运动行为改变的影响 |
| 第二节 rh-MT-Ⅲα对Ag NPs诱导线虫生长发育毒性的影响 |
| 第三节 rh-MT-Ⅲα对Ag NPs致线虫体内活性氧含量改变的影响 |
| 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 金属硫蛋白在医药化妆品领域研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 在研期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）高级别浆液性卵巢癌生物标志物的筛选及金属硫蛋白调控浆液性卵巢癌发生发展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 鉴定高级别浆液性卵巢癌诊断及预后评估的生物标志物 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MT1G通过PI3K/AKT通路促进浆液性卵巢癌发生发展的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 金属硫蛋白在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（8）宫颈癌细胞和正常上皮细胞对锌离子胁迫耐受性差异的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究意义 |
| 3 研究目的 |
| 4 研究内容 |
| 第一部分 锌离子作用下宫颈癌细胞与正常上皮细胞表型变化 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 锌离子作用下宫颈癌细胞和正常上皮细胞的氧化应激指标变化 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 宫颈癌细胞和正常上皮细胞转录组测序分析及铁死亡分子机制研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 锌在肿瘤治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 缩略词中英文对照 |
| 个人简历 |
（9）金属硫蛋白对三氧化二砷和肥胖共同诱导心肌损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 三氧化二砷作为抗癌药物及其潜在机制 |
| 2.2 三氧化二砷与急性早幼粒细胞白血病 |
| 2.3 三氧化二砷与实体肿瘤 |
| 2.3.1 肺癌 |
| 2.3.2 乳腺癌 |
| 2.3.3 前列腺癌 |
| 2.3.4 胃癌 |
| 2.3.5 宫颈癌 |
| 2.3.6 膀胱癌 |
| 2.3.7 胰腺癌 |
| 2.3.8 鼻咽癌 |
| 2.3.9 卵巢癌 |
| 2.4 三氧化二砷诱导心脏毒性的病理表现及机制 |
| 2.4.1 细胞凋亡 |
| 2.4.2 离子通道的功能变化 |
| 2.4.3 氧化应激 |
| 2.4.4 炎症反应与纤维化 |
| 2.5 肥胖患者心肌脏病理表现及机制 |
| 2.5.1 结构和功能性心肌改变 |
| 2.5.2 心肌代谢低物的改变 |
| 2.5.3 炎症反应 |
| 2.5.4 内皮功能障碍 |
| 2.5.5 异位脂质蓄积 |
| 2.6 金属硫蛋白的功能及保护心脏的可能机制 |
| 2.6.1 金属硫蛋白对抗线粒体凋亡 |
| 2.6.2 金属硫蛋白对抗内质网应激 |
| 2.6.3 金属硫蛋白对抗氧化应激 |
| 第3章 金属硫蛋白对心肌细胞凋亡的保护作用及机制 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 高脂喂养和三氧化二砷对小鼠生理指标的影响 |
| 3.2.2 金属硫蛋白对小鼠心肌细胞凋亡的保护作用 |
| 3.2.3 金属硫蛋白可抑制P53 介导的细胞凋亡 |
| 3.2.4 金属硫蛋白保护细胞凋亡的机制——死亡受体途径 |
| 3.2.5 金属硫蛋白保护细胞凋亡的机制——内质网途径 |
| 3.2.6 金属硫蛋白保护细胞凋亡的机制——线粒体途径 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 金属硫蛋白对心肌细胞氧化应激的保护作用及机制 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 金属硫蛋白保护心肌细胞的氧化应激损伤 |
| 4.2.2 金属硫蛋白对心肌细胞抗氧化酶的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 金属硫蛋白对心肌细胞炎症及纤维化的保护作用及机制 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 金属硫蛋白对NF-κB炎症信号通路的抑制作用 |
| 5.2.2 金属硫蛋白对细胞因子及粘附分子的抑制作用 |
| 5.2.3 金属硫蛋白对心脏巨噬细胞浸润的抑制作用 |
| 5.2.4 金属硫蛋白对心肌纤维化的保护作用 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第6章 结论与课题实用和创新性 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 课题实用和创新性 |
| 6.2.1 实用性 |
| 6.2.2 创新性 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）浸润性导管型乳腺癌中金属硫蛋白3的表达及意义（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 实验方法及试剂 |
| 1.3 随访 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 MT-3在浸润性导管型乳腺癌中的表达 |
| 2.2 MT-3在浸润性导管型乳腺癌中的表达及其与临床病理之间关系 |
| 2.3 MT-3表达与浸润性导管型乳腺癌预后 |
| 3讨论 |
四、乳腺癌组织中金属硫蛋白表达的意义（论文参考文献）
- [1]姜黄素对黏液表皮样癌MEC-1细胞体外侵袭能力及MMP-9、CD44、E-cadherin表达的影响[D]. 吕美怡. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]乳腺癌循环肿瘤细胞生物学特性及其在血液中存活的机制研究[D]. 金延玲. 兰州大学, 2021(09)
- [3]CRIP1在胃癌组织中的表达及其通过CREB1/VEGFC轴促进胃癌淋巴管新生的机制研究[D]. 吴钟华. 中国医科大学, 2021
- [4]PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究[D]. 许霞青. 浙江大学, 2020(02)
- [5]金属硫蛋白1M通路与非小细胞肺癌关系的研究[D]. 徐伟. 苏州大学, 2020(06)
- [6]重组人金属硫蛋白Ⅲα短肽一般毒性评价及功能研究[D]. 甘俊英. 东南大学, 2020
- [7]高级别浆液性卵巢癌生物标志物的筛选及金属硫蛋白调控浆液性卵巢癌发生发展的机制研究[D]. 司曼飞. 北京协和医学院, 2020(05)
- [8]宫颈癌细胞和正常上皮细胞对锌离子胁迫耐受性差异的机制研究[D]. 葛东峰. 北京协和医学院, 2020(05)
- [9]金属硫蛋白对三氧化二砷和肥胖共同诱导心肌损伤的保护作用及机制研究[D]. 葛婷雯. 吉林大学, 2019(02)
- [10]浸润性导管型乳腺癌中金属硫蛋白3的表达及意义[J]. 王瑜,俞乔. 肿瘤学杂志, 2020(01)