一、TEM-104编码基因的克隆与原核表达（论文文献综述）
金李萍[1]（2021）在《鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）潜在毒力基因的研究》文中研究表明鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2）是一种能够感染金鱼和鲫鱼及鲫鱼变种的双链DNA病毒,该病毒病流行范围广,蔓延迅速,鲤疱疹病毒Ⅱ型引起的鲫造血器官坏死病也是我国重点监测的疫病,对我国的鲫鱼养殖业危害巨大,已成为鲫鱼养殖业健康发展的严重影响因素之一。研究鲤疱疹病毒的毒力基因对于鲤疱疹病毒的致病机理的研究以及弱毒疫苗的研制有着重要作用。本论文选取ORF57、ORF104和TK这3个编码蛋白的基因进行研究,取得了如下结果:1、设计siRNA抑制基因表达:通过在异育银鲫脊髓细胞系（Spinal cord tissue cell lines of Carassius auratus gibelio,CSC）中对Cy HV-2中3个基因进行RNA干扰,探究其对Cy HV-2病毒复制的影响。首先,以FAM标记干扰异育银鲫β-actin基因的si RNA进行CSC细胞转染条件的优化,再针对Cy HV-2中3个基因的3个不同位点设计siRNA,转染CSC细胞,并进行病毒感染,评估si RNA对病毒复制和致细胞病变的影响。结果表明:si RNA-ORF57-2、si RNA-ORF104-1、si RNA-ORF104-2、si RNA-TK-2能够降低病毒的lg TCID50值,在接种病毒后第48h（转染后第72h）在m RNA水平上也表现出相对抑制表达的效果（较Mock组）,其中,表明ORF57、ORF104和TK基因对病毒的毒力存在的潜在的影响。2、原核表达载体构建及多抗制备:本研究针对CyHV-2中ORF104、TK设计特异性引物,扩增目的片段经酶切连接至原核表达载体p ET-28a,转化成BL21（DE3）p Lys S大肠杆菌中,成功表达出ORF104和TK蛋白,纯化ORF104、TK重组蛋白后,制备兔抗多克隆抗体。另人工合成ORF57多肽片段免疫新西兰大耳兔制备多克隆抗体。使用上述抗体对细胞病毒培养物进行Western Blot检测。结果表明,ORF104蛋白纯化后目的片段出现在40k Da左右,TK蛋白纯化后目的片段出现在35k Da左右。ORF104和TK的重组蛋白与人工合成ORF57多肽片段制备的多克隆抗体都可以特异性的识别对应的重组蛋白或多肽片段,以及感染Cy HV-2病毒的细胞培养物。结果表明针对ORF57、ORF104和TK基因的多克隆抗体可以用于Cy HV-2病原对应蛋白检测中。综上,本论文的研究涵盖了ORF57、ORF104、TK基因对应蛋白的理化性质、同源性、进化保守性,对该基因对病毒毒力的潜在影响作了初步的探究,合成的重组蛋白及制备的多克隆抗体都为今后继续研究提供了研究工具,对这三个潜在毒力基因对Cy HV-2的致病机理,蛋白的分子机制研究,以及对弱毒苗,构建基因敲除弱毒株提供了一定的参考。
曹志伟[2]（2019）在《展示鲤疱疹病毒Ⅱ型膜蛋白的重组杆状病毒的构建及其对异育银鲫免疫保护效果的研究》文中研究说明鲤疱疹病毒II型（CyHV-2）是疱疹病毒造血器官坏死病的病原体,主要感染金鱼、鲫鱼及其变种。它是一种高致病性的病毒,当水温在15℃30℃时可造成近100%的死亡率。自2009年以来,在我国江苏北部的鲫鱼养殖区春秋季节连年发生大量的异育银鲫患出血病死亡,给我国水产养殖业带来了巨大的经济损失。目前关于CyHV-2的致病机制尚未完全清楚,疫苗接种仍然是防控CyHV-2最重要的手段。已报道的针对CyHV-2的灭活疫苗和亚单位疫苗都可以起到一定的保护效果,但是这两种疫苗都需要人工注射接种免疫,不仅耗费人力物力,而且在实际操作中也面临很多困难。因此,迫切需要研究出一种操作方便、保护效果突出的疫苗来防控CyHV-2感染。在本研究中,使用杆状病毒表面展示系统表达了九个截短的CyHV-2膜蛋白（ORF25,ORF25C,ORF25D,ORF30,ORF124,ORF131,ORF136,ORF142A,ORF146）和GFP报告蛋白。通过Western blot分析,结果显示GFP和9种膜蛋白成功地展示在重组病毒表面。为了检测重组杆状病毒能否进入异育银鲫细胞,同时重组杆状病毒携带的外源基因能否成功表达,使用重组杆状病毒rAcMNPV-GFP转导异育银鲫肾细胞（GiCK）。结果表明杆状病毒可以转导进入鱼细胞,同时外源基因在鸡β-肌动蛋白启动子调控下可以有效表达。健康的异育银鲫使用重组杆状病毒（rAcMNPV-ORF25,rAcMNPV-ORF25C,rAcMNPV-ORF25D,rAcMNPV-ORF30,rAcMNPV-ORF124,rAcMNPV-ORF131,rAcMNPV-ORF136,rAcMNPV-ORF142A,rAcMNPV-ORF146,rAcMNPV-GFP）浸泡免疫,模拟免疫组用相同体积的PBS处理。在免疫后1,2,4,7和15天随机取样检测免疫相关基因白细胞介素-11（IL-11）和补体成分C3的表达水平。结果实验组中白细胞介素-11（IL-11）和补体成分C3基因的表达水平显着上调。在免疫后2,3,4周尾部穿刺采血检测血清中免疫球蛋白M（IgM）的水平。结果显示,在免疫后3周,大多数疫苗免疫组的平均IgM水平增加1-2倍。随后,免疫过的异育银鲫通过腹腔内注射CyHV-2感染,所有免疫组均具有一定抵抗CyHV-2感染的能力。在展示和表达ORF25,ORF25C和ORF146的杆状病毒免疫组中,异育银鲫的相对存活率分别达到83.3%,87.5%和70.8%。本论文的研究结果表明,杆状病毒展示的ORF25,ORF25C和ORF146可能成为预防异育银鲫感染CyHV-2的潜在候选疫苗。
袁锐,陈静,刘训猛,吴亚锋,王晶晶,方苹[3]（2019）在《鲤疱疹病毒2型研究进展》文中提出鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）是引起鲫和金鱼造血器官坏死病的病原,在世界多个国家传播、流行,给鲫、金鱼和异育银鲫养殖业造成巨大经济损失。本文简要综述了鲤疱疹病毒2型的病原学、流行病学、诊断以及防控等研究进展,以期为鲤疱疹病毒2型基础研究和疾病防控策略提供参考。
李翊泉[4]（2010）在《CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的原核表达和纯化》文中研究说明目的:对肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamase ,ESBLs）进行基因重组表达及纯化。方法:对保存重组细菌DH5α/pGEM-T-CTX-M-3菌种鉴定和超广谱β-内酰胺酶确证后,对其所产的CTX-M-3型酶基因进行序列分析,明确酶基因表型。构建原核表达载体pET-28a（+）与CTX-M-3编码基因的重组体,并在大肠杆菌BL21（DE3）中原核表达。IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,表达产物经过亲和层析纯化,用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法（Western-blot）鉴定该纯化蛋白。结果:（1）pGEM-T-CTX-M-3重组菌质粒经NdeI和EcoRI酶切后获得的片段大小约为876 bp和3000 bp。核苷酸序列分析结果显示,目的基因片段大小为876 bp,经GenBank同源性比较,与GenBank上登录的CTX-M-3 100%符合。（2）成功构建pET-28a（+）-CTX-M-3重组质粒,经NdeI和EcoRI双酶切后,获得大小约为876 bp和5000 bp的片段,与预期大小相符,证明目的基因已经成功插入pET-28a（+）载体中。（3）可溶性检测表明表达产物以可溶性形式（上清中）和包涵体形式（沉淀中）两种形式存在。通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃、0.8mmol/L IPTG诱导24h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳。（4）利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析对重组蛋白进行了初步的纯化研究。SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明我们获得纯化的重组32kD蛋白。结论:本研究成功构建了pET-28a（+）- CTX-M-3基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中BL21表达,用His亲和层析柱纯化表达产物,并获得高纯度可溶性的重组蛋白。纯化蛋白为进一步酶生物学特性及酶的抗体制备研究奠定了基础。
赵廷坤,周岐新[5]（2008）在《铜绿假单胞菌产TEM-147型ESBL基因的克隆及原核表达》文中提出 到2006年为止,全球范围内发现的超广谱β内酰胺酶（ESBLs）已有200多种,其中 TEM 型有百余种。世界各地TEM 型β内酰胺酶的流行状况各不相同。在我国,已相继报道了 TEM-10、TEM-104、TEM-105、TEM-128、TEM-129、TEM-28、TEM-29、TEM-19和 TEM-116型β内酰胺酶。
赵廷坤,凌保东,周岐新,刘刚,雷军[6]（2006）在《铜绿假单胞菌产TEM-29型ESBL基因的克隆及原核表达》文中研究说明目的研究临床分离铜绿假单胞菌Pa3-104产生的超广谱β-内酰胺酶的基因型,并对其进行原核表达,了解它的相关特性。方法对该临床菌株进行接合试验;采用PCR扩增TEM型β-内酰胺酶编码基因的片段,克隆入pUCm-T载体,在E.coliJM109中表达,双脱氧链终止法测定核苷酸序列,确定基因型;并将TEM型β-内酰胺酶全编码基因克隆入原核表达载体pBK-CMV中进行原核表达;用三维试验检测重组菌产β-内酰胺酶的表型,等电聚焦电泳测定其表达蛋白的等电点（pI）。结果该临床菌株质粒接合试验为阳性;PCR扩增测序结果显示为TEM型,其基因片段含861个核苷酸,该TEM型β-内酰胺酶的编码基因与GenBank中大肠埃希菌产生的TEM-29的编码基因（Y17584）一致,等电聚焦电泳结果显示该酶的pI为5.4,三维试验证实为ESBL。结论在国内首次从临床分离铜绿假单胞菌中发现TEM-29型ESBL。
张新春[7]（2006）在《水稻锚蛋白基因OsBIHN-N22和酯酰辅酶A合成酶基因OsBNHN-N7的克隆鉴定与功能分析》文中研究表明在本实验室前期研究中，证明了苯并噻二唑（benzothiadiazole，BTH）能诱导水稻对稻瘟病、白叶枯病和纹枯病等病害的系统抗病性，并在此基础上运用抑制性差减杂交法分离鉴定了200多个与水稻抗病反应相关的差异表达cDNA。同源性搜索发现，其中一个差别表达克隆BIHN-n22含有623bp的插入片段，该插入片断编码的蛋白与植物中ankyrin（锚蛋白）类型蛋白具有高度相似性。进一步搜索发现GenBank数据库中的水稻cDNA序列发现有一个长度为1529 bp的差别表达cDNA克隆J023125M12，（GenBank accession NO．AK121370）和一个1475by的cDNA克隆J013000M21（GenBank accession NO．AK098858）（Kikuchi，S et al.,2003），它们与本序列的相似性都达到99％，与植物中ankyrin（锚蛋白）类型蛋白具有高度相似性。为研究探讨这个可能的锚蛋白基因的生物学功能以及在水稻抗病性中的作用，我们以这个已知序列设计引物，我们以前期构建好的水稻全长cDNA文库为模板克隆了这个基因，并命名为OsBIHN-N22。OsBIHN-N22基因编码蛋白由329个氨基酸组成，含有3个保守的ANK重复。这个蛋白属于ANK家族。细胞定位分析表明这个蛋白定位在细胞膜上。对其基因结构分析表明OsBIHN-N22基因包含八个外显子和七个内含子。Southern杂交表明OsBIHN-N22基因在水稻基因组中以单拷贝的形式存在于水稻的第九条染色体上。通过对OsBIHN-N22基因在水稻中的特异性表达分析发现，OsBIHN-N22能被苯并噻二唑（BTH）诱导表达，并且在BTH处理后的24h达到很高水平，在随后的60h内一直维持在相当高的水平上。而在水处理的对照中发现OsBIHN-N22的表达水平在整个实验检测时期都较低。在BTH处理的水稻幼苗中，OsBIHN-N22基因的表达在受到稻瘟病菌M.grisea侵染后被快速激活。稻瘟病菌接种后0h即可检测到OsBIHN-N22基因的激活表达，而且在随后的18h内强度增加，并在48h内维持在一个相当高的水平上。在没有BTH处理，只有稻瘟病菌接种的水稻叶片中直到6h才有诱导表达，然后在18h内可以检测到比较明显的表达水平，随后迅速降低。在水稻与稻瘟病菌的非亲和性互作中，OsBIHN-N22基因在接种后的6h就能检测到其快速表达，而在亲和性互作中则只有在36h才有微弱的表达。在与水稻抗病反应相关的差异表达cDNA中，另外一个长度为1897bp的差别表达克隆002-112-H10（GenBank accession NO．AK106615）。这个克隆与植物中的AMPBP（AMP-binding protein）蛋白家族中的酯酰辅酶A合成酶类（acyl-CoA Synthetases）有高度的相似性。我们以该cDNA克隆的已知序列设计了一对特异性引物，从水稻的cDNA文库中通过PCR扩增到这个序列，并把这个基因命名为OsBNHN-N7。OsBNHN-N7基因编码一个含有558个氨基酸的蛋白，分子量为60.4kD，等电点为7.87，含有一个Caic（Acyl-CoA synthetases（AMP-forming）／AMP-acid ligasesⅡ）结构域。Southern杂交显示OsBNHN-N7基因以多拷贝的形式存在于水稻基因组内。通过细胞定位实验也证明OsBNHN-N7编码蛋白定位在细胞质膜上。Northern杂交表明OsBNHN-N7基因在BTH处理后的24小时后有一个很高的表达水平；而在水处理的对照中只有较低的本底表达水平。另外我们在研究中发现在BTH处理的水稻幼苗在受到M.grisea侵染后，OsBNHN-N7基因在接种后的6小时就被快速的激活表达，其后表达水平继续增强并持续稳定一个高水平上。在水处理的对照中，稻瘟病菌接种后36小时内只有很微弱的低水平诱导表达。在利用水稻的一对近等位基因系H8R和H8S研究与稻瘟病菌的亲和与非亲和性互作中发现，与H8R的非亲和性互作中，OsBNHN-N7基因能被快速激活表达，而与H8S的亲和性互作中，只有极微弱的表达。
司红彬[8]（2006）在《鸡志贺氏菌ESBLs的基因型检测及其感染的实验性治疗》文中研究指明本文采用试管二倍稀释法对临床分离的鸡志贺氏菌常用抗菌药的MIC值测定，利用双纸片增效法对其所产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的检测，并用PCR方法确定其基因型。试制出复方头孢噻呋混悬液，并观察了其对人工复制的产β-内酰胺酶志贺氏菌感染治疗效果，以了解鸡志贺氏菌的耐药现状及耐药机制，探讨其产酶耐药的分子机制，为临床治疗提供理论依据，同时为新兽药制剂的开发提供新的思路。 β-内酰胺酶检测及ESBLs的试验结果表明：临床分离的鸡志贺氏菌用特异性的色原头孢菌素法检测呈β-内酰胺酶阳性，AmpC酶为阴性。双纸片增效法检测到超广谱β-内酰胺酶，对临床志贺氏菌所产ESBLs设计引物PCR扩增、克隆、测序，利用Dnastar MegAlign Sequence软件与U48775（TEM-1）对比分析，发现临床株与U48775同源性99.2％，属于TEM型，共有七处碱基发生变化，相应引起三个氨基酸发生改变，33位D（天冬氨酸）变为G（甘氨酸）、186位T（苏氨酸）变为A（丙氨酸）、271位R（精氨酸）变为Q（谷氨酰胺），与其它序列相比，AY903309（TEM-116）同源性最高，为99.8％，共两处碱基发生变化，其中151位碱基A变为G，引起51位丝氨酸变为甘氨酸，403位碱基T变为C，没有引起氨基酸变化，为沉默突变，因与TEM-116有一个氨基酸差异，故该基因型暂称其为新型TEM-1V，上传至GenBank获序列号DQ211973。 体外抑菌实验结果表明：临床产ESBLs志贺氏菌对大部分单方药物敏感性明显下降，除碳青酶烯类亚胺培南、美罗培南敏感性较高，MIC值分别为0.25μg／ml、0.0625μg／ml；其它单药都相对不敏感，第三代头孢类头孢噻呋、头孢曲松对其MIC值分别为＞128μg／ml、128μg／ml；青霉素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类MIC值均＞128μg／ml，但β-内酰胺酶抑制剂可显着增强β-内酰胺类抗菌药的对产酶菌抗菌活性，头孢噻呋／他唑巴坦（2：1）、头孢曲松／他唑巴坦（2：1）、阿莫西林／棒酸（2：1）对其MIC值分别为8μg／ml、8μg／ml、32μg／ml，提示对产酶菌感染疾病治疗时使用三代头孢类抗生素与抑制剂联用效果较好。 本文还研究了复方头孢噻呋油性混悬注射液处方、物理稳定性和对临床产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）鸡志贺氏菌感染的疗效。根据ESBLs基因型为TEM型及药敏试验确定头孢噻呋和他唑巴坦联用（2：1）对产ESBLs的鸡志贺氏菌较为敏感，MIC值为16μg／ml，是头孢噻呋MIC值（＞128gμg／ml）的1／8；用此为主药处方和辅料羧甲基纤维素钠0.2％、司本-80 1.2％制备的复方头孢噻呋油性混悬液其沉降比为0.997、再分散性良好，经过在温度为60℃、湿度为75％环境下加速试验6个月后观察，颜色无变化，无粘壁现象，无颗粒凝结，表明物理稳定性良好；该制剂按20mg／Kg体重肌肉注射一次，对产ESBLs鸡志贺氏菌感染的有效率90％，治愈率86％。
李家斌,李旭,马亦林,俞云松[9]（2004）在《TEM-104编码基因的克隆与原核表达》文中研究说明
李家斌[10]（2002）在《产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌流行病学及分子生物学研究》文中提出研究背景 超广谱β-内酰胺类抗生素，如头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南和头孢他啶引入临床应用后不久，欧洲即首先在肠杆菌科细菌中发现了超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrum β-lactamases，ESBLs），随后有关ESBLs的报告遍及世界各地。ESBLs是由革兰阴性菌，如肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、不动杆菌和铜绿假单胞菌等产生的，且能使氧亚氨基（anoxyimino group）β-内酰胺抗生素，如第三代头孢菌素和单环酰胺类氨曲南失活。由于其水解底物较广谱β-内酰胺酶（TEM-1、TEM-2和SHV-1）更加广泛，故称之为ESBLs。产ESBLs的肠杆菌科的耐药问题是当前全球最重要的医院内感染耐药问题之一，且检测又是实验室的难点，另外，由于各地区流行的基因型不同而存在耐药性和检测底物的地区差别，因此，了解产ESBLs的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的最佳检测底物及耐药性特点，有利于防止产ESBLs株的区域性流行，并指导临床治疗，以免延误病情和造成浪费。 鉴于国内尚无大范围的调查研究资料，1999年9月至2000年9月间，我们对安徽省合肥市四家大医院临床标本中分离出的299株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的ESBLs产生情况、产ESBLs菌株的耐药性及其检测进行了研究，并对经ESBLs表型确认试验证实产ESBLs的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，进行了耐药基因的初步分型。 博士论文第一部分：摘要目的 了解安徽省合肥市产ESBLs的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌检测的最佳底物。 调查1999年9月至2000年9月安徽省合肥市产ESBLS的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的流行状况及耐药性。 了解 1999上000年合肥市多家医院临床分离的产 ESBLs的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中p．内酚胺酶基因型的初步分布倩况。材料与方法 收集四家大医院临床标本分离的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌共299株，采用美国DADE公司的Microscan Walkawcy－40全自动微生物分析仪，对菌株进行重新鉴定（具体操作详见其说明书），经ESBLS初步筛选试验和表型确认试验筛选出产ESBLS细菌。并用该系统的微量肉汤稀释法检测其对20种抗生素耐药性，用标准纸片扩散法(KrbyBauer test脸测其对头抱皈酮／舒巴坦的耐药性。 根据GenBank的基本序列设计TEM、SHV、CTX－M和OXA四对引物，分别用这些引物对表型确认试验证实产ESBLs的细菌进行PCR扩增。结果 合肥市检测田＊k的最佳底物是头抱噬肘，其次为头抱曲松：头抱他陡不宜作为该地区ESBLs的检测底物。 合肥市肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中ESBLs检出率分别为50．5％和24二％，总检出率为328％。产ESBLs菌对头抱他陡、氨曲南、头抱西丁、头袍毗厉、头抱吸酮／舒巴坦、吸拉西林／他哇巴坦、阿米卡星及环丙沙星等20种抗生素的耐药率比不 －2－ 博士论文第一部分：摘要 产酶株都有不同程度增加，但亚胺配能对所有产ESBLs菌株都敏感。 98株产ESBLS细菌中，79株产TEM型p－内酚胺酶，27株产SHV型p－内酚 胺酶，16株产 CTX－M型 p－内酞胺酶，2株产 OXA型 p－内酞胺酶，11株产非 TEMSHVCTXMOXA型p．内酚胺酶。 结论 本研究揭示了安徽省合肥市检测ESBLs的最佳底物是头抱噬胎，其次为头抱曲 松和氨曲南，而本地区单用头抱他咤作为筛选底物时，漏检率较高，故本地区用于 ESBLs筛选的底物以头抱噎厉联合头抱曲松或氨曲南为宜。 本研究发现，合肥市肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中ESBLs的产生率高，流行广， 应引起足够重视，严加控制。 临床资料及药敏资料证明产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是重要的医院 内感染细菌，且呈多重耐药，治疗中碳青霉烯类药物是最可靠的；含p．内酞胺酶抑 制剂的复合制剂及头霉素类药物耐药程度也较高，应适当增加剂量，并可与阿米卡 星联合应用；第四代头抱菌素（头抱毗肪）、环丙沙星和氨基糖昔类药物不适宜于 产ESBLs细菌感染的治疗。 合肥市表型为产ESBLs的菌株中，主要基因型为IFM型p．内酞胺酶，其次为 SHV型和CTXM型，但具体分子流行病学状况，有待进一步研究。
二、TEM-104编码基因的克隆与原核表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TEM-104编码基因的克隆与原核表达（论文提纲范文）
（1）鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）潜在毒力基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鲤疱疹病毒Ⅱ型研究进展 |
| 1.1.1 鲤疱疹病毒Ⅱ型流行病学 |
| 1.1.2 病原学分类 |
| 1.1.3 鲤疱疹病毒Ⅱ型流行株概况 |
| 1.1.4 鲤疱疹病毒属比较基因组学 |
| 1.1.5 鲤疱疹病毒致病基因研究进展 |
| 1.2 研究内容与意义 |
| 1.3 技术路线 |
| 第二章 鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF57、ORF104、TK基因克隆与编码蛋白生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品和主要试剂 |
| 2.1.2 生物信息学工具 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的片段的PCR克隆 |
| 2.2.2 基因编码蛋白理化性质分析 |
| 2.2.3 基因编码蛋白的结构域分析 |
| 2.2.4 蛋白的同源性比分析及系统进化树构建分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 目的片段的凝胶电泳检测 |
| 2.3.2 ORF57、ORF104和TK编码蛋白理化性质分析 |
| 2.3.4 结构域分析 |
| 2.3.5 ORF57、0RF104和TK基因蛋白同源性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 siRNA干扰对鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF57、ORF104、TK基因的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞株及病毒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CSC细胞的传代培养 |
| 3.2.2 CyHV-2的传代,保存与毒力效价测定 |
| 3.2.3 siRNA设计与合成 |
| 3.2.4 β-actin基因片段克隆与Real-Tine PCR标准曲线绘制 |
| 3.2.5 siRNA转染CSC细胞浓度与时间优化 |
| 3.2.6 siRNA转染CSC细胞时效检测 |
| 3.2.7 siRNA转染CSC细胞及CyHV-2感染 |
| 3.2.8siRNA对病毒TCID_(50)的影响 |
| 3.2.9 Real-Time PCR检测siRNA对病毒mRNA拷贝数的影响 |
| 3.3 实验结论 |
| 3.3.1 CSC细胞正常形态及病变形态的观察 |
| 3.3.2 毒株TCID_(50)测定 |
| 3.3.3 β-actin基因片段扩增及标准曲线的绘制 |
| 3.3.4 siRNA转染CSC细胞最优浓度与时间 |
| 3.3.5 siRNA转染CSC细胞时效测定 |
| 3.3.6 siRNA对病毒TCID_(50)的影响 |
| 3.3.7 siRNA对病毒mRNA拷贝数的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 原核表达载体的构建和多抗制备及效价测定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病毒、菌株和载体、多肽 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2.实验方法 |
| 4.2.1 引物设计与合成 |
| 4.2.2 目的片段PCR扩增 |
| 4.2.3 空质粒提取 |
| 4.2.4 酶切与连接 |
| 4.2.5 转化大肠杆菌Trans1-T1 |
| 4.2.6 阳性克隆的鉴定及测序 |
| 4.2.7 转化表达菌株BL21(DE3) |
| 4.2.8 蛋白表达与条件优化 |
| 4.2.9 蛋白纯化 |
| 4.2.10 Western-blot检测HIS标签 |
| 4.2.11 抗体制备及纯化 |
| 4.2.12 ELISA检测 |
| 4.2.13 Western Blot检测病毒细胞培养物 |
| 4.3 实验结论 |
| 4.3.1 目的片段的凝胶电泳检测 |
| 4.3.2 阳性质粒的PCR检测 |
| 4.3.3 阳性质粒的测序结果 |
| 4.3.4 ORF104/TK蛋白表达条件优化 |
| 4.3.5 纯化蛋白分析 |
| 4.3.6 Western blot对His标签蛋白特异性分析 |
| 4.3.7 ELISA检测抗体效价 |
| 4.3.8 Western blot检测重组目的蛋白 |
| 4.3.9 ORF57、ORF104、TK抗体对病毒细胞培养物蛋白Western blot检测 |
| 4.4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）展示鲤疱疹病毒Ⅱ型膜蛋白的重组杆状病毒的构建及其对异育银鲫免疫保护效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鲤疱疹病毒Ⅱ型概述 |
| 1.1.1 鲤疱疹病毒Ⅱ型简介 |
| 1.1.2 鲤疱疹病毒Ⅱ型基因组结构及编码蛋白 |
| 1.1.3 鲤疱疹病毒Ⅱ型的体外繁殖 |
| 1.1.4 鲤疱疹病毒Ⅱ型国内外流行现状 |
| 1.1.5 鲤疱疹病毒Ⅱ型宿主及临床症状 |
| 1.2 鲤疱疹病毒Ⅱ型检测方法 |
| 1.2.1 电子显微镜诊断技术 |
| 1.2.2 分子生物学检测 |
| 1.2.3 抗体检测 |
| 1.3 鲤疱疹病毒Ⅱ型刺激宿主的免疫反应 |
| 1.4 鲤疱疹病毒Ⅱ型疫苗研究 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 亚单位疫苗 |
| 1.5 杆状病毒表面展示系统 |
| 1.5.1 杆状病毒简介 |
| 1.5.2 杆状病毒作为基因表达载体 |
| 1.5.3 杆状病毒表面展示系统 |
| 1.6 本研究的目的、意义及主要内容 |
| 第二章 展示鲤疱疹病毒Ⅱ型膜蛋白的重组杆状病毒的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、质粒、菌株与细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液及配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pQBD-X系列重组质粒的构建 |
| 2.2.2 rAcMNPV-X系列重组杆状病毒的构建 |
| 2.2.3 Western blot检测重组蛋白 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 携带目标基因的重组质粒的构建 |
| 2.3.2 展示CyHV-2膜蛋白和GFP的重组杆状病毒构建 |
| 2.3.3 Western blot检测CyHV-2膜蛋白的表达 |
| 第三章 重组杆状病毒免疫效果的评价 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 异育银鲫、细胞和病毒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要溶液及配方 |
| 3.1.4 主要仪器与设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组杆状病毒rAcMNPV-GFP转导GiCK细胞 |
| 3.2.2 异育银鲫的免疫 |
| 3.2.3 免疫后宿主基因C3和IL-11表达水平检测 |
| 3.2.4 免疫后异育银鲫血清中Ig M水平检测 |
| 3.2.5 免疫后异育银鲫攻毒试验 |
| 3.2.6 统计学分析 |
| 3.3 结果和分析 |
| 3.3.1 重组杆状病毒rAcMNPV-GFP转导GiCK细胞 |
| 3.3.2 免疫后宿主基因C3和IL-11表达水平分析 |
| 3.3.3 免疫后异育银鲫血清中Ig M水平分析 |
| 3.3.4 重组杆状病毒疫苗保护率分析 |
| 第四章 鲫鱼和虹鳟IGM重链恒定区的融合表达及抗血清的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株、质粒和实验用兔 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要溶液及配方 |
| 4.1.4 主要仪器与设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 虹鳟和鲫鱼Ig M重链恒定区融合蛋白(JY-HZ-IgM)的表达 |
| 4.2.2 融合蛋白JY-HZ-IgM表达条件的优化 |
| 4.2.3 融合蛋白JY-HZ-IgM的纯化 |
| 4.2.4 抗血清的制备及特异性检测 |
| 4.2.5 抗血清效价检测 |
| 4.3 结果和分析 |
| 4.3.1 虹鳟、鲫鱼Ig M重链恒定区融合蛋白(JY-HZ-IgM)的表达 |
| 4.3.2 融合蛋白JY-HZ-IgM表达条件的优化 |
| 4.3.3 融合蛋白JY-HZ-IgM的纯化 |
| 4.3.4 抗血清的制备及特异性检测 |
| 4.3.5 融合蛋白JY-HZ-IgM抗血清效价的测定 |
| 第五章 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）鲤疱疹病毒2型研究进展（论文提纲范文）
| 1 病原学 |
| 1.1 病毒的分类及命名 |
| 1.2 病毒的特点 |
| 1.3 基因信息 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 历史和全球分布 |
| 2.2 病毒宿主 |
| 2.3 流行季节和传播方式 |
| 2.4 临床症状和病理特征 |
| 2.5 潜伏感染 |
| 3 诊断与检测 |
| 3.1 细胞培养分离 |
| 3.2 分子生物学检测技术 |
| 3.3 其他检测技术 |
| 4 防控措施 |
| 4.1 苗种检疫 |
| 4.2 免疫增强剂 |
| 4.3 改善养殖模式 |
| 4.4 疫苗 |
| 5 展望 |
（4）CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的原核表达和纯化（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 CTX-M-3 型超广谱β-内酰胺酶的原核表达 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二部分 CTX-M-3 型超广谱β-内酰胺酶的纯化和鉴定 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）水稻锚蛋白基因OsBIHN-N22和酯酰辅酶A合成酶基因OsBNHN-N7的克隆鉴定与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述与研究背景 |
| 1.1 植物抗病过程中涉及的信号传导途径 |
| 1.1.1 植物与病原菌互作过程中由R-Avr介导的信号传导途径 |
| 1.1.2 植物诱导抗病性中的信号途径 |
| 1.1.2.1 依赖于水杨酸(SA)的抗性途径 |
| 1.1.2.2 茉莉酸,乙烯介导的信号途径 |
| 1.2 锚蛋白的研究现状 |
| 1.2.1 锚蛋白的结构和异型结构体 |
| 1.2.1.1 锚蛋白结构 |
| 1.2.1.2 锚蛋白异形体 |
| 1.2.2 锚蛋白相互作用蛋白 |
| 1.2.2.1 与细胞骨架蛋白相互作用的锚蛋白 |
| 1.2.2.2 锚蛋白与膜蛋白的互相作用 |
| 1.2.3 锚蛋白重复序列(ankyrin repeat,ANK repeat) |
| 1.3 植物中的锚蛋白 |
| 1.3.1 与植物生长、发育相关的锚蛋白 |
| 1.3.2 参与植物抗逆性的锚蛋白 |
| 1.3.3 参与植物抗病性的锚蛋白 |
| 1.3.3.1 NPR1-SA信号途径中的关键基因 |
| 1.3.3.2 ACD6-拟南芥中典型的ankyrin-repeat蛋白 |
| 1.3.3.3 与植物抗病性有关的其它锚蛋白 |
| 1.3.4 拟南芥中的AtAnkTM基因家族 |
| 1.4 AMP-binding protein家族 |
| 1.4.1 脂类在植物中的作用 |
| 1.4.2 脂类在植物抗病性中的作用 |
| 1.4.2.1 乙酰辅酶A合成酶(acctyl-CoA synthetases) |
| 1.4.2.2 萤火虫荧光素酶(luciferases) |
| 1.4.2.3 4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase) |
| 1.4.2.4 聚酮化合物生物合成酶类(polyketide synthetase) |
| 1.5 本研究的目的意义和主要研究内容 |
| 1.5.1 选题依据及研究的目的和意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.6 研究的技术路线 |
| 第二章 水稻锚蛋白基因OsBIHN-N22的克隆鉴定及其基因表达分析 |
| 摘要 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 水稻幼苗的培育与处理 |
| 2.2.2 OsBIHN-N22 cDNA基因的克隆 |
| 2.2.3 DNA测序和序列分析 |
| 2.2.4 pSGFP-OsBIHN-N22蛋白的核定位分析 |
| 2.2.4.1 pSGFP-OsBIHN-N22重组质粒的构建 |
| 2.2.4.2 金粉悬浮液的制备及金粉pSGFP-OsBIHN-N22样品的包埋 |
| 2.2.4.3 基因枪轰击 |
| 2.2.5 水稻基因组的Southern杂交分析 |
| 2.2.6 Northern杂交分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 OsBIHN-N22基因编码水稻的一个锚蛋白 |
| 2.3.2 OsBIHN-N22编码的是一种Ankyrin Repeat锚蛋白 |
| 2.3.3 OsBIHN-N22在水稻基因组中的结构分析 |
| 2.3.4 OsBIHN-N22蛋白位于细胞膜上 |
| 2.3.5 OsBIHN-N22基因在水稻抗病反应中的差异表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 水稻酯酰辅酶A合成酶基因OsBNHN-N7的克隆鉴定与表达分析 |
| 摘要 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 供试水稻、处理和接种 |
| 3.2.2 水稻OsBNHN-N7基因cDNA序列的克隆 |
| 3.2.3 DNA测序和序列分析 |
| 3.2.4 Southern印迹杂交 |
| 3.2.5 Nouthern印迹杂交分析 |
| 3.2.6 OsBNHN-N7融合蛋白的原核表达 |
| 3.2.6.1 原核表达载体pRSET A-OsBNHN-N7的构建 |
| 3.2.6.2 OsBNHN-N7蛋白的诱导表达及制备 |
| 3.2.6.3 OsBNHN-N7蛋白的纯化 |
| 3.2.7 OsBNHN-N7蛋白的亚细胞定位分析 |
| 3.2.7.1 326-GFP3G-OsBNHN-N7重组质粒的构建 |
| 3.2.7.2 样品包埋与基因枪轰击 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 OsBNHN-N7基因编码一个水稻酯酰辅酶A合成酶 |
| 3.3.2 OsBNHN-N7在水稻基因组中的结构分析 |
| 3.3.3 OsBNHN-N7蛋白的原核表达 |
| 3.3.4 OsBNHN-N7蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3.5 OsBNHN-N7基因在水稻抗病反应中的差异表达 |
| 3.4 讨论 |
| 全文总结和今后研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）鸡志贺氏菌ESBLs的基因型检测及其感染的实验性治疗（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 志贺氏菌概述 |
| 1.2 志贺氏菌对常用各种治疗药物的耐药机制 |
| 1.3 控制耐药志贺氏菌的对策 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 广谱β-内酰胺酶的测定:临床分离株遇Nitrocefin纸片较快呈红色为++。 |
| 4.2 ESBLs的检测结果 |
| 4.3 扩增、酶切结果及序列分析 |
| 4.4 体外抑菌试验 |
| 4.5 复方混悬液的制备 |
| 4.6 体内疗效实验结果 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献: |
| 英文摘要 |
（9）TEM-104编码基因的克隆与原核表达（论文提纲范文）
| 材料和方法 |
| 一、细菌及表型鉴定 |
| 二、细菌质粒DNA提取与聚合酶链反应 (PCR) 扩增 |
| 三、PCR产物的纯化、T-A克隆 |
| 四、核苷酸序列测定及分析 |
| 五、接合试验 |
| 六、原核表达 |
| 七、表达鉴定 |
| 八、表型鉴定 |
| 九、等电点测定 |
| 结果 |
| 一、基因型鉴定 |
| 二、临床分离菌株与相应接合子的PCR结果 |
| 三、TEM-104型β-内酰胺酶基因所表达的酶特性 |
| 讨论 |
| 志谢 |
（10）产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌流行病学及分子生物学研究（论文提纲范文）
| 一. 第一部分摘要（合肥市产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌流行病学研究） |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 二. 第二部分摘要（浙江省TEM型β-内酰胺酶的分子生物学及相关特性研究） |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 三. 第一部分正文（合肥市产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌流行病学研究） |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 四. 第二部分正文（浙江省TEM型β-内酰胺酶的分子生物学及相关特性研究） |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 五. 课题小结 |
| 小结 |
| 六. 附录 |
| 综述： 超广谱β-内酰胺酶研究进展 |
| 参考文献（综述部分） |
| 在学期间发表论文 |
| 致谢 |
四、TEM-104编码基因的克隆与原核表达（论文参考文献）
- [1]鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）潜在毒力基因的研究[D]. 金李萍. 上海海洋大学, 2021(01)
- [2]展示鲤疱疹病毒Ⅱ型膜蛋白的重组杆状病毒的构建及其对异育银鲫免疫保护效果的研究[D]. 曹志伟. 西北农林科技大学, 2019(08)
- [3]鲤疱疹病毒2型研究进展[J]. 袁锐,陈静,刘训猛,吴亚锋,王晶晶,方苹. 水产学杂志, 2019(01)
- [4]CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的原核表达和纯化[D]. 李翊泉. 广州医学院, 2010(03)
- [5]铜绿假单胞菌产TEM-147型ESBL基因的克隆及原核表达[J]. 赵廷坤,周岐新. 中华检验医学杂志, 2008(04)
- [6]铜绿假单胞菌产TEM-29型ESBL基因的克隆及原核表达[J]. 赵廷坤,凌保东,周岐新,刘刚,雷军. 中国抗生素杂志, 2006(10)
- [7]水稻锚蛋白基因OsBIHN-N22和酯酰辅酶A合成酶基因OsBNHN-N7的克隆鉴定与功能分析[D]. 张新春. 浙江大学, 2006(03)
- [8]鸡志贺氏菌ESBLs的基因型检测及其感染的实验性治疗[D]. 司红彬. 河南农业大学, 2006(01)
- [9]TEM-104编码基因的克隆与原核表达[J]. 李家斌,李旭,马亦林,俞云松. 中华传染病杂志, 2004(06)
- [10]产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌流行病学及分子生物学研究[D]. 李家斌. 浙江大学, 2002(02)