一、人用地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺中样品浓度对纯化效果的影响（论文文献综述）
申雪静[1]（2019）在《狂犬病病毒G蛋白在水稻胚乳中的表达及鉴定》文中认为狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒引起的一种急性接触性人畜共患病,又称恐水症,俗称疯狗病。狂犬病的临床特征主要表现为:神经兴奋和意识障碍,继而会因为出现局部或全身麻痹而死亡。病理变化主要特征:非化脓性脑炎和神经细胞细胞浆内出现内基小体。狂犬病病毒呈典型的子弹头状或试管状,直径为75 nm,长度为200～300 nm,大小为12 kb左右。该病毒由11928～11932个核苷酸组成,共编码五种不同的结构蛋白,从3’端到5’端依次是:核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录酶大蛋白。G蛋白是一种跨膜蛋白,参与构成病毒表面突起,能与宿主细胞表面的受体结合,并诱导机体产生中和抗体的结构蛋白,在狂犬病的致病过程中起着决定性的作用,还参与狂犬病病毒介导细胞融合和抗体结合等免疫机制。为了在体外能得到免疫活性高,高表达、易储存、成本低的G蛋白,本研究将狂犬病病毒G蛋白导入到水稻的胚乳中表达。首先从NCBI中选出狂犬病病毒G基因序列,并按照水稻偏爱密码子优化G基因序列,然后由南京金斯瑞公司合成,以pUC57为载体,将优化后的G基因序列连接到pUC57,构建成pUC57-G重组质粒,通过双酶切MlyⅠ和XhoⅠ将G基因插入到中间载体pMP3上,成功的构建中间载体pMP3-G,然后用EcoRI和HindⅢ双酶切中间载体pMP3-G和植物载体pCAMBIA1300,回收,T4DNA连接酶连接后,导入大肠杆菌,经过酶切和测序鉴定,成功构建植物表达载体pCAMBIA1300-G,通过电激法,将重组质粒pCAMBIA1300-G转化到根癌农杆菌EHA105中,经过PCR鉴定,重组质粒已成功地转化到农杆菌中。挑选完整、饱满的水稻种子进行消毒,放在诱导培养基上诱导愈伤,重组质粒pCAMBIA1300-G经过农杆菌EHA105侵染的愈伤组织,导入水稻愈伤组织中,27℃暗培养3d,经头孢水洗愈伤,然后放在含头孢和潮霉素筛选培养基上暗培养长出新愈伤、转化到分化培养基上出芽、最后在生根培养基上生根,获得308株植株、取308株植株叶片,通过CTAB法提取叶片基因组DNA,用PCR鉴定有79株为阳性,经过炼苗、种植共获得50株转基因植株。将获得的50株表达植株进行检测,先研磨,其次加入提取液（25 mM Tris pH8.0）,室温提取1h,离心后用抗原检测试纸条和Western blotting检测G蛋白。最后挑选出高表达、反应原性好的4个株系的T1代种子,将这4个株系的T1代种子通过人工组织培养的方法进行生根和种植,待其生长稳定后,取每株水稻的叶片,用CTAB法提取叶片的基因组总DNA,以水稻特有单拷贝基因REB4作为内参,通过实时荧光定量PCR（qPCR）方法筛选纯合子并计算其拷贝数,其结果显示:132植株中筛选纯合植株为35株。纯合植株的拷贝数分别为1,2,3,5,7,11和16。将获得的T2纯合种子进行再次进行表达量和活性检测,最终挑选出7株高表达量植株,通过再次种植,获得纯合子植株。同时筛选不同的缓冲液溶解G蛋白,然后筛选不同的填料富集G蛋白,最终筛选到溶解蛋白的PB缓冲液和富集蛋白阳离子填料,为下一步中间纯化和精细纯化奠定基础。本研究致力于狂犬病病毒G蛋白在水稻中的表达及纯合子植株的筛选,为制备新型狂犬病G蛋白亚单位疫苗奠定基础。
王娟[2]（2019）在《甲型H1N1、H3N2流感病毒在MDCK细胞系上的增殖特性研究》文中认为目前动物细胞生物反应器大规模培养技术被广泛应用于病毒类疫苗的生产中。国外应用该技术生产的流感病毒细胞疫苗已通过安全认证并在临床上得到广泛使用。而我国的流感疫苗生产仍以落后的鸡胚工艺为主。鸡胚苗因其生产存在劳动强度大、效率低、批量小、易污染、成本高,发病时还可能出现SPF鸡胚供应不足、应急能力差等缺陷,在生产实践中已日趋淘汰。为了提高流感疫苗的产量、质量和市场竞争力,尽快开发生物反应器大规模培养动物细胞生产流感病毒细胞苗的工艺技术,成为我国疫苗生产企业急待攻克的技术难关。当前,疫苗企业在开发流感细胞疫苗中发现,在大规模培养的动物细胞内,流感病毒增殖效率较低,不能在短时间内达到配制疫苗所要求的病毒滴度,限制了流感病毒细胞苗的开发速度。据报道犬肾来源的MDCK细胞对流感病毒敏感,在兽用疫苗生产中已得到应用。本文通过将两株甲型H1N1和H3N2流感病毒疫苗毒毒株,分别在SPF鸡胚中增殖、扩增,构建工作种毒库,进行了生物学鉴定。然后在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞上进行培养、增殖适应与传代驯化,探索了两株流感病毒在MDCK细胞系上的培养、增殖条件与规律,确定了最佳病毒感染复数（MOI）、最佳接毒与收毒时间,提高了两株流感病毒在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞上增殖后的血凝效价（HA）和病毒滴度(CCID50)。其中甲型H1N1株在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞中增殖时,其HA均可达到28HA units/25μl;CCID50分别可达到7.50TU/ml和7.32TU/ml;甲型H3N2在两种MDCK细胞中复制,所得毒液的HA略低于H1N1,最高可达27HA units/25μl,CCID50最高分别可达7.12 TU/ml和6.79TU/ml,能够满足疫苗生产对抗原含量的要求。最后,根据优化后的病毒培养条件参数,分别将两株病毒在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞上培养、扩增,然后收毒、冻存,进行生物学鉴定,建立了两株病毒的细胞毒工作代毒库和种子毒毒库,为后续利用生物反应器培养MDCK细胞生产流感病毒细胞疫苗,奠定了病毒基础,对以MDCK细胞为培养基质的流感病毒细胞疫苗的开发与生产具有重要意义。
杨国松[3]（2017）在《人用狂犬病疫苗制备研究》文中认为狂犬病是有极高致死率的中枢神经系统急性传染性疾病,它由狂犬病毒感染所导致,至今还没有切实有效的治疗方法,只能通过注射狂犬病疫苗预防狂犬病发生。目前,狂犬疫苗为培养细胞制备病毒收获液,经病毒收获液浓缩、灭活、纯化、配制、冻干等工艺制备的全病毒灭活疫苗,所用疫苗毒株主要为国外分离的PV株、PM株、Flury株和国内分离的aG株、CTN株,所用细胞基质主要有原代地鼠肾细胞、Vero细胞、MRC-5人二倍体细胞等,上游生产工艺主要有转瓶培养工艺,细胞工厂生产工艺和生物反应器生产工艺,纯化工艺主要有分子筛层析纯化、离子交换纯化等。本文主要进行了 aG株狂犬病毒RNA的提取、PCR扩增、测序及序列分析,确认其同其他疫苗株及检定用攻击毒株的遗传亲缘距离,较高微载体浓度的狂犬病毒生物反应器培养条件的试验,分子筛、阴阳离子交换纯化条件的摸索试验和初步过敏性安全评价试验,确定了以国内分离狂犬病毒株、市售培养基高微载体密度生物反应器病毒培养方法、不经DNA酶处理的纯化方法构成人用狂犬疫苗制备工艺。1、狂犬病病毒RNA提取、测序及序列比对分析。2、艾本德NBS Cellgen 310 7.5L生物反应器狂犬病毒培养条件的选择。3、狂犬病疫苗灭活纯化工艺的摸索。4、狂犬病疫苗样品的初步安全性有效性检定。通过本次的研究,确定了狂犬病毒的遗传谱系情况,以及狂犬病病毒培养和狂犬病疫苗的纯化,并且进行了初步检定,确定了狂犬病疫苗的制备工艺,为研发狂犬病疫苗的工艺优化提供了方向和依据。
杨莲花[4]（2015）在《凝胶层析与离子交换层析结合法纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗》文中研究说明2010版《中国药典》中人用狂犬病疫苗中的蛋白含量标准提高，要求纯化后未加稳定剂的病毒液中总蛋白含量不高于80μg/剂，牛血清蛋白残留应不高于50ng/剂，成品中宿主细胞蛋白残留不高于24μg/剂，提高纯化分离效果则是生物药企要攻克的问题之一。长期以来在层析系统应用的摸索实验中显示，凝胶层析（Speharose4Fast Flow，4FF）对宿主蛋白和牛血清蛋白分离效果较好，工作条件温和，但实际生产应用中由于样品杂质含量高，容易将层析柱进液口及凝胶孔径堵塞，延长分离时间而影响分离效果；离子交换层析（Core700），分辨率高，胶体积小，清洗方便，上样量大，分离时间短，在生物医药等领域得到广泛应用。本次实验将凝胶层析与离子交换层析按照core700-core700-4FF，Core700-4FF-4FF，Core700-4FF-Core700三种不同顺序组合使用，对实验样品进行纯化分离。本实验分为两部分：第一部分，选取3批实验样品，每批样品均按上述三种组合方法进行纯化分离，根据纯化后的总蛋白含量，宿主蛋白含量，牛血清蛋白含量，抗原含量，确定能达到药典标准的组合方式。经实验1得到，两种层析柱以Core700-4FF-4FF的组合方式使用时，分离效果较优于其他两种组合方式。第二部分，根据实验1的结果，将另外3批实验样品按照Core700-4FF-4FF的组合方法进行验证实验，检测最后纯化液的总蛋白含量、宿主蛋白含量、牛血清蛋白含量、抗原含量。通过两部分实验，两种层析柱以Core700-4FF-4FF的组合方式使用时，纯化后的检测结果符合2010版药典的要求，可以作为建立纯化工艺的参考，也可作为各相关技术人员操作及实验参考。层析系统在疫苗纯化中的应用研究一直是个备受关注课题，上样体积、上样速度、上样浓度和抗原收集起止点的选择，都是影响疫苗纯化效果的因素，而凝胶层析柱与离子交换层析柱的组合方式更好地发挥了两种层析柱的特点，优化了疫苗的纯化效果，生物药企可根据生产情况，合理灵活使用两种层析柱，保证疫苗质量，提高纯化效率，增加企业的经济效益。
张姝[5]（2013）在《不同狂犬疫苗免疫后血清交叉保护作用研究》文中认为目的：狂犬病是一种由狂犬病毒引起的致死性疾病，注射狂犬病疫苗是预防发病的重要手段。我国存在多种狂犬病毒流行株，这就要求疫苗能刺激机体产生对不同流行株具有交叉保护的广谱中和抗体。目前对我国市售的狂犬病疫苗的广谱保护性的研究较少，因此本研究将进行动物实验检测这些狂犬疫苗对不同株病毒的保护性。此外，研究表明多种包膜病毒（如HIV-1，流感病毒，丙型肝炎病毒）膜蛋白的糖基化会使病毒逃避抗体的中和作用，而狂犬病毒包膜蛋白G蛋白这方面的研究比较少，本研究也将探索狂犬病毒G蛋白的糖基化对病毒感染能力和抗体中和作用的影响。方法：本研究使用假病毒系统对我国狂犬疫苗的广谱保护性进行验证。选用四种不同株病毒制备的狂犬病疫苗对balb/c小鼠进行分组免疫并收获血清。制备几种具有HIV-1核衣壳和狂犬病毒G蛋白的假病毒，该假病毒携带荧光素酶报告基因，具有单轮感染能力，感染细胞可以表达荧光素酶。将假病毒与免疫血清共孵育后感染BHK-21细胞，根据荧光素酶表达量确定免疫血清对不同株狂犬假病毒中和能力。另一方面，通过定点突变的方法增加或减少病毒G蛋白上的糖基化位点，检测突变株病毒的感染能力以及免疫血清对病毒的中和能力。结果：成功包装了能够感染BHK-21细胞并表达荧光素酶的CVS-11株、CTN株、aG株假病毒，免疫了不同狂犬疫苗的小鼠体内产生的抗体对上述假病毒均具有中和能力。病毒G蛋白204位和247位氨基酸的糖基化对病毒的感染能力产生一定影响，单独增加204位糖基化使病毒感染能力增强，单独去除247位糖基化位点使病毒感染能力降低，同时进行上述两种变化则病毒感染能力下降。但改变上述糖基化位点，免疫血清对病毒的中和能力没有改变。结论：本研究证明了我国狂犬病疫苗免疫后血清对不同流行株具有中和能力，说明市售的四种狂犬疫苗能产生广谱中和抗体。狂犬病毒G蛋白204位和247位糖基化位点对病毒的感染能力具有一定的影响，但不能使病毒逃避抗体的中和作用，说明尽管不同毒株的抗原性和糖基化有所差异，但不影响中和抗体对这些病毒的中和能力。本研究中采用的假病毒检测方法还可以对其他狂犬病疫苗的适用性和质量进行评价。
董莉娟[6]（2011）在《HRSV纯化条件的探索及实验性疫苗免疫原性的初步评价》文中进行了进一步梳理人类呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, HRSV）是世界范围内引起各年龄组下呼吸道感染的重要病毒病原体之一,尤见于婴幼儿、老年人和免疫抑制个体,但临床上至今尚无安全有效的疫苗。本课题的研究目的是筛选出一种或几种HRSV的理想纯化方法,并对不同纯化产物进行免疫原性评价,为HRSV裂解纯化疫苗的研制积累一定的基础资料。研究内容主要包括：HRSV在人二倍体KMB17细胞上的大量繁殖、病毒收获液的超滤浓缩、HRSV不同方法的纯化和纯化条件的探索,以及纯化产物的免疫原性评价,并对灭活剂、佐剂和免疫程序等免疫原性的影响因素进行探索。使用细胞工厂和罗氏瓶两种容器培养HRSV,两者均可获得较高感染性滴度的病毒。细胞工厂培养HRSV的最佳条件还需进一步探索。将病毒收获液以100kD滤膜包超滤浓缩30倍和103倍后,分别使用蔗糖密度梯度离心法和Sepharose 4FF凝胶过滤层析法进行纯化,并对纯化产物进行感染性滴度检测、SDS-PAGE还原电泳分析及Western blot鉴别。经还原电泳,2种纯化方法制备的纯化产物都在60～70kD间呈现一主要条带,Western blot证实为HRSV特异性F蛋白。结果表明Sepharose 4FF凝胶过滤层析法比蔗糖密度梯度离心法更适合于HRSV的纯化,效果更好、效率更高。但柱体积、上样量、洗脱流速等条件会对纯化效果产生影响。将蔗糖密度梯度离心和Sepharose 4FF凝胶过滤层析2种方法纯化HRSV所得样品免疫ICR小鼠,抗体阳转率相同,中和抗体几何平均效价（GMT）相近,虽然免疫剂量不同（前者的病毒蛋白含量是后者的2.5倍）,但二者的免疫原性无统计学差异,说明Sepharose 4FF凝胶过滤层析法纯化产物的免疫原性较高。在纯化样品的免疫原性影响因素的探索中,甲醛灭活组的抗体阳转率和中和抗体GMT都比β-丙内酯灭活组的高；铝佐剂对实验性疫苗的免疫原性影响不大；虽然Od、7d、14d和0d、28d两个免疫程序均能诱导相对较高的中和抗体水平（1：9.51～1：11.31）,但结果提示多针免疫有助于提高抗体阳转率和中和抗体效价。
李云云[7]（2010）在《猪乙型脑炎抗原表位的原核表达及以减毒沙门氏菌为载体的口服疫苗的免疫原性研究》文中进行了进一步梳理乙型脑炎E蛋白是该病毒的主要的抗原蛋白,本实验将乙脑E蛋白主要抗原片段基因串联,包括E蛋白上两个重要抗原域73aa～88aa,292aa～402aa,并将其定向连接至原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-EAB。将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta（DE3）,试验确定表达出的目的蛋白主要以包涵体的形式存在。使用Western Blot方法对纯化复性后的包涵体进行检测,证实其具有免疫活性。,从克隆质粒pET-EAB中酶切出EAB基因,并与酶切回收的真核表达载体pCI-neo定向连接,构建出真核表达质粒pCI-EAB。将重组质粒pCI-EAB转染Vero细胞,其表达产物通过RT-PCR和间接免疫荧光试验的方法检测出目的基因的转录与表达。以1×107、1×108、1×109CFU剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其体内安全性和稳定性。结果表明,利用该减毒沙门氏菌作为载体具有相对安全性,用限制性酶切分析鉴定证实,重组质粒在S.C500菌株在体内比较稳定。体外培养S.C500／pCI-EAB重组菌,分析其在体外的稳定性,结果表明OD600nm在0.8左右质粒是比较稳定的。以1×108CFU剂量的重组菌口服免疫小鼠,同时设含空载体沙门氏菌口服组,质粒pCI-EAB肌肉注射组和PBS口服做参比对照。检测免疫小鼠血清抗体水平,脾脏淋巴细胞增殖功能,外周血T淋巴细胞亚群的差异。结果显示在二免后一周和三免后一周,重组菌抗体水平与S.C500/pCI-neo空载体组差异显着（p<0.01）；脾脏淋巴细胞增殖情况显示,重组菌对ConA有显着的反应性,且与对照组差异明显,同时CD3+、CD4+、CD8+T细胞的数量也显着高于对照组（p<0.01）。上述结果初步表明以减毒沙门氏菌为载体的口服疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,为防治猪乙型脑炎提供了口服活菌疫苗的研制奠定了基础。
季新成[8]（2010）在《牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒分子生物学检测技术研究》文中进行了进一步梳理牛传染性鼻气管炎（IBR）和牛病毒性腹泻（BVD）是危害养牛业的两种重要病毒性传染病,给养牛业造成巨大的经济损失,我国进出境牛及其产品大多有对这两种疫病检疫的要求。牛精液中可携带这两种病毒,其在人工受精技术中的广泛应用是将该病传播给未感染牛群及地区的重要途径之一。目前对牛精液中这两种病的检测大多采用病毒分离的方法,因精液自身的细胞毒性及抗病毒活性,致使检测灵敏度极大的降低。虽然PCR方法已应用于这两种病毒的检测,但因精液中抑制PCR扩增成分的存在,致使检测灵敏度降低或操作复杂,抑制成分的存在也常造成假阴性结果的发生。结合进出境检验检疫工作,本研究完成了以下内容:1.采用Institue pourquier公司的IBRV血清抗体检测试剂盒完成了新疆地区684份牛血清IBRV抗体检测,检出阳性血清370份,最高阳性率达97.6%,最低为5.0%,平均为54.1%。在近3年具有流产史记录的四个牛群中,有3个牛场牛IBRV抗体阳性率高达100.0%,1个牛场为12.5%,平均为90.5%。结果显示该病已在新疆普遍存在,感染没有明确的地域分布。2.根据牛疱疹病毒1型（BHV1）gB基因序列,设计引物和荧光探针,通过搭桥法PCR扩增,构建了BHV1内标法荧光定量PCR共扩增模板,进一步构建了共扩增荧光PCR检测体系,该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的核酸分子。经对牛精液中抑制荧光PCR扩增成分进行分析和去除方法的研究,将该方法直接用于牛精液中IBRV的检测,可检测到牛精液中0.02 TCID50病毒,检测时间在2.5h之内。检测灵敏度比不含内标的荧光PCR检测方法低10倍,比病毒分离方法高500倍,比普通PCR方法高50倍,比OIE已报道的方法灵敏度高40倍。通过对120份新鲜牛精液、40份冷冻牛精液和39份牛鼻腔拭子检测,得到阳性样品27份。含有共扩增内标模板的检测体系可对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高PCR检测准确率的目的。通过对定期采集的10头牛血清样品IBRV抗体检测,发现精液阳性牛血清抗体不一定为阳性,血清抗体阳性牛精液中也不一定带毒,本试验结果初步表明不能以血清抗体阴阳性做为精液是否带毒的依据。鼻腔拭子带毒也只是间歇性的。3.采用Idexx公司BVDV血清抗体检测试剂盒完成了新疆地区875份牛血清BVDV抗体检测,共检出抗体阳性血清759份,最高阳性率为100.0%,最低为55.0%,平均为86.7%,从已有的数据来看,近3年有过流产史的牛血清BVDV抗体阳性率普遍偏高。感染牛没有明显的年龄差别。结果显示该病已在新疆普遍存在,且有不断增强的趋势。与病毒中和试验相比较,ELISA操作简便,并具有较好的敏感性和特异性,两者符合率为80.0%。4.采用Idexx公司BVDV抗原检测试剂盒从160份牛血清中检测出6份阳性血清,对这6分血清和随机选择的20份肛门拭子进行了病毒分离,成功分离出8株BVDV,8株分离毒株TCID50为4.38×103～5.82×106。对BVDV阳性血清的中和效价为1:23～1:26。8株分离株之间的同源性为87.5%～99.7%;与NADL株核苷酸序列同源性为82.0%～94.8%;与KE9株核苷酸序列同源性为81.0%～82.0%;分离株之间具有较高的同源性,表明该8株病毒与NADL株为同一基因型。5.建立了牛精液中BVDV荧光RT-PCR检测方法,该方法可检测到新鲜牛精液和冷冻牛精液中0.0125TCID50的病毒。灵敏度比常规RT-PCR高100倍,比病毒分离法高200～2000倍,研究发现,新鲜精液本身对RT-PCR扩增具有一定的抑制性,精液冻存液中的卵黄是抑制RT-PCR扩增的主要成分。用该方法对120份新鲜精液40份冻存精液进行检测,没有检测到阳性样品。对定期采集的10头牛血清BVDV抗体进行了检测,结果表明不能以血清抗体结果作为精液是否带毒的判定标准,血清抗体效价至少持续半年以上。6.根据IBRV gB基因、BVDV5’UTR区和犬新孢子虫Nc-5基因,通过PCR扩增各目的基因的特异性片段,成功构建了各特异性基因的重组质粒,在此基础上,建立了上述3种病原的多重PCR检测方法。将标有荧光染料的PCR产物变性后与芯片上寡核苷酸探针杂交,经系列反应条件的优化,建立了IBRV、BVDV和N. caninum 3种病原的基因芯片检测方法,本研究对三种病原重组DNA的检测灵敏度均为103拷贝/反应。对牛精液中IBRV和BVDV两种病毒的检测灵敏度约为0.1TCID50,且具有较好的特异性和可重复性。经检测应用,进一步证明了该方法的可行性。7.建立了IBRV、BVDV和N. caninum xMAP悬浮液态芯片检测技术。对基因组DNA分别进行xMAP悬浮芯片单重和多重目标物的检测试验,建立的方法具有较好的特异性和可重复性。对BVDV重组质粒可检测到102拷贝/反应,对NCP和IBRV的检测灵敏度为103拷贝/反应。比PCR灵敏度高10100倍。经检测应用,进一步证明了该方法的可行性。根据检测项目的不同,对临床样品分别采用了病毒分离、普通PCR、荧光PCR、基因芯片和悬浮芯片等方法进行了检测,结果表明,荧光PCR具有较高的灵敏度,悬浮芯片和基因芯片灵敏度次之。目前虽然有采用荧光PCR法、基因芯片法和悬浮芯片法等技术对动物疫病检测的研究,但尚未见将这些技术作为一个整体进行研究的报道,也没有以共扩增内标模板对检测结果进行质量控制的研究。本研究搭建了DNA病毒、RNA病毒和寄生虫病芯片检测技术平台,为今后更多动物疫病检测技术的研究开展奠定了基础。并同步完成了精液带毒与血清抗体关系进行了分析。结果的取得为出入境检验检疫条款的制定和检测方法的选择提供了依据,为进出境动物检验检疫提供了必要的技术储备。
岳雷[9]（2008）在《精氨酸和亮氨酸促进狂犬病病毒增殖及抗原纯化工艺的研究》文中研究说明为提高狂犬病病毒在细胞培养中的滴度及灭活疫苗的免疫效力,本课题对精氨酸和亮氨酸促进狂犬病病毒增殖及抗原纯化工艺进行了研究。结果表明,1.2mmol/L精氨酸、0.8mmol/L亮氨酸提高狂犬病病毒滴度分别为0.68㏒LD50/0.03ml、0.53㏒LD50/0.03ml,与对照组差异显着（P<0.05）。通过葡萄糖、氨和乳酸浓度检测证明,添加精氨酸和亮氨酸对细胞代谢无影响。精氨酸组病毒培养24h、48h、72h和96h时,NO浓度比对照组分别提高了3.09、3.97、10.8和7.54μmol/L,两者差异显着（P<0.05）,而亮氨酸组与对照组无明显差异。经多克隆荧光抗体染色结果表明,与对照组相比,精氨酸和亮氨酸组病毒吸附由60min缩短为30min,病毒穿膜由90min缩短为60min;经核蛋白单克隆荧光抗体染色结果表明,病毒核蛋白合成由21h缩短为18h;经狂犬病病毒抗原检测试剂盒检测培养液,病毒阳性检出由54h提前到42h。建立了狂犬病病毒荧光定量检测方法（RV FQ-PCR）,通过对细胞培养中狂犬病病毒糖蛋白基因表达水平的检测结果表明,添加精氨酸和亮氨酸后24h、48h、72h和96h时糖蛋白基因表达水平分别为对照组的5.16、7.36、8.91、7.50倍和2.87、6.13、6.9、5.01倍;与常规PCR、荧光抗体法（FAT）和小鼠脑内接种法（MIT）进行小鼠和犬脑组织中人工感染狂犬病病毒检测的比较,FQ-PCR方法检测灵敏度分别为常规PCR、FAT和MIT的10、100和1000倍。通过浓缩方法的筛选和凝胶纯化方法的比较结果证明,应用超滤膜堆对狂犬病病毒液进行5060倍浓缩,采用Sepharose 4 FastFlow凝胶进行纯化,杂蛋白去除率在99%以上,抗原回收率在77%以上,抗原比活性提高25.59倍。此工艺可线性放大,操作简便,适合于工业化生产。
刘林立[10]（2008）在《狂犬病浓缩纯化灭活疫苗的实验研究》文中研究说明据我国CDC统计,2008年我国人狂犬病发病数已突破3000例,正在形成第三次流行高峰。流行病学调查表明,95%以上的人狂犬病病例是因为与患病或带毒的犬和猫直接或间接接触引起的。因此,有效遏制人狂犬病,必须控制动物狂犬病,研制安全有效的动物狂犬疫苗,对狂犬病流行地区的犬、猫等动物施行强制免疫接种。而疫苗的质量,即疫苗的免疫原性和安全性是预防狂犬病的关键。为此,我们开展了狂犬病浓缩纯化灭活疫苗的实验研究。本研究首先对犬五联弱毒疫苗中的狂犬病毒ERA株第15代Vero细胞培养毒Rb/E3-15进行了鉴定。鉴定后的Rb/E3-15株,用Vero细胞大量增殖,经醋酸锌沉淀浓缩, Sepharose 4FF层析纯化;通过BPL（β-丙内酯）和甲醛的灭活比较实验,选择了低浓度BPL灭活抗原,配以合适比例的脂质体和Al（OH）3佐剂,制备了狂犬病浓缩纯化灭活佐剂疫苗。为了找到一种对狂犬疫苗抗体检测的理想方法,我们分别用本实验室建立的荧光抗体病毒中和试验（FAVN）、快速荧光灶抑制试验和犬抗体检测试剂盒（ELISA法）对实验室收集的狂犬疫苗免疫后的犬血清进行测定比较,结果显示FAVN与ELISA法、RFFIT法具有相似的敏感性与特异性。用制备的浓缩纯化灭活佐剂疫苗免疫小鼠和犬,FAVN法测定免疫后抗体,结果显示该浓缩纯化灭活疫苗可诱导小鼠和犬产生高水平中和抗体,小鼠攻毒实验使小鼠获得完全的免疫保护;在犬体内诱导的中和抗体水平明显优于浓缩纯化前疫苗,犬的外周血淋巴细胞转试验检测表明,脂质体佐剂疫苗的细胞免疫效果要优于Al（OH）3佐剂疫苗。该浓缩纯化灭活疫苗接种受试动物后无不良反应,疫苗安全性好。
二、人用地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺中样品浓度对纯化效果的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人用地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺中样品浓度对纯化效果的影响（论文提纲范文）
（1）狂犬病病毒G蛋白在水稻胚乳中的表达及鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 狂犬病病毒的病原结构 |
| 1.1.1 N蛋白 |
| 1.1.2 P蛋白 |
| 1.1.3 M蛋白 |
| 1.1.4 G蛋白 |
| 1.1.5 L蛋白 |
| 1.2 RABV的抵抗力 |
| 1.3 RAB的临床症状与病理变化 |
| 1.3.1 RAB的临床症状 |
| 1.3.2 RAB的病理变化 |
| 1.4 狂犬病的发病机理 |
| 1.5 RAB诊断方法 |
| 1.5.1 临床特征与病理变化检测 |
| 1.5.2 免疫学方法检测 |
| 1.5.3 动物接种试验 |
| 1.5.4 分子生物学方法检测 |
| 1.6 RAB的防控 |
| 1.7 RAB传统疫苗的研究进展 |
| 1.7.1 巴斯德疫苗 |
| 1.7.2 山氏疫苗与费氏疫苗 |
| 1.7.3 禽胚疫苗 |
| 1.7.4 原代细胞培养苗 |
| 1.7.5 传代细胞培养苗 |
| 1.7.6 人二倍体细胞苗 |
| 1.8 RAB新型疫苗的研究进展 |
| 1.8.1 RAB亚单位疫苗 |
| 1.8.2 DNA疫苗 |
| 1.8.3 病毒活载体疫苗 |
| 1.8.4 新型佐剂疫苗 |
| 1.9 植物表达系统 |
| 第二章 植物表达载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 常用试剂 |
| 2.2.2 重要仪器设备 |
| 2.2.3 引物的设计 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 重组中间载体pMP3-G的构建 |
| 2.3.2 重组植物载体pCAMBIA1300-G的构建 |
| 2.3.3 测序鉴定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 重组表达载体pMP3-G的构建与鉴定 |
| 2.4.2 重组植物表达载体pCAMBIA 1300-G的构建 |
| 2.4.3 重组植物表达载体pCAMBIA 1300-G测序鉴定 |
| 2.4.4 结果讨论 |
| 第三章 水稻的遗传转化与T0代阳性植株的鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 常用试剂 |
| 3.2.2 常用仪器 |
| 3.2.3 培养基及常用溶液的配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 愈伤诱导 |
| 3.3.2 摇菌 |
| 3.3.3 铺菌 |
| 3.3.4 侵染 |
| 3.3.5 筛选 |
| 3.3.6 分化 |
| 3.3.7 生根 |
| 3.3.8 炼苗、移栽 |
| 3.3.9 阳性植株的鉴定 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 诱导愈伤 |
| 3.4.2 共培养 |
| 3.4.3 筛选、分化、生根及移栽 |
| 3.4.4 T_O代阳性植株的鉴定 |
| 3.4.5 讨论 |
| 第四章 G蛋白的表达及纯合子植株的鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 常用试剂 |
| 4.2.2 常用仪器 |
| 4.2.3 常用试剂的配置 |
| 4.2.4 引物的合成 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 G蛋白在T1代水稻胚乳中的表达鉴定 |
| 4.3.2 T2代纯合植株的鉴定 |
| 4.3.3 转入外源基因G基因拷贝数的确定 |
| 4.3.4 RAB G蛋白的初步纯化与富集 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 G蛋白在水稻胚乳中的表达鉴定 |
| 4.4.2 G基因引物的特异性检测 |
| 4.4.3 纯合子植株的筛选 |
| 4.4.4 G基因拷贝数的计算 |
| 4.4.5 RAB G蛋白的初步纯化与富集 |
| 4.4.6 结果讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（2）甲型H1N1、H3N2流感病毒在MDCK细胞系上的增殖特性研究（论文提纲范文）
| 项目基金来源 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 甲型流感病毒疫苗的研究现状 |
| 1.1 甲型流感病毒的危害 |
| 1.2 甲型流感病毒的分子结构特点 |
| 1.3 甲型流感病毒感染机制 |
| 1.4 甲型流感疫苗国内外研究现状 |
| 2 动物细胞培养技术的发展 |
| 2.1 细胞培养的概念 |
| 2.2 细胞培养的起源 |
| 2.3 动物细胞培养方法 |
| 2.3.1 贴壁培养 |
| 2.3.2 悬浮培养 |
| 2.4 细胞大规模培养的现状 |
| 3 MDCK细胞流感疫苗生产 |
| 3.1 MDCK细胞系的介绍 |
| 3.2 MDCK生产流感病毒疫苗的优点 |
| 3.3 MDCK细胞生产流感病毒疫苗的国内外研究 |
| 4 本研究的目的、内容及意义 |
| 第二章 流感病毒在MDCK贴壁细胞上的增殖特性研究 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞株和病毒株 |
| 1.1.2 实验试剂和主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞复苏 |
| 1.2.2 贴壁培养型MDCK细胞传代 |
| 1.2.3 细胞活力测定 |
| 1.2.4 病毒种子库建立 |
| 1.2.5 病毒种子库生物学检定 |
| 1.3 敏感性试验 |
| 1.4 试验方案 |
| 1.4.1 细胞接种密度对流感病毒增殖效果的影响 |
| 1.4.2 TPCK-胰酶浓度对流感病毒增殖效果的影响 |
| 1.4.3 病毒感染复数对流感病毒增殖效果的影响 |
| 1.4.4 病毒感染时间对流感病毒增殖效果的影响 |
| 1.4.5 收毒时间对流感病毒增殖效果的影响 |
| 2 试验结果与分析 |
| 2.1 细胞复苏活力测定结果 |
| 2.2 病毒种子库生物学检定结果 |
| 2.3 敏感性试验结果 |
| 2.4 细胞接种密度对流感病毒增殖效果的影响结果 |
| 2.5 胰酶浓度对流感病毒增殖效果的影响 |
| 2.6 病毒感染复数对流感病毒增殖效果的影响结果 |
| 2.7 接毒时间对流感病毒的增殖效果影响结果 |
| 2.8 收毒时间对流感病毒的增殖效果影响结果 |
| 3 本章小结 |
| 第三章 流感病毒在MDCK悬浮细胞上的增殖特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.1.1 细胞株和病毒株 |
| 1.1.2 实验试剂和主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 悬浮培养型MDCK细胞复苏与传代 |
| 1.2.2 细胞活力测定 |
| 1.2.3 敏感性试验 |
| 1.3 实验方案 |
| 1.3.1 MDCK悬浮细胞密度对流感病毒增殖效果的影响 |
| 1.3.2 病毒感染复数对流感病毒在MDCK悬浮细胞增殖效果的影响 |
| 1.3.3 流感病毒在MDCK悬浮细胞上最佳收毒时间 |
| 2 试验结果与讨论 |
| 2.1 MDCK悬浮细胞密度对流感病毒增殖效果的影响结果 |
| 2.2 病毒感染复数对流感病毒在MDCK悬浮细胞增殖效果的影响结果 |
| 2.3 流感病毒在MDCK悬浮细胞上最佳收毒时间 |
| 3 本章小结 |
| 第四章 流感病毒病毒库的建立及检定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 器械及设备 |
| 1.3 培养基(培养用液) |
| 1.4 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 无菌检查 |
| 2.1.1 培养基的配制及微生物促生长试验方法 |
| 2.1.2 待检样品检验 |
| 2.1.3 结果判定 |
| 2.2 支原体检查:培养法 |
| 2.2.1 培养基的配制及检验 |
| 2.2.2 样品检查 |
| 2.3 血凝滴度测定 |
| 2.4 病毒滴度测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 无菌检查结果 |
| 3.1.1 灵敏度结果 |
| 3.1.2 样品检查结果 |
| 3.2 支原体检查结果 |
| 3.2.1 灵敏度检查结果 |
| 3.2.2 样品检查结果 |
| 3.3 血凝滴度测定 |
| 3.4 病毒滴度测定 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 硕士期间已发表论文 |
| 硕士期间参与的课题研究 |
| 致谢 |
（3）人用狂犬病疫苗制备研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 狂犬病毒的病原学 |
| 1.3 致病性与免疫性 |
| 1.4 流行区域 |
| 1.5 疫苗的使用和研究现状 |
| 1.5.1 国外疫苗的发展 |
| 1.5.2 我国狂犬病疫苗的历史和现状 |
| 1.5.2.1 地鼠肾细胞狂犬病疫苗 |
| 1.5.2.2 Vero细胞狂犬病疫苗的发展 |
| 1.5.3 最新研究进展 |
| 1.6 本论文的主要任务 |
| 第二章 狂犬病毒RNA提取及测序分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 狂犬病毒 |
| 2.2.2 试剂与材料 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 试验方法 |
| 2.2.4.1 病毒RNA提取 |
| 2.2.4.2 引物设计 |
| 2.2.4.3 cDNA第一链合成 |
| 2.2.4.4 PCR反应 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 PCR产物结果 |
| 2.3.2 测序结果的比对分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 生物反应器大规模培养狂犬病毒研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 狂犬病毒及Vero细胞 |
| 3.2.2 试剂与材料 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 工艺流程 |
| 3.2.5 培养基 |
| 3.2.6 试验方法 |
| 3.2.6.1 分析检测方法 |
| 3.2.6.2 pH电极的校正 |
| 3.2.6.3 溶氧电极标定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 不同细胞接种浓度、不同微载体浓度的细胞生长曲线 |
| 3.3.2 不同病毒接种浓度对收获液病毒滴度的影响 |
| 3.3.3 连续灌流收获液的病毒滴度曲线及抗原曲线 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 狂犬病疫苗纯化方法研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 试验方法 |
| 4.2.3.1 超滤浓缩、灭活 |
| 4.2.3.2 分子筛凝胶过滤纯化 |
| 4.2.3.3 阴离子交换层析纯化 |
| 4.2.3.4 阳离子交换层析纯化 |
| 4.2.4 结果与讨论 |
| 4.2.4.1 分子筛凝胶过滤纯化 |
| 4.2.4.2 阴离子交换填料纯化 |
| 4.2.4.3 阳离子交换填料纯化 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 应用动物实验法进行初步安全性评价 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与检定方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 检定方法 |
| 5.2.2.1 异常毒性检定 |
| 5.2.2.2 豚鼠全身过敏性试验 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 异常毒性实验结果 |
| 5.3.2 豚鼠全身过敏实验结果 |
| 5.3.2.1 豚鼠体重情况统计 |
| 5.3.2.2 豚鼠过敏情况统计 |
| 5.4 小结 |
| 5.4.1 豚鼠过敏试验 |
| 5.4.2 异常毒性试验 |
| 第六章 结论与建议 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 建议 |
| 6.2.1 病毒核酸分析 |
| 6.2.2 病毒大规模培养工艺的放大 |
| 6.2.3 纯化工艺的优化 |
| 6.2.4 安全性评价的建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者及导师简介 |
| 附件 |
（4）凝胶层析与离子交换层析结合法纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 实验 |
| 2.1 实验试剂和仪器 |
| 2.2 样品制备 |
| 2.3 疫苗样品纯化及检定 |
| 第3章 结论与讨论 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）不同狂犬疫苗免疫后血清交叉保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 狂犬病介绍 |
| 1.1.1 狂犬病毒形态特征 |
| 1.1.2 狂犬病毒基因组结构 |
| 1.1.3 狂犬病毒的蛋白结构 |
| 1.1.4 狂犬病毒的 G 蛋白 |
| 1.1.5 狂犬病毒的生活周期 |
| 1.1.6 病毒分型 |
| 1.1.7 我国狂犬病流行病学 |
| 1.1.8 狂犬病毒疫苗 |
| 1.1.9 狂犬病毒中和抗体检测方法 |
| 1.2 本文的研究目的和设计思路 |
| 第2章 实验方法 |
| 2.1 试剂和材料 |
| 2.1.1 质粒菌株细胞 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 引物及测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物免疫方案 |
| 2.2.2 获得目的基因所需引物设计 |
| 2.2.3 提取总 RNA |
| 2.2.4 目的基因的扩增 |
| 2.2.5 片段连接、质粒转化及小提、测序鉴定 |
| 2.2.6 片段与真核表达载体连接并克隆 |
| 2.2.7 假病毒包装 |
| 2.2.8 Western-Blot |
| 2.2.9 假病毒滴度的测定 |
| 2.2.10 中和抗体检测 |
| 2.2.11 构建突变病毒质粒 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 质粒构建 |
| 3.1.1 目的基因的扩增 |
| 3.1.2 表达质粒的构建 |
| 3.2 假病毒包装 |
| 3.3 假病毒感染性检测 |
| 3.3.1 带有 GFP 报告基因的假病毒 |
| 3.3.2 带有 Luc 报告基因的假病毒 |
| 3.4 假病毒中和抗体检测 |
| 3.5 小鼠血清对病毒的中和活性 |
| 3.6 G 蛋白基因改造 |
| 3.6.1 定点突变及 overlap PCR |
| 3.6.2 突变病毒感染性检测 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）HRSV纯化条件的探索及实验性疫苗免疫原性的初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、HRSV的分子特征 |
| 二、HRSV感染的治疗和预防 |
| 三、病毒疫苗的纯化方法 |
| 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1、细胞与毒种 |
| 2、主要试剂和材料 |
| 3、主要仪器 |
| 4、实验动物 |
| 5、主要试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| 1、细胞培养 |
| 2、病毒培养 |
| 3、病毒感染性滴度(CCID_(50))检测 |
| 4、病毒的超滤浓缩 |
| 5、蔗糖密度梯度离心法纯化HRSV |
| 6、Sepharose 4FF凝胶过滤层析纯化HRSV |
| 7、SDS-PAGE电泳分析 |
| 8、Western blot法鉴定病毒 |
| 9、BCA法测定蛋白含量 |
| 10、牛血清白蛋白残留量检测 |
| 11、病毒灭活 |
| 12、免疫原性评价 |
| 13、血清中和抗体效价检测 |
| 14、统计分析 |
| 结果与分析 |
| 一、病毒的培养 |
| 二、病毒的超滤浓缩 |
| 三、蔗糖密度梯度离心法纯化HRSV |
| 四、Sepharose 4FF凝胶过滤层析法纯化HRSV |
| 五、免疫原性评价 |
| 讨论 |
| 一、病毒的培养 |
| 二、病毒的超滤浓缩 |
| 三、蔗糖密度梯度离心纯化HRSV |
| 四、Sepharose 4FF凝胶过滤层析纯化HRSV |
| 五、免疫原性评价 |
| 小结 |
| 问题及展望 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生简历 |
（7）猪乙型脑炎抗原表位的原核表达及以减毒沙门氏菌为载体的口服疫苗的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 乙型脑炎病原学特征 |
| 1.1 乙型脑炎的分类 |
| 1.2 理化特性 |
| 1.3 抗原性和免疫性 |
| 1.4 培养特性 |
| 1.5 病毒基因组的结构及其编码蛋白的特征 |
| 2 流行病学 |
| 3. E蛋白抗原表位研究 |
| 4 乙脑疫苗的研究进展 |
| 4.1 鼠脑纯化疫苗 |
| 4.2 地鼠肾细胞灭活疫苗 |
| 4.3 乙脑减毒活疫苗 |
| 4.4 乙脑的新型疫苗 |
| 4.4.1 以Vero细胞为基质培养乙脑病毒制备灭活疫苗 |
| 4.4.2 DNA疫苗 |
| 4.4.3 重组活疫苗 |
| 4.4.4 亚单位和合成肽疫苗 |
| 5 运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌载体系统研究进展 |
| 6 携带DNA疫苗重组减毒沙门氏菌的应用 |
| 6.1 减毒沙门氏菌用作细菌性DNA疫苗的载体 |
| 6.2 减毒沙门氏菌用作病毒性DNA疫苗的载体 |
| 6.3 减毒沙门氏菌用作寄生虫性DNA疫苗的载体 |
| 6.4 减毒沙门氏菌用作肿瘤DNA疫苗的载体 |
| 7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 乙型脑炎E蛋白抗原表位的基因串联及原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株、菌株及试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计和合成 |
| 1.2.2 猪乙型脑炎病毒总mRNA的提取 |
| 1.2.3 乙脑病毒RNA的提取 |
| 1.2.4 聚合酶链反应(PCR)扩增乙脑E蛋白主要抗原域两个片段 |
| 1.2.5 目的片段的回收 |
| 1.2.6 目的基因的克隆及鉴定 |
| 1.2.6.1 纯化后的目的片段与pMD-19 T Simple载体的连接 |
| 1.2.6.2 重组质粒转化感受态细胞 |
| 1.2.6.3 连接产物的转化 |
| 1.2.6.4 A克隆质粒重组菌的培养筛选 |
| 1.2.6.5 重组质粒的PCR鉴定 |
| 1.2.6.6 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.2.6.7 重组质粒的序列测定 |
| 1.2.7 原核表达载体pET-E_(AB)的构建 |
| 1.2.7.1 pMD-EAB和pET-32a(+)质粒酶切并回收 |
| 1.2.7.2 回收产物的连接 |
| 1.2.7.3 重组质粒转化 |
| 1.2.7.4 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.2.7.5 重组质粒的序列测定 |
| 1.2.8 重组表达菌株的培养及表达 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的可溶性检测 |
| 1.2.10 重组表达菌株原核表达研究 |
| 1.2.11 包涵体粗提与复性 |
| 1.2.11.1 包涵体的粗提 |
| 1.2.11.2 包涵体的复性 |
| 1.2.12 原核表达产物的Western blot分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增目的基因电泳鉴定 |
| 2.2 E_(AB)的重组质粒PCR和酶切鉴定 |
| 2.3 重组原核表达载体pET-E_(AB)的酶切鉴定 |
| 2.4 原核表达条件优化及其产物Western blot分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 运送乙脑抗原表位的减毒沙门氏菌的构建与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 工具酶和试剂盒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 真核表达载体的构建 |
| 1.2.1.1 pET-E_(AB)与pCl-neo的酶切 |
| 1.2.1.2 回收纯化片段E_(AB)和pCl-neo片段的定向连接 |
| 1.2.1.3 转化及鉴定 |
| 1.2.2 重组质粒转染Vero细胞 |
| 1.2.3 表达检测 |
| 1.2.4 重组质粒pCl-E_(AB)转化入减毒沙门氏菌S.C500 |
| 1.2.4.1 S.C500感受态细胞的制备 |
| 1.2.4.2 重组工程菌S.C500/pCl-E_(AB)的构建 |
| 1.2.4.3 转化入减毒沙门氏菌S.C500/pCl-E_(AB)的酶切鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 真核表达载体构建结果 |
| 2.2 检测目的基因的转录与表达结果 |
| 2.3 重组表达质粒转化沙门氏菌的结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 携带乙脑E蛋白抗原表位的减毒沙门氏菌的免疫生物学特征 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组沙门氏菌对小鼠的安全性试验 |
| 1.2.2 重组菌株免疫后在不同组织中的消长实验 |
| 1.2.3 重组沙门氏菌的体外稳定性试验 |
| 1.2.4 减毒沙门氏菌为载体的猪乙型脑炎E蛋白主要抗原表位DNA疫苗与裸DNA疫苗和弱毒疫苗免疫效果比较 |
| 1.2.4.1 用作肌肉注射免疫真核表达质粒pCl-E_(AB)和pCl-neo的大量制备及纯化 |
| 1.2.4.2 沙门氏菌为载体乙型脑炎E蛋白主要抗原表位DNA疫苗的制备 |
| 1.2.4.3 实验动物分组与免疫 |
| 1.2.4.4 间接ELISA测定特异性抗体 |
| 1.2.4.5 MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况 |
| 1.2.4.6 流式细胞仪检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组菌株安全性试验结果 |
| 2.2 重组菌株免疫后在不同组织中的消长动态 |
| 2.3 重组菌株体外稳定性实验 |
| 2.4 免疫小鼠抗JEV抗体动态变化规律 |
| 2.5 淋巴细胞增殖实验结果 |
| 2.6 小鼠T淋巴细胞亚类群数量分析结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒分子生物学检测技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 牛传染性鼻气管炎及其检测技术研究进展 |
| 1.1 牛传染性鼻气管炎的病原学 |
| 1.1.1 牛传染性鼻气管炎概况 |
| 1.1.2 牛传染性鼻气管炎的流行历史和分类地位 |
| 1.1.3 病毒粒子结构、形态及理化特性 |
| 1.1.4 培养特性和致病性 |
| 1.1.5 IBRV 的基因组结构 |
| 1.1.6 IBRV 基因组编码的主要蛋白 |
| 1.2 牛传染性鼻气管炎的流行病学 |
| 1.2.1 流行历史和分布 |
| 1.2.2 易感动物和传播途径 |
| 1.2.3 临床症状 |
| 1.2.4 致病机理 |
| 1.2.5 血清型 |
| 1.2.6 免疫 |
| 1.3 牛传染性鼻气管炎病的防控 |
| 1.3.1 弱毒苗 |
| 1.3.2 灭活苗 |
| 1.3.3 新型疫苗 |
| 1.4 牛传染性鼻气管炎检测技术研究进展 |
| 1.4.1 血清学检测 |
| 1.4.2 IBRV 亚型鉴别 |
| 1.4.3 病原鉴定 |
| 第二章 牛病毒性腹泻及其检测技术研究进展 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病原学 |
| 2.1.1 牛病毒性腹泻概况 |
| 2.1.2 牛病毒性腹泻病毒的分类地位 |
| 2.1.3 牛病毒性腹泻病毒粒子形态结构及理化特性 |
| 2.1.4 牛病毒性腹泻病毒的培养特性 |
| 2.1.5 牛病毒性腹泻病毒的基因组结构 |
| 2.1.6 病毒蛋白及功能 |
| 2.2 牛病毒性腹泻流行病学 |
| 2.2.1 流行历史、分布 |
| 2.2.2 传染源 |
| 2.2.3 传播媒介 |
| 2.2.4 易感动物和流行特征 |
| 2.2.5 分子流行病学特征 |
| 2.2.6 临床症状和致病机理 |
| 2.3 牛病毒性腹泻的预防与控制 |
| 2.3.1 常规疫苗 |
| 2.3.2 新型疫苗 |
| 2.4 牛病毒性腹泻检测技术研究进展 |
| 2.4.1 血清学试验 |
| 2.4.2 病原鉴定（国际贸易指定试验） |
| 第三章 生物芯片技术及其研究进展 |
| 3.1 固相芯片 |
| 3.1.1 基本概念及原理 |
| 3.1.2 固态生物芯片制备步骤 |
| 3.1.3 固态芯片的应用 |
| 3.1.4 存在的问题及展望 |
| 3.2 悬浮芯片 |
| 3.2.1 悬浮芯片技术基本原理 |
| 3.2.2 悬浮芯片技术的应用现状 |
| 3.2.3 液相芯片技术的优点及存在的不足 |
| 3.2.4 前景和展望 |
| 试验研究 |
| 第四章 新疆地区牛传染性鼻气管炎病毒血清抗体检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、样品和菌种 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器及耗材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 酶联免疫吸附试验检测 |
| 4.2.2 病毒中和试验（VN） |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 不同地区IBRV 血清抗体检测结果 |
| 4.3.2 两种试剂盒检测比较 |
| 4.3.3 病毒TCID50 的测定 |
| 4.3.4 ELISA 法与病毒中和试验比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛传染性鼻气管炎病毒内标荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 病毒、样品和菌种 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 引物和探针的设计合成 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 DNA 提取 |
| 5.2.2 目标模板的制备 |
| 5.2.3 内标模板的制备 |
| 5.2.4 不含内标的荧光PCR 反应条件建立 |
| 5.2.5 内标共扩增荧光定量PCR 反应体系建立 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 目标模板的制备 |
| 5.3.2 内标模板的构建 |
| 5.3.3 单重荧光PCR 反应条件建立 |
| 5.3.4 共扩增检测低限的测定 |
| 5.3.5 标准曲线的建立 |
| 5.3.6 方法的特异性、重复性检测 |
| 5.3.7 方法的灵敏度比较 |
| 5.3.8 方法的应用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 PCR 法是检测牛精液中IBRV 的良好方法 |
| 5.4.2 牛精液中抑制PCR 扩增成分的研究与去除 |
| 5.4.3 内标在荧光PCR 检测中的作用 |
| 5.4.4 本研究内标荧光PCR 体系的构建 |
| 5.4.5 内标限量的确定 |
| 5.4.6 关于精液带毒与血清抗体关系的分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 新疆地区牛病毒性腹泻病毒血清抗体检测 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 病毒、样品和菌种 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 主要仪器及耗材 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 酶联免疫吸附试验检测 |
| 6.2.2 中和试验（VN）对血清抗体效价的检测 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 ELISA 法对不同地区BVDV 抗体检测结果 |
| 6.3.2 病毒TCID50 的测定 |
| 6.3.3 ELISA 法与病毒中和试验比较 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 牛病毒性腹泻病毒的分离、鉴定与同源性分析 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 病毒、样品和菌种 |
| 7.1.2 试剂 |
| 7.1.3 主要仪器 |
| 7.1.4 引物的设计与合成 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 酶联免疫吸附试验对血清抗原的检测 |
| 7.2.2 病毒分离鉴定 |
| 7.2.3 分离毒株RT-PCR 检测鉴定 |
| 7.2.4 分离毒株测序及序列分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 病毒分离 |
| 7.3.2 分离株TCID50 的测定 |
| 7.3.3 分离毒株病毒中和试验结果 |
| 7.3.4 分离毒株RT-PCR 检测结果 |
| 7.3.5 重组质粒的鉴定 |
| 7.3.6 测序鉴定及同源性分析 |
| 7.3.7 核苷酸序列同源性比较 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 牛病毒性腹泻病毒荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立与应用 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 病毒、样品和菌种 |
| 8.1.2 主要试剂 |
| 8.1.3 主要仪器 |
| 8.1.4 引物、探针的设计与合成 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 RNA 提取 |
| 8.2.2 荧光RT-PCR 扩增条件的优化 |
| 8.2.3 方法的特异性、重复性检测 |
| 8.2.4 方法的灵敏度检测 |
| 8.2.5 方法的应用 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 荧光RT-PCR 反应条件的优化 |
| 8.3.2 方法的特异性和重复性 |
| 8.3.3 方法的检测灵敏度比较 |
| 8.3.4 方法的应用 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 第九章 IBRV、BVDV 和 N.caninum 基因芯片检测方法的建立与应用 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 病毒、样品 |
| 9.1.2 主要试剂 |
| 9.1.3 主要仪器设备 |
| 9.2 方法 |
| 9.2.1 模板的制备 |
| 9.2.2 引物、探针的设计与合成 |
| 9.2.3 目的基因片段PCR 的扩增 |
| 9.2.4 目的基因克隆与阳性质粒构建 |
| 9.2.5 芯片的制备 |
| 9.2.6 芯片杂交及结果判读 |
| 9.2.7 杂交条件的优化 |
| 9.2.8 芯片特异性检测 |
| 9.2.9 芯片敏感性检测 |
| 9.2.10 芯片重复性试验 |
| 9.2.11 方法的应用 |
| 9.3 结果 |
| 9.3.1 目的基因PCR 扩增结果 |
| 9.3.2 目的基因阳性质粒的制备与鉴定 |
| 9.3.3 芯片制备结果 |
| 9.3.4 寡核苷酸探针杂交结果 |
| 9.3.5 反应条件优化 |
| 9.3.6 特异性试验 |
| 9.3.7 芯片检测的敏感性 |
| 9.3.8 重复性试验 |
| 9.3.9 方法的应用 |
| 9.4 讨论 |
| 9.4.1 基因芯片技术是一种高通量鉴定手段 |
| 9.4.2 特异性是基因芯片的关键 |
| 9.4.3 基因芯片制备中样品荧光标记方法 |
| 9.4.4 影响芯片杂交信号的因素 |
| 9.5 小结 |
| 第十章 IBRV、BVDV 和 N. caninum 悬浮芯片检测方法的建立与应用 |
| 10.1 材料与方法 |
| 10.1.1 病毒、样品 |
| 10.1.2 主要试剂 |
| 10.1.3 xMAP 液态芯片检测中用的主要缓冲液及其配置 |
| 10.1.4 主要仪器设备 |
| 10.2 方法 |
| 10.2.1 模板的制备 |
| 10.2.2 引物、探针的设计与合成 |
| 10.2.3 目的基因片段PCR 的扩增及重组质粒的构建 |
| 10.2.4 探针与微球的耦联 |
| 10.2.5 探针交联效率的验证 |
| 10.2.6 杂交并检测 |
| 10.2.7 悬浮芯片杂交条件的优化 |
| 10.2.8 特异性试验 |
| 10.2.9 敏感性试验 |
| 10.2.10 重复性试验 |
| 10.2.11 方法的应用 |
| 10.3 结果 |
| 10.3.1 目的基因的单重和多重PCR 扩增及重组质粒的获得 |
| 10.3.2 色标微球上交联探针的确证 |
| 10.3.3 悬浮芯片杂交条件的优化结果 |
| 10.3.4 xMAP 悬浮芯片对3 种病原单重PCR 扩增和多重PCR 扩增检测 |
| 10.3.5 特异性试验 |
| 10.3.6 敏感性试验 |
| 10.3.7 重复性试验 |
| 10.3.8 方法的应用 |
| 10.3.9 悬浮芯片技术的应用 |
| 10.4 讨论 |
| 10.4.1 引物和探针的设计是基因芯片的关键 |
| 10.4.2 芯片制备的质量控制是悬浮芯片技术的主要保证 |
| 10.4.3 杂交条件的优化 |
| 10.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点和今后的研究思路 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）精氨酸和亮氨酸促进狂犬病病毒增殖及抗原纯化工艺的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 研究目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 促进病毒增殖的方法 |
| 2.2 有机小分子物质促进病毒增殖的研究进展 |
| 2.3 抗原纯化工艺的研究进展 |
| 第二章 试验部分 |
| 第一部分 氨基酸促进狂犬病病毒增殖的研究 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 3 试验结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 第二部分 荧光定量PCR 检测狂犬病病毒基因表达水平的研究 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 3 试验结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 第三部分 狂犬病灭活疫苗抗原纯化工艺的研究 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 3 试验结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 第三章 结论 |
| 1 主要结论 |
| 2 创新点 |
| 3 有待进一步解决的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）狂犬病浓缩纯化灭活疫苗的实验研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 狂犬病及狂犬病毒研究进展 |
| 第二章 狂犬病疫苗的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 狂犬病毒 ERA 株 Rb/E3-15 的细胞培养及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 狂犬病毒 Rb/E3-15 浓缩纯化灭活疫苗的制备及检验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 狂犬病抗体三种检测方法的比较实验 |
| 1 材料 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 动物免疫实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
四、人用地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺中样品浓度对纯化效果的影响（论文参考文献）
- [1]狂犬病病毒G蛋白在水稻胚乳中的表达及鉴定[D]. 申雪静. 河南农业大学, 2019(04)
- [2]甲型H1N1、H3N2流感病毒在MDCK细胞系上的增殖特性研究[D]. 王娟. 西北民族大学, 2019(01)
- [3]人用狂犬病疫苗制备研究[D]. 杨国松. 北京化工大学, 2017(02)
- [4]凝胶层析与离子交换层析结合法纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗[D]. 杨莲花. 吉林大学, 2015(08)
- [5]不同狂犬疫苗免疫后血清交叉保护作用研究[D]. 张姝. 吉林大学, 2013(09)
- [6]HRSV纯化条件的探索及实验性疫苗免疫原性的初步评价[D]. 董莉娟. 北京协和医学院, 2011(12)
- [7]猪乙型脑炎抗原表位的原核表达及以减毒沙门氏菌为载体的口服疫苗的免疫原性研究[D]. 李云云. 四川农业大学, 2010(03)
- [8]牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒分子生物学检测技术研究[D]. 季新成. 西北农林科技大学, 2010(10)
- [9]精氨酸和亮氨酸促进狂犬病病毒增殖及抗原纯化工艺的研究[D]. 岳雷. 中国兽医药品监察所, 2008(09)
- [10]狂犬病浓缩纯化灭活疫苗的实验研究[D]. 刘林立. 吉林大学, 2008(10)