一、HCVC区与HBc融合蛋白在大肠杆菌中表达及鉴定（论文文献综述）
赵振伯[1]（2020）在《以乙肝病毒核心抗原为载体的结直肠癌治疗性疫苗研究》文中研究说明结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。目前,对于CRC的临床治疗手段仍局限于手术切除、放疗和化疗。近年来,免疫治疗尤其是以新抗原（neoantigen）为靶点的免疫治疗在癌症治疗中备受关注。新抗原是一种肿瘤特异性抗原,由肿瘤细胞的基因突变产生,在正常细胞中无表达。与自身性抗原不同,新抗原作为一种“非我”的抗原被机体免疫系统识别,进而激发免疫系统产生特异性、高效且安全的免疫应答。较多的研究表明,靶向新抗原的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs）是杀伤肿瘤细胞的主要T细胞群体。然而,正常情况下,由于新抗原在癌细胞中的表达水平较低或是抗原提呈效率较低,所以病人体内靶向新抗原的特异性CTLs数量很少。因此,通过设计以新抗原为靶点的癌症疫苗来增强机体对新抗原的免疫应答是很有必要的。本研究首先通过融合PCR将新抗原Adpgk编码基因插入到截短型乙肝病毒核心抗原（HBcAg）（1-149aa）第78、79位氨基酸编码序列之间,并将融合基因克隆至原核表达载体pET-22b（+）中。利用大肠杆菌表达系统对融合蛋白进行表达。经IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE与Western-blot检测融合蛋白的表达情况。SDS-PAGE结果显示,在插入位点C端引入RD序列后,融合蛋白HBc-RD-Adpgk的可溶性表达;未引入RD序列的融合蛋白HBc-Adpgk为难溶性表达。说明RD序列可以改变HBc-Adpgk的理化性质,提高其溶解度。诱导表达后的目的蛋白利用亲和层析与超滤法对目的蛋白进行纯化。透射电镜观察结果显示,HBc-RDAdpgk蛋白可以正确组装成直径约为30nm的病毒样颗粒,说明新抗原Adpgk与RD序列插入HBcAg后未改变其自组装特性。本研究成功制备重组新抗原Adpgk的HBcAg VLP,为靶向新抗原的重组VLP癌症疫苗研究奠定基础。为了提高HBcAg重组新抗原的数量以增加疫苗的治疗靶点,本研究将新抗原Adpgk,Reps1与Dpagt1的编码基因串联插入至截短型HBcAg第78、79位氨基酸编码序列之间并在插入位点两侧辅以柔性氨基酸序列,对全长基因序列进行密码子优化后,全基因合成HBc-neoantigens并将其克隆至原核表达载体pET-22b（+）中。利用大肠杆菌表达系统对融合蛋白进行表达。对诱导表达条件进行优化并通过SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况。结果显示,目的蛋白于0.1m M IPTG37℃、30℃与16℃诱导条件下均为包涵体表达。本研究为重组多表位的VLP癌症疫苗研究奠定了基础。
郭晶晶[2]（2019）在《弓形虫病毒样颗粒疫苗的免疫原性研究》文中认为刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是一种专性细胞内寄生原虫,可感染全世界将近30%的人口。当免疫功能正常的人感染弓形虫后一般没有明显的症状,通常为隐性感染。但它可以由隐性感染状态转变成急性弓形虫病导致免疫功能受损的个体（如艾滋病患者）出现严重症状。另一个弓形虫的致命威胁是对胎儿的垂直传播,这可能导致自然流产、新生儿畸形等严重后果。由于没有合适的药物可以杀死包囊内的缓殖子,而磺胺嘧啶等西药也只能对急性感染后14天的虫体起作用,所以目前还没有办法控制这种疾病的传播。因此,先发制人的疫苗具有比现有的抗虫药物极为明显的优势。迄今为止,传统弓形虫疫苗的开发策略主要集中在亚单位疫苗和DNA疫苗上。但这两者都有一些问题,比如亚单位疫苗稳定性差并且可能引起不必要的免疫反应,而DNA疫苗具有整合到宿主细胞基因组中的理论风险。基于肽的疫苗可以克服这些弱点。他们使用最小的抗原表位来诱导所需的免疫反应,因此不太可能会引发过敏或自身免疫反应。因此,近年来基于肽的疫苗引起了越来越多人的关注。由于刚地弓形虫是一种生活史非常复杂的胞内寄生虫,因此合成含有多个不同表位的多抗原肽疫苗（Multiple antigenic peptide,MAP）可能是开发弓形虫疫苗一个有效的手段。理想的抵抗弓形虫的疫苗首先应该包括可以引发宿主Th1型免疫反应的抗原表位,该免疫反应的特征在于可以产生干扰素IFN-y,并对被感染的宿主细胞产生持久稳定的细胞毒性作用。小鼠CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CD8+cytotoxic T lymphocyte,CTL）介导的对脑内弓形虫包囊的抵抗作用,取决于其主要组织相容性复合体MHC Ⅰ类分子的Ld等位基因。弓形虫的分泌蛋白质如致密颗粒（Dense granules,GRAs）和棒状体蛋白（Rhoptry proteins,ROPs）是被小鼠 CD8+T淋巴细胞所识别的抗原蛋白,同时也是抗虫疫苗重要的候选抗原蛋白。来源于GRA6 的肽（HPGSVNEFDF）（HF10）,和来源于 ROP7 的肽（IPAAAGRFF）,是小鼠的保护性免疫显性Ld限制性表位。抗体在宿主对弓形虫的免疫中也起着重要作用,它们能直接阻断速殖子并损害其与宿主细胞的附着。SAG1是在速殖子的侵袭过程中最早与宿主细胞黏附的表面抗原蛋白,其免疫原性非常强,是B细胞表位最合适的抗原蛋白来源。SAG182-103是一个具有高度免疫原性的构象B细胞表位,但由于之前缺乏合适的载体来维持其原有的空间构象,因此一直以来未被视为疫苗候选分子。SAG1301-320是一个线性B细胞表位,可以保护小鼠免受弓形虫致命的攻击感染,而且能被弓形虫病患者的血清强烈识别出来。此外,CD4+T细胞也是感染弓形虫后机体免疫应答的重要组成部分。研究发现AS15是一个Ab限制性的CD4+T细胞表位,可以激发机体产生针对弓形虫特异性的免疫反应。弓形虫根据其毒力的差异可主要分为三个克隆谱系。Ⅰ型、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅱ型虫株通常与人类疾病有关,Ⅲ型虫株似乎在动物身上更为常见。上述这几个表位中的大多数在Ⅰ型和Ⅱ型虫株之间是高度保守的。弓形虫的生活史非常复杂,因此我们选择了 B细胞表位（SAG1 82-102或SAG1 301-320）,CD8+T 细胞表位（HF10 或 ROP7）和 CD4+T 细胞表位（AS15）作为弓形虫多抗原肽疫苗的候选表位肽。虽然MAP疫苗具有诸多优势,但是也并非没有缺点。例如,肽段本身的免疫原性不是很强,需要递送系统或佐剂的帮助。而且它们跟天然折叠的蛋白质相比,非常容易受到酶促降解的影响,缺乏稳定性。因此,为上述多抗原肽疫苗寻找合适高效的载体变的尤为重要。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）是由病毒的结构蛋白形成的多种纳米颗粒（大小为20-100nm直径）,并且可以在体外自我组装。它们类似于病毒,但是由于缺乏病毒的遗传物质,不能在机体内复制,因而没有传染性。VLPs模拟了天然病毒的三维构象,可在其表面递呈高密度重复的外源抗原表位,从而诱导机体产生所需的体液和细胞免疫反应。近年来,VLPs已是生产传染病疫苗载体的绝佳选择,已经有多种VLPs疫苗投入市场使用。然而,目前对弓形虫的VLPs疫苗的研究还非常少,需要更多的努力来填补这一具有广阔发展前景的研究领域的空白。乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原（HBc）作为VLPs平台已被广泛应用多年。它可在许多重组基因表达系统中高度表达,包括原核表达系统,并且易于在体外自我组装。HBc颗粒的表面具有位于“刺突”顶端的主要免疫显性区域（Major immune dominant region,MIR）,作为载体这种结构不仅能保持外源B细胞构象表位正确的空间构象,而且可以通过高度重复、适当间隔的方式呈现外源的构象和线性表位,能够极大地改善其颗粒表面上递呈的外源抗原表位的免疫原性。多种来自细菌、病毒和原生动物的外源抗原已被插入到HBc颗粒中构建了 HBc-抗原融合蛋白,其中的一些已达到临床试验阶段。鉴于此,将弓形虫多抗原肽加载到HBc颗粒上构建的嵌合VLPs疫苗,有望发展成一种经济高效的抗虫疫苗。研究目的1、将构象B细胞表位,Ld限制性CD8+T细胞表位和Ab限制性CD4+T细胞表位加载到HBc病毒样颗粒上,以探索这种新型弓形虫疫苗制剂方案的可行性。2、通过急性和慢性弓形虫小鼠感染模型全方面地评估此嵌合HBc病毒样颗粒疫苗产生的抵抗弓形虫感染的免疫保护力。研究方法1、构建、纯化及鉴定嵌合HBc病毒样颗粒本研究将弓形虫CD8+T细胞表位（HF10或ROP7）和B细胞表位（SAG182-102或SAG1301-320）的基因序列插入到截断HBc颗粒HBcΔ 78和79位氨基酸的基因序列之间,两端加上谷氨酰胺（Q）和天冬氨酸Asp（D）的连接子,再将CD4+T细胞表位（AS15）加在HBcΔ的C端末尾,这些复合基因与原核表达质粒pET-30a（+）连接后,构建了嵌合HBc病毒样颗粒的重组质粒:pET-30a（+）/HBcΔ,HBcAH82,HBcAH301,HBcAR82和HBcΔR301。重组质粒经过扩增和鉴定后,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,IPTG诱导表达后,收集嵌合的HBc病毒样颗粒蛋白（HBcΔ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcΔR82和HBcΔR301）。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定目的蛋白,并分析是可溶性蛋白还是包涵体沉淀。诱导嵌合HBc病毒样颗粒大量表达后,对以可溶性状态存在的HBcΔ蛋白直接通过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化,透析浓缩后收集目的蛋白;而对以包涵体沉淀状态存在的嵌合蛋白HBcΔH82,HBcAH301,HBcAR82和HBcΔR301,则先要通过含有尿素的裂解液溶解包涵体沉淀,通过镍柱纯化后,再进行梯度透析复性,从而得到正确折叠组装的嵌合HBc病毒样颗粒。嵌合HBc病毒样颗粒都含有His-Tag标签蛋白,可以与His单克隆抗体结合,并通过蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）鉴定出来。最后通过透射电镜观察分析嵌合HBc病毒样颗粒是否形成二十面体的病毒结构。2、评估嵌合HBc病毒样颗粒疫苗的免疫原性使用凝胶法鲎试剂检测嵌合蛋白中内毒素的含量。合成含有CD8+T细胞表位（HF10 或 ROP7）,B 细胞表位（SAG182-102 或 SAG1301-320）和 CD4+T 细胞表位（AS15）的四个复合抗原表位肽,即H82,H301,R82和R301。将BALB/c实验小鼠随机分成10组,每组23只小鼠,分别在小鼠皮下多点注射50μg重组蛋白（HBcΔ,H82,HBcΔH82,H301,HBcΔH301,R82,HBcΔR82,R301,HBcΔR301）或者50μl的PBS缓冲液。疫苗接种每隔两周加强一次,一共进行3次接种。在首次免疫后0,2,4和6周分别采集免疫小鼠的血清,通过ELISA检测其血清中IgG抗体水平,利用第一次免疫后6周收集的血清测定小鼠IgG1和IgG2a水平。同时每组取3只小鼠制备脾细胞悬液,通过流式细胞术检测其脾细胞中CD4+和CD8+T淋巴细胞分别占的比例,另外将脾细胞经过重组蛋白或ConA刺激后,收集细胞的培养上清液,用ELISA试剂盒检测其细胞因子IL-2和IL-4（培养24h）,IL-10（培养 72h）,IFN-γ（培养 96h）的浓度。在末次免疫后2周,将每组10只小鼠腹腔注射200个弓形虫RH株速殖子攻击感染,每日密切观察实验小鼠的状态,准确记录各组小鼠的死亡日期,并绘制相应的生存曲线。每组另外的10只小鼠以灌胃的方式口饲感染30个PRU株包囊,每天观察小鼠的状态,45日后,取出它们的脑组织制备脑匀浆,光学显微镜下观察并估算出每只小鼠脑内的包囊数。结果1、嵌合HBc病毒样颗粒构建成功通过重组质粒（pET-30a（+）/HBcΔ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcΔR82 和 HBcΔR301）的双酶切和琼脂糖凝胶电泳实验的鉴定,发现复合的嵌合HBc病毒样颗粒的基因片段已经正确地插入到原核表达质粒pET-30a（+）中,表明重组质粒构建成功。无论是可溶性蛋白HBcΔ,还是包涵体蛋白HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82和HBcΔR301,都通过Ni-NTA琼脂糖凝胶获得了较高纯度的嵌合HBc病毒样颗粒蛋白。通过Western Blot和透射电镜分析,表明携带His标签的弓形虫嵌合HBc VLPs在原核表达系统中表达成功,并且可以在体外组装成完好的病毒样颗粒,嵌合的HBc病毒样颗粒蛋白（HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82和HBcΔR301）形成了类似于原始非嵌合HBc病毒样颗粒（HBcΔ）的二十面体形态,保证了弓形虫的B细胞表位维持了其正确的空间构象,并且密集均匀地在颗粒表面呈现了虫体来源的所有抗原表位,这为接下来其诱导小鼠产生弓形虫特异性的体液和细胞免疫应答打牢物质基础。2、嵌合HBc病毒样颗粒疫苗具有很强的免疫保护性早在第二次免疫接种后,用HBcΔH82和HBcΔR82蛋白免疫的小鼠就可以检测到明显升高的IgG抗体水平（p<0.01）;在第三次接种后,这两种蛋白质更是诱导了最高的IgG抗体水平（p<0.001）。与对照组相比,只有用HBcΔH82蛋白免疫的小鼠同时具有较高的IgG1和IgG2a抗体滴度（p<0.05）。此外几乎所有的免疫组小鼠的血清中IgG1/IgG2a的比值都小于1,以上结果说明嵌合HBc病毒样颗粒疫苗在实验小鼠体内诱导了以Th1型为主的特异性免疫应答。用含有弓形虫CD4+T细胞表位（AS15）的重组蛋白（H82,HBcΔH82,H301,HBcAH301,R82,HBcΔR82,R301和HBcAR301）免疫的小鼠脾细胞中CD4+T细胞的数量较对照组都有明显的增高（P<0.05）,尤其是当其加载到HBc病毒样颗粒上之后（p<0.01）。除了接种PBS和HBcΔ的小鼠,其它重组蛋白免疫的小鼠体内CD8+T细胞的含量都有不同程度的增加,特别是对于用含有HF10表位的嵌合HBc病毒样颗粒（HBcAH82和HBcΔH301）免疫的小鼠（p<0.001）。用重组蛋白 HBcΔH82 和 HBcAH301（p<0.001）,HBcΔR82 HBcΔR301（p<0.01）以及复合抗原表位肽（H82,H301,R82和R301）（p<0.05）免疫的小鼠脾细胞培养上清液中IFN-y的水平均明显高于对照组。用HBcΔH82（p<0.001）和HBcΔH301（p<0.01）疫苗接种的小鼠具有更高的IL-2水平。而对于IL-4和IL-10,仅在用HBcΔH82蛋白免疫的小鼠中观察到了轻微升高的细胞因子浓度。用嵌合 HBc 病毒样颗粒 HBcΔH82（15.6±3.8 天）（χ2=20.13,p<0.001）,HBcΔH301（8.1±1.5 天）（χ2=14.09,p<0.01）,HBcΔR82（8.8±1.3 天）（χ2=17.83,p<0.001）和HBcΔR301（6.6±1.2天）（χ2=4.32,p<0.05）接种的小鼠的生存时间较对照组小鼠均有一定程度的延长,尤其是HBcAH82蛋白,甚至观察到最长20天的存活时间。用 HBcAH82（1454±239;p<0.01）和 HBcAH301（173 0±230;p<0.05）蛋白接种的小鼠具有比对照组小鼠（2091±263）显着减少的脑内包囊数量,包囊的减少率分别为30.5%和17.3%。结论1、嵌合 HBc 病毒样颗粒（HBcδ,HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82 和 HBcδR301）可以在大肠杆菌中成功表达出与非嵌合得HBc病毒样颗粒（HBcΔ）相似的二十面体的病毒结构,正确且密集地在病毒颗粒表面呈现弓形虫的构象B细胞表位和线性T细胞表位。2、嵌合 HBc 病毒样颗粒（HBcδ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcδR82 和 HBcΔR301）疫苗具有很强的免疫原性。特别是用HBcΔH82蛋白免疫接种的小鼠体内产生了强烈的虫体特异性的体液和细胞免疫应答,起到了抵抗急性和慢性弓形虫病的作用,是一种全新有效的抵抗弓形虫感染的疫苗制剂方案。创新性和意义创新性:本研究首次构建了含有弓形虫SAG1构象B细胞表位的疫苗,并且首次将含有构象B表位,Ld限制性CD8+T细胞表位和Ab限制性CD4+T细胞表位的多抗原肽疫苗加载到乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒上,证明了弓形虫的这种新型疫苗制剂是可以构建成功的。意义:本研究提供了一种全新有效的对抗弓形虫感染的疫苗制剂方案,可以对研发安全、有效、经济、保护力强的弓形虫疫苗提供重要参考,为弓形虫病的防治奠定理论和实验基础。
汤杰[3]（2019）在《PD-1纳米抗体的人源化及其在大肠杆菌中的表达研究》文中指出目的:程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）是一种位于T细胞表面的抑制性受体蛋白,和其配体PD-L1共同调节机体免疫反应。肿瘤细胞通过在细胞表面上调PD-L1蛋白表达,与T细胞表面的PD-1蛋白结合后,激活T细胞的PD-1/PD-L1信号通路,抑制机体的免疫系统,从而逃避免疫杀伤。因此,开发以PD-1为靶点的免疫抑制剂一直是抗体药物研发的热点。本实验室在之前的工作中筛选出一株高亲和力的骆驼源PD-1纳米抗体,该课题拟对其进行人源化改造降低免疫原性,为开发一种新的治疗性抗体药物奠定基础。方法与结果:1.本课题采用IMGT区分抗体骨架区和互补决定区规则,手动划分骆驼源PD-1纳米抗体C6以及人源化模板,分别设计了Hu1C6和Hu2C6两条人源化序列。基于分子模拟结果,本课题在Hu2C6基础上回复突变第36位至第50位氨基酸,得到hAC6序列;继续回复突变第5、11、88以及125位氨基酸,得到第四条人源化序列hBC6。2.采用多种质粒和宿主菌的组合在大肠杆菌中表达上述四种人源化纳米抗体重组蛋白:序列Hu1C6未获得表达;其他三条序列使用质粒pET-28a在大肠杆菌中获得表达,但表达产物为包涵体。采用降低诱导温度的方法试图提高蛋白的可溶性表达,效果不显着。在动物细胞表达系统中表达人源化抗体的尝试也未得到很好的效果。3.因此我们采用融合表达的方式,将驼源的纳米抗体C6分别与蛋白标签SUMO、GST、MBP连接起来,在大肠杆菌中进行融合表达,结果显示MBP蛋白促溶效果最强,SUMO蛋白次之,GST蛋白促溶效果最弱。4.进一步将人源化纳米抗体hBC6与SUMO和MBP蛋白标签融合表达,同时构建了hBC6与SUMO和MBP双标签连接的融合表达载体,MBP-hBC6融合蛋白以及MBP-SUMO-hBC6融合蛋白在E.coli中均可以大量表达可溶性蛋白,通过优化酶与底物作用的酶切时间和酶切比例,进行融合蛋白的酶切获得目的抗体。5.通过Elisa法鉴定了3株人源化纳米抗体Hu2C6、hAC6和hBC6的亲和力,证明了抗体可以与抗原PD-1结合,其中hBC6与抗原PD-1结合的能力最强。而MBP-SUMO-hBC6酶切后获得的目的蛋白MS-Cut-hBC6与抗原结合的亲和力高于非融合表达获得的hBC6。EC50和亲和力常数分别为0.997 mg/L和7.52×106L/mol。6.采用重组构建稳定表达PD-1的293T细胞和活化的Jurkat细胞检测纳米抗体与细胞上PD-1的结合情况,实验证明了这两株纳米抗体均可以结合细胞上的PD-1蛋白;激活Jurkat细胞与稳定表达PD-L1的Raji细胞共孵育实验中,加入PD-1纳米抗体后发现细胞上清中分泌的IL-2和TNF-α增加,且骆驼源和人源化纳米抗体之间没有统计学差异（p>0.05）,说明PD-1纳米抗体可以阻断激活Jurkat细胞与Raji-PDL1细胞结合;同时发现骆驼源纳米抗体C6和人源化纳米抗体hBC6对激活Jurkat细胞促进增殖的作用,人源化纳米抗体hBC6的促增殖作用比驼源抗体更强。结论:本课题对骆驼源PD-1纳米抗体C6进行了人源化改造,并通过在大肠杆菌表达系统中重组表达获得相应的人源化纳米抗体。Elisa法和细胞学实验证明人源化纳米抗体hBC6可以与PD-1蛋白结合,并可以阻断Jurkat细胞PD-1蛋白与PD-L1蛋白结合,从而上调细胞上清中IL-2和TNF-α的表达量。但与骆驼源纳米抗体C6相比,人源化纳米抗体hBC6亲和力低,需要进一步对其进行氨基酸序列优化。
杜娟[4]（2018）在《APOBEC3A-HBc融合蛋白的克隆表达及其抗病毒作用研究》文中提出背景:人载脂蛋白B m RNA编辑酶催化多肽3A（Apolipoprotein B m RNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3A,APOBEC3A,或A3A）,是细胞固有免疫的抗病毒功能因子之一,可使单链DNA或RNA的胞嘧啶残基脱氨基转化为尿嘧啶,重新编码病毒基因,能够抑制多种病毒的复制,如抑制乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）、人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）等病毒的复制。研究发现α干扰素（interferonα,IFN-α）可以上调肝细胞A3A表达,引发HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,ccc DNA）的胞嘧啶残基脱氨基转变为尿嘧啶残基,进而启动剪辑切除修复（base-excision repair,BER）机制,导致ccc DNA降解。该发现为治愈HBV带来希望。然而A3A脱氨基功能存在特异性问题,不仅对病毒等外源性DNA发挥脱氨基作用,也可对细胞基因组产生编辑作用,引起宿主细胞DNA损伤和基因组突变,影响其抗病毒效应和安全性。而乙肝病毒核心蛋白（hepatitis B virus core,HBc）具有特异结合HBV ccc DNA和HBV m RNA的特性。为进一步提高A3A抑制HBV复制的效应,本课题拟构建A3A-HBc融合蛋白,以期增强A3A靶向结合HBV ccc DNA和RNA的能力,从而增强其抗病毒效应。目的:为提高A3A抑制HBV复制的效应,构建载脂蛋白B m RNA编辑酶催化多肽3A（APOBEC3A,或A3A）与全长或截短体乙型肝炎病毒核心蛋白（HBc）的融合蛋白表达载体,研究融合蛋白在细胞内的表达和定位,并鉴定其胞嘧啶脱氨酶活性;最后初步研究其抗病毒作用。方法:（1）采用In-Fusion重组克隆方法,将含有A3A的PCR产物分别和含有全长HBc或四种C端截短体（HBc144S、HBc144E、HBc144AAA、HBc144A）的PCR扩增片段连接克隆入真核表达载体pc DNA3.0,分别构建真核表达载体pc A3A-HBc、pc A3A-HBc144S、pc A3A-HBc144E、pc A3A-HBc144AAA、pc A3A-HBc144A。将五种重组质粒分别转染常用的外源基因高表达细胞株HEK293T,通过Western blot鉴定五种融合蛋白的表达,免疫荧光细胞化学染色分析五种融合蛋白在HEK293T细胞中的定位分布,体外尿素变性PAGE法分析融合蛋白对单链DNA的胞苷脱氨酶活性。（2）通过共转染的方法在肝癌细胞Huh7中分别共转染HBV复制表达质粒p CH-3091与pc A3A质粒或五种融合蛋白的重组质粒,免疫荧光细胞化学染色法分析五种融合蛋白在细胞中的表达定位;CCK8法和流式细胞技术检测五种融合蛋白对Huh7细胞毒性和细胞周期的影响;采用ELISA法检测培养细胞上清中HBs Ag和HBe Ag的水平;实时定量PCR法检测细胞裂解液中HBV DNA的水平。结果:（1）DNA测序证实五种重组质粒构建成功;五种重组质粒都能在HEK293T细胞中表达融合蛋白,4种含截短体HBc的融合蛋白表达能力比含全长HBc融合蛋白的表达能力强;含全长HBc的融合蛋白A3A-HBc主要定位于细胞质,而含截短体HBc的融合蛋白（A3A-HBc144S、A3A-HBc144E、A3A-HBc144AAA、A3A-HBc144A）均主要定位于细胞核;含截短体HBc的融合蛋白与A3A对照的胞嘧啶脱氨基活性无显着差异,且均高于含全长HBc融合蛋的胞嘧啶脱氨基活性。（2）在抗病毒实验的Huh7细胞模型中,含全长HBc的融合蛋白主要定位于细胞质;四种含截短体HBc的融合蛋白主要位于细胞核。五种融合蛋白对Huh7细胞毒性和周期影响不显着。（3）在抗病毒实验模型Huh7细胞中,3天时,与空载体pc DNA3.0对照组相比,A3A-HBc144S、A3A-HBc144E、A3A-HBc144AAA、A3A-HBc144A各组细胞上清中的HBs Ag水平分别为（31.44±1.90%、11.42±2.74%、18.36±6.06%、43.76±0.66%,p<0.05）;各组细胞上清中HBe Ag的水平分别为59.51±2.61%（p<0.05）、32.95±2.47%（p<0.05）、45.86±2.61%,（p<0.05）和84.18±11.03%（p>0.05）;各组细胞裂解液中HBV DNA的水平分别为75.65±2.68%、46.80±3.39%、58.04±9.21%、54.10±6.65%,p<0.05),其中融合蛋白A3A-HBc144E和A3A-HBc144AAA组HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA降低最显着。7天时,上述各组细胞上清中的HBs Ag水平分别为（56.85±9.79%、12.15±2.12%、21.32±7.24%、56.50±2.93%,p<0.05）;各组细胞上清中HBe Ag的水平分别为（64.91±12.14%、38.13±4.75%、42.28±0.06%,58.71±0.92%,p<0.05）;各组细胞裂解液中HBV DNA的水平分别为80.61±3.65%（p<0.05）、87.07±9.13%（p>0.05）、54.52±6.21%（p<0.05）、52.60±3.21%（p<0.05）。7天时,A3A-HBc144E和A3A-HBc144AAA组HBs Ag、HBe Ag水平降低最显着,但是A3A-144E组HBV DNA水平降低不显着。结论:（1）成功构建A3A与全长或截短体HBc的融合蛋白真核表达载体并在HEK293T细胞和Huh7细胞中表达。（2）含截短体HBc的融合蛋白与A3A的胞嘧啶脱氨基活性相当,而含全长HBc融合蛋白的胞嘧啶脱氨基活性低于A3A的胞嘧啶脱氨基活性。（3）含全长HBc融合蛋白主要定位于细胞质;四种截短体HBc融合蛋白主要位于细胞核。（4）体外实验显示含截短体HBc的融合蛋白均具有潜在抑制HBV复制和表达的作用。其中两种融合蛋白（A3A-HBc144E和A3A-HBc144AAA）潜在的抑制作用较强,该研究为后续进一步研究抗病毒作用奠定实验基础。
霍春玲[5]（2017）在《肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究》文中指出手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）是一种严重危害婴幼儿健康的重要传染病,主要由肠道病毒感染引起。流行病学研究证实,引起婴幼儿手足口的肠道病毒主要包括肠道病毒71（enterovirus 71,EV71）和柯萨奇病毒A16（coxsackievirus A16,CA16）两种亚型。两种亚型毒株同时感染可能诱发严重的并发症甚至死亡。EV71和CA16共存在或共感染时可导致重组毒株出现,引起爆发流行,是严重的公共卫生问题之一。因此,研制抗EV71和CA16疫苗对于有效防控HFMD疫情的暴发流行至关重要。近年来,病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）疫苗因其展示抗原和安全性高等优点成为新型疫苗的发展方向之一,人乳头瘤病毒和乙肝病毒等的病毒样颗粒疫苗已成功上市。嵌合多抗原表位的VLPs疫苗研发正在取得积极进展。本论文基于乙型肝炎病毒核心（HBc）的自组装能力,制备了以HBc为载体蛋白展示了 EV71和CA16的多个保守抗原表位的嵌合病毒样颗粒（VLPs）。以小鼠为模型,对VLPs的免疫原性、抗EV71或CA16感染的保护进行评价;基于EV71 P1和3CD在杆状病毒表达系统中共表达可自主切割包装成病毒样颗粒,设计了一种新型重组嵌合肠病毒VLPs,分别将CA16的单个或多个主要抗原表位替换EV71对应区域,研究了EV71和CA16抗原表位的嵌合表达及对VLPs自组装特性的影响,后续将评价嵌合VLPs诱导的抗EV71和CA16感染的免疫保护。主要研究结果包括:1.以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白（tHBc）为载体蛋白,将EV71的保守抗原表位SP70和CA16 VP1蛋白保守中和表位PEP91融合片段插入HBc肽段的Asn75与Ser81残基之间,获得了融合片段tHBc/SP;然后将EV71编码VP2蛋白的CD4+ T细胞优势抗原表位A3融合在tHBc/SP的C端,获得了融合片段tHBc/SPA;以未插入外源基因的tHBc作为对照,将tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc三种基因片段分别克隆到大肠杆菌表达载体pET28中,构建重组表达质粒ptHBc/SP、ptHBc/SPA和ptHBc。转化大肠杆菌,筛选用于病毒样颗粒疫苗生产的工程菌株;经优化条件,高效表达了融合蛋白tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc。通过分离变性包涵体、亲和层析纯化融合蛋白和体外复性等实验,制备了高纯度的VLPs。2.以BALB/c小鼠为动物模型,对两种嵌合病毒样颗粒tHBc/SPA和tHBc/SP诱导的免疫应答和抗病毒感染免疫效力进行评估。结果显示,tHBc/SPA和tHBc/SP两种VLPs免疫小鼠均可诱导针对EV71和CA16的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。与灭活EV71相比,嵌合VLPs诱导Th1细胞因子显着升高,Th2细胞因子降低。用嵌合VLPs免疫母鼠诱导针对子代新生小鼠抗EV71致死感染的完全免疫保护效应和抗CA16致死感染的部分保护。共表达CD4+ T细胞表位没能提高嵌合VLPs在小鼠中的抗病毒效力。3.对杆状病毒表达系统进行优化改造,将巨细胞病毒（CMV）的启动子替换转移质粒pFBDM中的p10启动子驱动3CD基因、降低3CD的表达,减少p10控制3CD表达时与pH启动子驱动的P1表达存在的竞争以提高VLPs产量,获得重组转移质粒pFBDM P1-C3CD。将CA16 SP70单独替换EV71对应片段,构建重组转移pFBDM P1/SP70-C3CD;通过将CA16-SP70、VP2136-150、VP3176-190和VP448-62 同时替换EV71 相应片段,构建重组转移质粒pFBDM P1/4M-C3CD。转化宿主大肠杆菌DH1OMultiBac使四种重组转移质粒发生转座,提取同源重组产生的杆状病毒基因组Bacmid,分别转染昆虫细胞Sf9拯救重组杆状病毒 BacP1-C3CD、BacP1/SP70-C3CD 和 BacP1/4M-C3CD。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组嵌合目的均高效表达;利用昆虫细胞大量培养和重组病毒接种,表达目的蛋白,经过超速离心、凝胶过滤层析和超滤纯化浓缩,制备了高纯度组分。经电镜观察三种重组杆状病毒感染Sf9细胞均生产VLPs。后续将进行嵌合VLPs疫苗的抗EV71和CA16致死感染的免疫效力评价。我们的研究成果为研制抗EV71和CA16感染的VLPs的新型疫苗奠定了重要基础。
刘亚妮[6]（2016）在《用于制备HCV抗原抗体一体化检测试剂盒相关试剂的研究》文中进行了进一步梳理在全球范围内丙型病毒性肝炎是可致死的十大感染性疾病之一,在我国也是一种常见的传染病。丙型病毒性肝炎由丙型肝炎病毒引发,简称为丙肝,主要传播途径是经体液及血液传播。HCV感染人群中慢性丙型肝炎约占70%～85%,其中60%～70%的慢性感染患者将发展为慢性肝病,包括肝硬化、肝癌等,在肝硬化患者中,每年有1%～4%发展为肝癌。HCV感染会引发肝硬化的产生,同时也是诱发肝癌的最重要原因。丙肝危害极大的另一主要原因是由于目前尚无切实有效的可用于预防丙型肝炎病毒感染的疫苗。在发展中国家,因为诊断技术不成熟以及治疗方法存在缺陷而导致的HCV感染者死亡率在逐渐升高。由于HCV疫苗的研发在短期内很难获得突破性的进展,所以,控制该疫情的发展只能从切断传染源和阻遏传播途径上入手。而HCV感染初期具有极强的感染性,因此对HCV感染者进行及早而准确的诊断是控制丙型肝炎传播的最为有效的手段。因而建立一种具有高灵敏度、特异性和稳定性的针对HCV的筛查方法具有重要的意义。目前常用的HCV检测方法主要包括:①血清中HCV抗体检测;②血清中HCV核心抗原检测;③血液中HCVRNA检测。这三种检测方法在确诊HCV感染、选择患者治疗方案以及评价治疗效果等方面相辅相成,起到了关键性的作用。但由于目前使用的抗HCV检测试剂盒中抗原均为人工合成的具免疫原性的基因工程抗原配比合成肽抗原,其在特异性方面存在不足,可能会出现假阳性结果。此外,由于“窗口期”的存在,在HCV感染初期,感染者体内尚无抗体的产生,因此,在HCV感染早期诊断还需要其他检测策略来弥补其不足。丙肝病毒核心蛋白由氨基酸序列非常保守的大约190个氨基酸编码而成。病人血液中HCV核心抗原的出现是反映HCV感染的重要标志,因此目前可应用于HCV感染“窗口期”的筛查,HCV抗原的检测可将HCV感染的窗口期缩减50天左右。HCV核心抗原检测中较常用的方法是双抗体夹心法。双抗体夹心法可检测血清样品中总的核心抗原或游离的核心抗原,在明显缩短窗口期的同时,不会受到被检样品中所含有的抗-HCV抗体的影响,检测结果可靠,具有方法简单、用时短、对环境要求低、假阳性率低等特点。在暴露于HCV环境中7～21天内,即可在患者外周血中检测到HCV RNA的存在,其含量在血清阳转之前可达到一个峰值,滴度在1×105至1×108拷贝/mL之间。为了实现HCV感染的早期检测,降低感染率,许多国家采用了灵敏度较高的核酸检测法,但技术该技术对设备、试剂及操作方法等要求均较高,而且检测过程易交叉污染,因此很难在发展中国家推行开来。综上所述,联合检测抗HCV抗体及HCV核心抗原将成为检测HCV感染的有效手段之一。本课题利用检测抗原及抗体相结合的方法,可同时检出样本中HCV抗原和抗体,提高了阳性检出率,并可有效缩短HCV检测窗口期,有利于HCV感染早期诊断。通过比较前三代抗-HCV诊断试剂盒中抗原的组份,我们选择了 core及NS3-5重组型抗原检测病人血液中的抗体,同时应用HCV核心抗原保守区两端小肽分别制备HCV抗核心单克隆抗体,利用双抗体夹心法原理检测病人血液中的抗原。本课题的具体研究内容如下:（1）ELISA试剂盒中用于检测抗体的丙肝病毒抗原的表达与纯化:通过PCR获得HCV core-NS3-5基因片段,将其克隆至实验室构建保存的原核表达载体pRSET-BL,然后通过酶切鉴定及测序获得pRSET-BL/HCV core-NS3-5原核表达载体,将该质粒电转化至E.coliBL21（DE3）菌株,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白6His-HCV core-NS3-5融合蛋白。该融合蛋白作为ELISA试剂盒中抗原的组份。（2）携带丙型肝炎病毒核心抗原C8-160片段,核心抗原小肽C8-22及C101-115融合蛋白的原核表达载体的构建及其表达纯化:通过公司合成HCV C8-160基因片段、HCV C8-22小肽以及HCV C101-115小肽的Linker。将HCV C8-160基因克隆至实验室构建保存的PGEX-4T-3载体,获得原核表达载体PGEX-4T-3/HCVC8-160。将 HCVC8-22 小肽和 HCVC101-115 小肽分别克隆至实验室保存的pET-28a/HBc-LacZ BS载体和pRSET-B/Grn E BS载体中,获得pET-28a/HBc-HCV C8-22、pET-28a/HBc-HCV C101-115、pRSET-B/Grn E-HCV C8-22和pRSET-B/Grn E-HCV C101-115四种可以表达不同表位小肽的融合蛋白的原核表达载体。将上述五种原核表达载体分别电转化至E.coli BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白,用于制备针对HCV核心不同抗原表位的单克隆抗体。（3）分别携带核心抗原小肽C8-22和C101-115的真核表达载体的构建:将质粒pAd5/E1-CMV-H1H2-Grn E-Flag用BamHI和SfuI分步双酶切后,分别连入HCV C8-22小肽和HCV C101-115小肽,转染HEK 293细胞72 h后收集上清和全细胞裂解液,用于单克隆抗体的Western Blot检测。（4）针对人IgGFc段的单克隆抗体的制备:用购买自Sigma的人IgG蛋白作为免疫原,第一次免疫时将免疫原和Freund完全佐剂等体积混合,研磨后对小鼠进行皮下多点注射,每只小鼠注射的免疫原总量为40 μg;3周后进行第二次免疫,将免疫原与Freund不完全佐剂等体积混合,每只注射剂量和注射方法均同第一次;2周后进行第三次免疫,此次不加佐剂,采用腹腔注射,注射剂量同前两次。2周后,进行断尾取血,用ELISA检测小鼠血清抗体效价,选择抗体效价达到1:64000以上的2只小鼠,于1周后用该蛋白进行腹腔加强免疫。加强免疫后第2天,将饲养细胞接种于96孔板中,第3天将免疫小鼠的脾细胞按照10:1或5:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞通过PEG4000进行融合,以HAT/HT选择培养液筛选杂交瘤细胞,融合7天至10天后,采用ELISA法筛选阳性孔,经过3～4次的亚克隆,阳性率达到100%时,即得到分泌小鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞,随后将杂交瘤细胞转移到24孔板中进行扩大培养并冻存。选择8周龄的BALB/c小鼠制备腹水。收集腹水后获得所需的小鼠抗人IgG单克隆抗体。（5）针对HCV核心不同抗原表位的单克隆抗体的制备:为了制备针对HCV C8-22单克隆抗体的制备,将上述获得的GST-6His-HCV C8-160融合蛋白作为初次免疫原,HBc-HCV C8-22融合蛋白作为加强免疫原,Grn E-HCV C8-22融合蛋白用于杂交瘤的筛选检测,筛选获得阳性杂交瘤细胞,扩大培养及制备腹水后由Western Blot和免疫荧光染色进行鉴定,制备得到针对HCV C8-22的单克隆抗体。针对HCV C101-115单克隆抗体的制备,同上述实验策略,初次免疫原同上,HBc-HCV C101-115融合蛋白作为加强免疫原,Gm E-HCV C101-115融合蛋白用.于筛选,制备获得针对HCVC101-115的单克隆抗体。（6）HCV抗原抗体联合检测体系的建立及其应用:应用针对HCV核心抗原不同抗原表位的单克隆抗体Anti-HCV C8-22和Anti-HCV C101-.115及HCV core-NS3-5重组抗原同时包被酶联板。如果是检测样本中的抗体,使用HRP标记的鼠抗人IgG单抗;如果是检测样本中的抗原,使用与固相包被物有不同抗原决定簇的辣根过氧化物酶标记的抗-HCV核心单克隆抗体,显色后进行定性或定量检测。由此可以检测样品中的HCV抗原或其抗体。通过以上研究获得以下研究成果:（1）成功构建了 pRSET-BL/HCV core-NS3-5原核表达载体,纯化获得6His-HCV core-NS3-5 融合蛋白,浓度为 1.0 mg/mL;（2）成功构建了 PGEX-4T-3/HCV C8-160原核表达载体,纯化获得GST-6His-HCV C8-160 融合蛋白,浓度为 1.0 mg/mL;（3）成功构建了 pET-28a/HBc-HCV C8-22 和 pRSET-B/Grn E-HCV C8-22 原核表达载体,纯化获得携带HCV C8-22小肽的融合蛋白HBc-HCV C8-22浓度为0.1 mg/mL,Gm E-HCV C8-22 浓度为 0.25 mg/mL;（4）成功构建了 pET-28a/HBc-HCV C101-115 和 pRSET-B/Grn E-HCV C101-115原核表达载体,纯化获得携带HCVC101-115小肽的融合蛋白HBc-HCV C101-115 浓度为 0.1 mg/mL,Grn E-HCV C101-115 浓度为 1.2 mg/mL;（5）成功构建了 pAd5/E1-CMV-H1H2-Grn E-HCV C8-22-Flag 和 pAd5/E1-CMV-H1H2-Gm E-HCV C101-115-Flag 真核表达载体;（6）通过杂交瘤技术制备获得3株针对人IgG Fc段的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,它们分别为33E5、30E1和28D11。经Western Blot鉴定,3株单克隆抗体均特异性针对人IgGFc段。均为IgG1亚类。经ProteinGPlus/ProteinA-Agarose亲和层析法纯化后浓度分别为2.28 mg/mL、1.07 mg/mL和1.61 mg/mL。（7）采用联合免疫的方法,通过杂交瘤技术制备获得3株针对HCV C101-115抗体,它们分别为39A6、43C6和73B6。经Western Blot和免疫荧光染色鉴定,3株单克隆抗体均特异性针对HCV C101-115抗原。均为IgG1亚类。经Protein G Plus/Protein A-Agarose 亲和层析法纯化后浓度分别为 3.41 mg/mL、5.15 mg/mL 和 1.09 mg/mL。上述研究成果为HCV诊断提供了特异性抗体及抗原,为进一步研究HCV的防治途径奠定了重要基础;同时也为小肽的单抗制备提供了一种更有效的免疫方案。
蒋蓉,李军强,杨鸣鸣,朱涛,宇学锋,邵忠琦[7]（2016）在《人乳头瘤病毒L2蛋白的病毒样颗粒疫苗研究》文中认为目的:构建乙肝病毒核心抗原（HBcAg）与人乳头瘤病毒（HPV）L2抗原的融合蛋白,在大肠杆菌中重组表达形成病毒样颗粒结构;通过小鼠模型检测HBc-L2融合蛋白的免疫原性,并研究免疫后获得的小鼠血清对HPV假病毒的中和效力。方法:通过DNA合成构建16型人乳头瘤病毒L2基因片段与HBcAg基因的融合基因,将其克隆至表达载体p ET9a并在大肠杆菌中进行HBc-L2融合蛋白表达;将经纯化、鉴定后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测小鼠血清中针对L2抗原的抗体效价,并分别研究小鼠血清对16型和18型HPV假病毒的中和效力。结果:HBc-L2融合基因经大肠杆菌系统表达形成可溶性蛋白,经硫酸铵沉淀和CL-4B凝胶分离纯化后获得纯度>80%的HBc-L2蛋白;分子筛高效液相色谱-多角度激光光散射（SEC-MALS）联用技术和透射电子显微镜的分析结果表明,HBc-L2融合蛋白在表达过程中自动组装形成稳定的病毒样颗粒;将纯化后的HBc-L2蛋白免疫BALB/c小鼠可获得针对L2抗原的高滴度抗体,且小鼠血清具有中和16和18型两种假病毒的中和抗体活性。结论:HBc-L2病毒样颗粒可以有效地增强L2抗原的免疫原性,并可刺激机体产生针对多型HPV的免疫保护力,是一个具有潜力的新型广谱HPV疫苗。
杨星,陈皓,叶明付,代鑫,夏海滨[8]（2015）在《PEP-3与HBc融合原核表达载体的构建与表达》文中研究指明以可诱导较强免疫反应及呈现高拷贝抗原小肽的乙肝病毒核心蛋白（Hepatitis B Virus Core Protein,HBc）类病毒颗粒（Virus-like Particles,VLPs）作为免疫载体蛋白,通过分子生物学手段,将蓝白班筛选元件Lac Zα插入HBc的主要免疫显性区域,构建获得外源小肽与HBc融合的通用原核表达载体。在此通用载体的基础上,通过PEP-3小肽替换Lac Zα片段,构建了PEP-3与HBc融合原核表达载体,并成功进行了HBc/PEP-3融合蛋白的表达及纯化。该新型通用载体的成功构建,将为小肽疫苗的研究及应用提供有效工具。
朱翔,路文明,丁宁玲,叶建中,王锋,沙莉,李扬,高胜兰[9]（2015）在《截短序列和全序列HBcAg基因以及HBV C-S融合基因的克隆与表达》文中指出目的构建截短序列和全序列HBcAg基因和HBc-HBs Ag融合基因原核表达质粒,研究目的蛋白在大肠杆菌中的表达及其免疫原性。方法利用HBV全基因（adr亚型）质粒pUCm T-HBV分别扩增HBs Ag截短基因、HBcAg截短基因和HBcAg全基因,构建成重组质粒p SK-HBs、p SK-HBc和p KS-HBV C,经DNA序列测定鉴定后,分别将HBcAg截短基因、HBcAg全基因及HBc-HBs Ag融合基因亚克隆至表达质粒PET-30a,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达HBcAg截短基因、HBcAg全基因和HBc-HBs Ag融合基因产物,采用PAGE-SDS和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果成功构建了含HBcAg截短基因、HBcAg全基因和HBc-HBs Ag融合基因的原核表达质粒;成功构建的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中能大量表达HBcAg蛋白和HBc-HBs Ag融合蛋白,免疫印迹分析结果显示表达产物具有免疫原性。结论成功构建的原核表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）中能顺利表达HBcAg蛋白和HBc-HBs Ag融合蛋白,表达产物具有免疫原性,为慢性乙型肝炎特异性免疫治疗研究提供了实验基础。
曹永生[10]（2013）在《Asia1型FMDV复合表位免疫原的研制及免疫效果研究》文中认为口蹄疫（Foot-and-mouth Disease，FMD）作为一种全球范围内的重大动物疫病，已成为当前动物及其产品国际贸易的主要障碍。O、A、Asia1型FMD是我国一直以来的防治重点，灭活疫苗在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用。机体抵抗口蹄疫病毒（Foot-and-mouth Disease Virus，FMDV）感染过程中，依赖于中和抗体的体液免疫反应是最主要的。虽然灭活疫苗免疫能够产生高水平的中和抗体，但高水平的中和抗体并不是总能为机体提供完全的保护，同时CD4+T细胞在诱导机体体液抗体水平方面发挥着重要的作用，提示同时提高机体的体液免疫和细胞免疫对于FMD的预防更有意义。复合表位疫苗减少了疫苗中与免疫无关的成分，同时可对T、B细胞抗原表位进行不同组合，是实现口蹄疫体液免疫应答和细胞免疫应答的理想选择。FMDV主要是依靠接触和空气进行传播，黏膜免疫应答能够在黏膜部位产生大量的分泌性的sIgA，分泌性的sIgA不仅可以在第一时间中和病毒，而且可通过黏膜的方式进一步激活系统免疫反应，进而阻止病毒的侵入。所以有效的诱导黏膜部位产生sIgA是口蹄疫疫苗发展的新方向。本研究人工设计了复合表位肽，并分别以乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）和牛IgG2a Fc片段为载体，利用原核表达系统和毕赤酵母表达系统，制备三种复合表位免疫原pET28a-HBc-EB、pET22b-EB-BIg和rGS115-pPICZA-HBc-EB，通过腹腔注射、口服和滴鼻三种途径分别对小鼠进行免疫，从体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫水平对复合表位疫苗的免疫效果进行综合评价。（1）Asia1型FMDV复合表位免疫原的设计及合成选取VP1上第140160位、第200211位两个B细胞表位和VP1上第2040位、3A上第2135两个T细胞表位为候选表位，并在其间引入合适的linker序列，构成了Asia1型FMDV的复合表位。该复合表位肽通过linker序列GSGSG融合于HBcAg的第7879位氨基酸（刺突位置），软件分析表明，Linker序列在表位之间形成柔性区域和转角，特别是序列（G4S）3的引入保证了两个B细胞表位的独立作用，而复合表位肽所在的HBc刺突位置具有较高的抗原性且大部分存在于表位部分，并有出现在分子表面的可能性，将融合有复合表位的HBcAg序列优化后合成。（2）复合表位免疫原在原核表达系统中的制备及腹腔免疫效果评价1)复合表位免疫原在原核表达系统中的制备以合成的质粒pUC57-simple-HBc-EB为模板，PCR扩增出目的基因，产物酶切后与pET28a连接，得到重组表达质粒pET28a-HBc-EB。以合成的含有牛IgG2a Fc片段基因的pUC57-simple-BIg质粒为模板，扩增出牛IgG2a Fc片段基因，并利用融合PCR方法与复合表位基因连接，酶切后与pET22b连接，得到重组表达质粒pET22b-EB-BIg。复性后的重组pET28a-HBc-EB在电镜下可观察到病毒样粒子的存在，而重组蛋白pET22b-EB-BIg也形成了类似免疫球蛋白单体的形式，能够与兔抗牛抗体直接结合。Western blot鉴定结果表明两免疫原均具备良好的抗原性，更为重要的是Dot ELISA结果显示复性后的复合表位免疫原能够与Asia1型FMDV VP1构象表位抗体很好的结合，间接说明复合后的表位免疫原能够一定程度上折叠为类似于Asia1型VP1蛋白构象型表位的抗原结构。2)复合表位免疫原腹腔免疫效果评价免疫后28d的检测结果表明，pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组小鼠抗体水平显着高于疫苗免疫组（P＜0.01或P＜0.05），pET28a-HBc-EB组的抗体水平显着高于pET22b-EB-BIg组（P＜0.05）；pET28a-HBc-EB组液相阻断抗体效价高于疫苗免疫组，为1:2561:512；而pET22b-EB-BIg组液相阻断抗体效价为1:1281:256，与灭活疫苗组相当；pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组的淋巴细胞刺激指数显着高于灭活疫苗免疫组（P＜0.01）。pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组的CD4+/CD8+比值显着高于灭活疫苗组（P＜0.01，P＜0.05）。pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组小鼠脾细胞刺激后产生的IL-2和IFN-γ显着高于灭活疫苗组（P＜0.01），pET28a-HBc-EB组IL-4和IL-10产生水平显着高于灭活疫苗组（P＜0.05），而pET22b-EB-BIg组与灭活疫苗组无显着差异。表明Asia1型FMDV多表位免疫原具有良好的免疫效果，既可刺激机体产生高水平的体液免疫，又可以刺激机体发生细胞免疫，其中以pET28a-HBc-EB组免疫效果最佳。复合表位免疫原腹腔免疫较为理想的效果证实了复合表位免疫原的有效性，为口服免疫和滴鼻免疫提供了保证。（3）复合表位免疫原在毕赤酵母表达系统中的制备及口服免疫效果评价1)复合表位免疫原在毕赤酵母表达系统中的制备本研究鉴于毕赤酵母具备真核细胞表达系统的修饰功能的特点，以期获得具有天然结构的复合表位免疫原。酶切重组质粒pET28a-HBc-EB，获得复合表位多肽基因，与pPICZA胞内表达载体连接，获得重组质粒pPICZA-HBc-EB；以本实验保存的含有Asia1型FMDV全基因的质粒为模板，分别扩增病毒衣壳蛋白编码基因，并分别克隆于毕赤酵母表达载体pPICZA中，然后通过PCR方法在含有各表达盒两端引入酶切位点，各表达盒经酶切后依次将连入pPICZA载体中，最终构建酵母表达质粒pPICZA-vp031；Western blot和Dot ELISA鉴定结果表明表达产物具有良好的抗原性。2)重组毕赤酵母以5×108CFU剂量口服免疫小鼠，免疫后28d检测结果表明，pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组抗体水平显着低于灭活疫苗免疫组（P＜0.01）；液相阻断抗体效价为1:81:16；毕赤酵母免疫组小鼠黏膜冲洗液sIgA和特异性sIgA总量显着高于疫苗组（P＜0.01）；pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组的黏膜特异性sIgA显着高于灭活疫苗组（P＜0.01）；pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组淋巴细胞增殖指数均显着高于灭活疫苗免疫组（P＜0.01），而pPICZA-HBc-EB组显着高于pPICZA-vp031组（P＜0.05）；灭活疫苗组CD4+/CD8+比值显着高于pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组（P＜0.01）；pPICZA-HBc-EB组小鼠脾细胞刺激后产生的IL-2和IFN-γ显着高于灭活疫苗组（P＜0.01），而pPICZA-vp031组则与灭活疫苗组无显着差异（P＞0.05），pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组IL-4和IL-10水平与灭活疫苗组无显着差异（P＞0.05）。说明口服重组酵母菌不仅可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，而且还能显着地诱导机体黏膜免疫。证实了复合表位免疫原通过口服免疫激发黏膜免疫的可行性。（4）复合表位免疫原滴鼻免疫效果的评价利用原核系统制备的复合表位疫苗对小鼠进行滴鼻免疫，免疫后28d pET22b-EB-BIg组抗体水平显着高于pET28a-HBc-EB组（P＜0.01），显着低于灭活疫苗免疫组（P＜0.01），且抗体上升趋势较为缓慢；液相阻断抗体效价低于1:8；pET22b-EB-BIg滴鼻免疫组黏膜冲洗液总sIgA水平、黏膜特异性sIgA抗体水平显着高于灭活疫苗组、pET28a-HBc-EB滴鼻免疫组（P＜0.01）；pET22b-EB-BIg滴鼻免疫组的刺激指数显着高于其他各组（P＜0.05）；pET22b-EB-BIg滴鼻免疫组CD4+/CD8+比值显着低于灭活疫苗免疫组（P＜0.01）。上述结果说明pET22b-EB-BIg免疫后小鼠上支气管和肺部冲洗液、肠冲洗液和生殖道冲洗液中均有特异性sIgA的分泌，同时机体产生一定的体液免疫和细胞免疫，而pET28a-HBc-EB则无此效应，首次实践了靶向FcRn激发黏膜免疫的可行性，为FMD黏膜疫苗的制备提供一种新的思路。
二、HCVC区与HBc融合蛋白在大肠杆菌中表达及鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HCVC区与HBc融合蛋白在大肠杆菌中表达及鉴定（论文提纲范文）
（1）以乙肝病毒核心抗原为载体的结直肠癌治疗性疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 结直肠癌的研究进展 |
| 1.1.1 结直肠癌的发展现状 |
| 1.1.2 结直肠癌的治疗现状 |
| 1.2 结直肠癌治疗性疫苗研究进展 |
| 1.2.1 抗肿瘤免疫应答的生物级联效应 |
| 1.2.2 DC疫苗 |
| 1.2.3 多肽疫苗 |
| 1.2.4 Onco VAX |
| 1.2.5 溶瘤病毒 |
| 1.3 新抗原癌症疫苗研究进展 |
| 1.3.1 新抗原的概念 |
| 1.3.2 新抗原癌症疫苗发展现状 |
| 1.3.3 MC-38鼠源结肠癌模型新抗原的鉴定 |
| 1.4 病毒样颗粒作为疫苗载体的研究进展 |
| 1.4.1 病毒样颗粒疫苗的发展概况 |
| 1.4.2 HBcAg的结构特点 |
| 1.5 研究内容与意义 |
| 第2章 重组新抗原Adpgk的 HBcAg VLP的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 试剂与耗材 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.2.4 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HBc-Adpgk融合蛋白设计思路 |
| 2.3.2 pET-22b(+)-HBc-Adpgk重组载体的构建 |
| 2.3.3 HBc-(RD)-Adpgk融合蛋白的原核表达 |
| 2.3.4 目的蛋白HBc-RD-Adpgk的的镍柱纯化 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 重组原核表达载体pET-22b(+)-HBc-(RD)-Adpgk的构建 |
| 2.4.2 目的蛋白HBc-(RD)-Adpgk的诱导表达与鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 重组多种新抗原的HBcAg VLP的表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 试剂与耗材 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.2.4 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 HBc-neoantigens融合蛋白设计思路 |
| 3.3.2 pET-22b(+)-HBc-neoantigens的构建 |
| 3.3.3 HBc-neoantigens融合蛋白的原核表达 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 重组原核表达载体pET-22b(+)-HBc-neoantigens的构建 |
| 3.4.2 目的蛋白HBc-neoantigens的诱导表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）弓形虫病毒样颗粒疫苗的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 弓形虫疫苗的研究现状 |
| 1.1.1 研究弓形虫疫苗的必要性 |
| 1.1.2 弓形虫疫苗的研究现状 |
| 1.2 多抗原肽疫苗 |
| 1.2.1 疫苗的原理 |
| 1.2.2 基于肽的疫苗 |
| 1.2.3 多抗原肽疫苗的表位设计 |
| 1.3 挑选弓形虫抗原表位 |
| 1.3.1 弓形虫的生活史 |
| 1.3.2 弓形虫的形态特点 |
| 1.3.3 弓形虫的致病机制 |
| 1.3.4 弓形虫的基因型 |
| 1.3.5 宿主对弓形虫的免疫应答 |
| 1.3.6 本研究确定的弓形虫表位 |
| 1.4 HBc病毒样颗粒 |
| 1.4.1 病毒样颗粒 |
| 1.4.2 HBc病毒样颗粒 |
| 1.5 选题意义及研究内容 |
| 第二章 嵌合HBc病毒样颗粒的构建、纯化与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料与仪器 |
| 2.2.2 嵌合HBc病毒样颗粒表达质粒的构建 |
| 2.2.3 嵌合HBc病毒样颗粒的表达 |
| 2.2.4 嵌合HBc病毒样颗粒的纯化 |
| 2.2.5 嵌合HBc病毒样颗粒的Western Blot鉴定 |
| 2.2.6 嵌合HBc病毒样颗粒的透射电镜分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 嵌合HBc病毒样颗粒表达质粒的构建 |
| 2.3.2 嵌合HBc病毒样颗粒的表达 |
| 2.3.3 嵌合HBc病毒样颗粒的纯化 |
| 2.3.4 嵌合HBc病毒样颗粒的Western Blot鉴定 |
| 2.3.5 嵌合HBc病毒样颗粒的透射电镜分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 嵌合HBc病毒样颗粒的免疫保护性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 嵌合HBc病毒样颗粒蛋白接种小鼠 |
| 3.2.3 免疫小鼠的血清抗体分析 |
| 3.2.4 免疫小鼠的淋巴细胞分型分析 |
| 3.2.5 免疫小鼠的细胞因子水平分析 |
| 3.2.6 弓形虫强弱毒株攻击感染实验 |
| 3.2.7 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平 |
| 3.3.2 免疫小鼠的CD4~+CD8~+T淋巴细胞分型情况 |
| 3.3.3 免疫小鼠的细胞因子水平 |
| 3.3.4 弓形虫强弱毒株攻击感染后小鼠的生存率和脑包囊数 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及所获奖励 |
| 英文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）PD-1纳米抗体的人源化及其在大肠杆菌中的表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 PD-1 蛋白与抗PD-1 肿瘤药物 |
| 1.1.1 PD-1 蛋白 |
| 1.1.2 PD-1 抗肿瘤药物 |
| 1.2 纳米抗体介绍 |
| 1.2.1 纳米抗体的理化性质 |
| 1.2.2 纳米抗体药物的开发 |
| 1.3 抗体的人源化改造 |
| 1.3.1 药物的免疫原性 |
| 1.3.2 抗体的人源化 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 PD-1纳米抗体的人源化设计 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 FR区和CDR区的划分 |
| 2.2.2 使用CDR-Grafting法设计人源化序列 |
| 2.2.3 PD-1 人源化纳米抗体的同源建模及评估 |
| 2.2.4 利用同源建模指导PD-1 人源化纳米抗体的进一步改造 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 人源化PD-1纳米抗体的非融合重组表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 PD-1 骆驼源纳米抗体的表达纯化 |
| 3.2.2 PD-1 人源化纳米抗体的非融合表达 |
| 3.2.3 降低温度提高纳米抗体的可溶性表达 |
| 3.2.4 人源化PD-1 纳米抗体在动物细胞中的表达 |
| 3.2.5 人源化PD-1 纳米抗体的纯化 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 人源化PD-1纳米抗体的融合表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 骆驼源PD-1 纳米抗体融合蛋白构建与表达 |
| 4.2.2 人源化PD-1 纳米抗体融合蛋白的构建与表达 |
| 4.2.3 人源化PD-1 纳米抗体融合蛋白的摇瓶培养表达与纯化 |
| 4.2.4 人源化PD-1 纳米抗体融合蛋白的酶切 |
| 4.2.5 酶切后目的抗体的纯化 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 人源化PD-1纳米抗体的活性鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 人源化纳米抗体hBC6 的亲和力鉴定 |
| 5.2.2 hBC6的EC50 和亲和常数测定 |
| 5.2.3 细胞水平检测人源化PD-1 纳米抗体与PD-1 的结合 |
| 5.2.4 PD-1 纳米抗体对细胞因子表达水平的影响 |
| 5.2.5 PD-1 纳米抗体对活化Jurkat细胞生长的影响 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 不足与展望 |
| 缩写词及中英对照 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）APOBEC3A-HBc融合蛋白的克隆表达及其抗病毒作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1. HBV研究现状 |
| 2. APOBEC3研究现状 |
| 3. In-Fusion克隆技术 |
| 第一部分 APOBEC3A与HBC融合蛋白的克隆表达及活性鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系及质粒 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 全长HBc和截短体HBc与APOBEC3A融合蛋白表达载体的构建 |
| 2.1.1 HBc144截短体的筛选 |
| 2.1.2 目的基因的扩增 |
| 2.1.3 酶切及连接 |
| 2.1.4 感受态细胞的制备 |
| 2.1.5 转化 |
| 2.1.6 质粒提取 |
| 2.2 细胞培养和质粒转染 |
| 2.3 蛋白样品的制备 |
| 2.4 BCA法蛋白定量 |
| 2.5 Westernblot检测融合蛋白的表达 |
| 2.6 免疫荧光 |
| 2.7 胞嘧啶脱氨酶活性实验 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫荧光细胞化学染色筛选HBc144截短体 |
| 3.2 融合蛋白表达载体的构建及鉴定 |
| 3.2.1 融合蛋白编码序列的设计 |
| 3.2.2 目的基因PCR产物获取 |
| 3.2.3 酶切A3A质粒制备pcDNA3.0载体 |
| 3.2.4 pcDNA3.0质粒图谱 |
| 3.2.5 融合蛋白表达载体构建示意图 |
| 3.2.6 融合蛋白表达载体测序验证 |
| 3.3 融合蛋白在细胞中的表达及定位 |
| 3.3.1 Westernblot法检测融合蛋白表达 |
| 3.3.2 融合蛋白在HEK293T细胞内的定位 |
| 3.4 融合蛋白脱氨基活性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 APOBEC3A与HBC融合蛋白的抗病毒作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系及质粒 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养与质粒转染 |
| 2.2 ELISA检测细胞上清液中HBsAg、HBeAg的表达水平 |
| 2.3 细胞裂解液中HBVDNA的提取 |
| 2.4 实时定量PCR检测细胞裂解液中HBVDNA水平 |
| 2.5 CCK8检测细胞毒性作用 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.7 免疫荧光 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 融合蛋白在细胞中的表达定位 |
| 3.2 融合蛋白对细胞的毒性作用 |
| 3.3 细胞上清液中HBsAg、HBeAg的表达水平 |
| 3.4 融合蛋白对细胞裂解液中HBVDNA的抑制作用 |
| 3.5 融合蛋白对细胞周期的影响 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（5）肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 基因组结构及其编码蛋白质 |
| 1.4 肠道病毒感染与免疫 |
| 1.5 手足口病疫苗研究现状 |
| 1.5.1 减毒活疫苗 |
| 1.5.2 灭活疫苗 |
| 1.5.3 表位疫苗 |
| 1.5.4 亚单位疫苗 |
| 1.5.5 DNA疫苗 |
| 1.5.6 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.6 乙肝病毒core蛋白(HBc)与病毒样颗粒(VLPs) |
| 1.7 手足口病疫苗效力评价的相关动物模型 |
| 1.8 杆状病毒表达系统与重组疫苗的研究 |
| 1.9 本研究目的与意义 第二章 HBc为载体的EV71和CA16嵌合抗原表位病毒样颗粒的制备及其免疫原性 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 细胞、病毒、菌株、质粒、工具酶、试剂及实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子克隆方法 |
| 2.2.2 重组蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 2.2.3 细胞实验细胞的复苏、传代与冻存 |
| 2.2.4 动物实验 |
| 2.2.5 免疫检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HBc为载体的EV71和CA16嵌合抗原表位病毒样颗粒的制备 |
| 2.3.2 嵌合病毒样颗粒诱导特异性体液免疫应答 |
| 2.3.3 嵌合病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫应答 |
| 2.3.4 EV71小鼠适应株(Mouse adapted virus,MAV) EV71的制备 |
| 2.3.5 嵌合病毒样颗粒诱导抗EV71和CA16感染的主动免疫保护 |
| 2.3.6 嵌合病毒样颗粒诱导抗EV71和CA16感染的被动免疫保护 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 研究总结 第三章 基于杆状病毒表达EV71和CA16重组抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备与鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 相关仪器 |
| 3.1.2 细胞细胞、病毒、菌株、质粒、工具酶、试剂 |
| 3.1.3 培养基及溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 重组转移质粒的构建 |
| 3.2.3 重组转移质粒在DH10MultiBac中的同源重组 |
| 3.2.4 重组Bacmid的提取 |
| 3.2.5 重组Bacmid的转染和重组杆状病毒的拯救 |
| 3.2.6 重组杆状病毒的免疫荧光检测 |
| 3.2.7 重组杆状病毒基因组DNA的提取 |
| 3.2.8 重组杆状病毒的增殖 |
| 3.2.9 杆状病毒的滴度测定 |
| 3.2.10 重组嵌合蛋白蛋白表达与鉴定 |
| 3.2.11 重组嵌合蛋白纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组转移质粒pFBDM P1-C3CD、pFBDM P1/SP70-C3CD、pFBDMP1/4M-C3CD的构建与鉴定 |
| 3.3.2 杆状病毒BacP1-C3CD、BacP1/SP70-C3CD、BacP1/4M-C3CD的拯救与鉴定 |
| 3.3.3 VLPs P1-C3CD VLPs P1/SP70-C3CD、VLPs P1/4M-C3CD的表达与鉴定 |
| 3.3.4 VLPs P1-C3CD、 VLPs P1/SP70-C3CD、VLPs P1/4M-C3CD的纯化与电镜观察 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 研究总结 总结与展望 参考文献 攻博期间发表的科研成果 致谢 附录 |
（6）用于制备HCV抗原抗体一体化检测试剂盒相关试剂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 HCV的基因组结构与生物学特性 |
| 1.3 丙型肝炎的诊断方法 |
| 1.3.1 血清HCV抗体检测 |
| 1.3.2 血清HCV核心抗原检测 |
| 1.3.3 HCV RNA检测 |
| 1.3.4 其他检测方法 |
| 1.4 HCV传播途径 |
| 1.4.1 血液、血制品传播 |
| 1.4.2 经性传播 |
| 1.4.3 母婴传播 |
| 1.5 丙型肝炎病毒抗原抗体一体化检测试剂盒的国内外研究现状 |
| 1.6 丙型肝炎病毒抗原抗体一体化检测试剂盒的研究意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 1.7.1 用于检测针对丙型肝炎病毒抗体的融合蛋白抗原的表达及纯化 |
| 1.7.2 携带丙型肝炎病毒核心不同抗原表位蛋白的表达及纯化 |
| 1.7.3 针对人IgG Fc段单克隆抗体的制备 |
| 1.7.4 针对丙型肝炎病毒核心HCV C101-115抗原表位小肽单克隆抗体的制备 |
| 第2章 用于检测针对丙型肝炎病毒抗体的融合蛋白抗原的表达及纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒载体 |
| 2.1.2 材料及试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HCV core-NS3-5基因的克隆 |
| 2.2.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞 |
| 2.2.4 pGEMT/HCV core-NS3-5阳性克隆质粒的获得和鉴定 |
| 2.2.5 携带6His-HCV core-NS3-5融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 2.2.6 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.2.7 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的Western Blot检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HCV core-NS3-5基因的克隆 |
| 2.3.2 携带6His-HCV core-NS3-5融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 2.3.3 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.3.4 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的Western Blot检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 携带丙型肝炎病毒核心抗原表位HCV C8-22及HCV C101-115的融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株及质粒载体 |
| 3.1.2 材料及试剂 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HCV C8-22小肽的获得 |
| 3.2.2 HBc-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.3 HBc-HCV C8-22融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.4 Grn E-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.5 Grn E-HCV C8-22融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.6 Western Blot检测原核表达的HCV C8-22融合蛋白 |
| 3.2.7 携带HCV C8-22小肽真核表达载体的构建 |
| 3.2.8 HCV C101-115小肽的获得 |
| 3.2.9 HBc-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.10 HBc-HCV C101-115融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.11 Grn E-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.12 Gm E-HCV C101-115融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.13 Western Blot检测原核表达的HCV C101-115融合蛋白 |
| 3.2.14 携带HCV C101-115小肽真核表达载体的构建 |
| 3.2.15 HCV C8-160基因的克隆 |
| 3.2.16 GST-HCV C8-160融合蛋白原核表达载体的构建及其表达纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HBc-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.2 HBc-HCV C8-22融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.3 Gm E-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.4 Gm E-HCV C8-22融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.5 Western Blot检测原核表达的HCV C8-22融合蛋白 |
| 3.3.6 携带HCV C8-22小肽真核表达载体的构建及表达 |
| 3.3.7 HBc-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.8 HBc-HCV C101-115融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.9 Gm E-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.10 Gm E-HCV C101-115融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.11 Western Blot检测原核表达的HCV C101-115融合蛋白 |
| 3.3.12 携带HCV C101-115小肽真核表达载体的构建及表达 |
| 3.3.13 HCV C8-160基因的克隆 |
| 3.3.14 GST-HCV C8-160融合蛋白原核表达载体的构建及其表达纯化 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 针对人IgG Fc段以及丙型肝炎病毒核心抗原不同表位单克隆抗体的制备 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 材料及试剂 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 抗人IgG单克隆抗体的制备 |
| 4.2.2 抗人IgG单克隆抗体可特异性结合Fc段的鉴定 |
| 4.2.3 抗人IgG单克隆抗体的亚类测定和纯化 |
| 4.2.4 抗HCV C101-115单克隆抗体的制备 |
| 4.2.5 抗HCV C101-115单克隆抗体的鉴定 |
| 4.2.6 抗HCV C101-115单克隆抗体的亚类测定和纯化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 制备抗人IgG单克隆抗体免疫鼠血清效价测定 |
| 4.3.2 抗人IgG单克隆抗体可特异性结合Fc段的鉴定 |
| 4.3.3 抗人IgG单克隆抗体的亚类测定和纯化 |
| 4.3.4 制备抗HCV C101-115单克隆抗体免疫鼠血清效价测定 |
| 4.3.5 抗HCV C101-115单克隆抗体特异性的鉴定 |
| 4.3.6 抗HCV C101-115单克隆抗体亚类测定和纯化 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间获奖情况 |
（7）人乳头瘤病毒L2蛋白的病毒样颗粒疫苗研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1. 1 材料 |
| 1.1.1假病毒、细胞、菌株与动物 |
| 1.1.2试剂和仪器 |
| 1. 2 方法 |
| 1.2.1表达载体的构建 |
| 1.2.2重组融合蛋白的表达与纯化 |
| 1.2.3病毒样颗粒大小和形态的分析鉴定 |
| 1.2.4小鼠免疫与血清样本制备 |
| 1.2.5间接ELISA检测抗体效价 |
| 1.2.6 HPV中和抗体检测 |
| 1.3统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1表达质粒的构建 |
| 2.2 HBc-L2重组蛋白的表达 |
| 2.3蛋白纯化与病毒样颗粒的鉴定 |
| 2.4血清抗体效价 |
| 2.5 HPV中和抗体 |
| 3 讨论 |
（9）截短序列和全序列HBcAg基因以及HBV C-S融合基因的克隆与表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（10）Asia1型FMDV复合表位免疫原的研制及免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 口蹄疫概述 |
| 1.1.1 病原特性 |
| 1.1.2 口蹄疫病毒主要抗原位点 |
| 1.1.3 传播途径 |
| 1.1.4 流行现状 |
| 1.2 黏膜免疫研究进展 |
| 1.2.1 黏膜免疫系统 |
| 1.2.2 黏膜免疫佐剂 |
| 1.2.3 靶向性黏膜免疫投递载体 |
| 1.3 口蹄疫新型基因工程疫苗研究现状 |
| 1.3.1 亚单位疫苗 |
| 1.3.2 合成肽疫苗 |
| 1.3.3 新型减毒疫苗和分子标记疫苗 |
| 1.3.4 核酸疫苗 |
| 1.3.5 转基因植物可饲疫苗 |
| 1.3.6 活载体疫苗 |
| 1.3.7 表位疫苗 |
| 1.3.8 黏膜疫苗 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 灭活疫苗、包被抗原和抗体 |
| 2.1.4 引物设计及合成 |
| 2.1.5 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 主要溶液的配制 |
| 2.2 试验一 Asia1 型 FMDV 复合表位免疫原的制备 |
| 2.2.1 以 HBcAg 为载体复合表位免疫原的原核表达 |
| 2.2.2 以牛 IgG2a Fc 片段为载体的复合表位免疫原的制备 |
| 2.2.3 Asia1 型 FMDV 衣壳蛋白在酵母中的共表达 |
| 2.2.4 以 HBcAg 为载体复合表位免疫原在酵母中的表达 |
| 2.3 试验二复合表位免疫原免疫途径与免疫效果的研究 |
| 2.3.1 腹腔免疫及免疫效果评价 |
| 2.3.2 口服免疫及免疫效果评价 |
| 2.3.3 滴鼻免疫及免疫效果评价 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 试验一 Asia1 型 FMDV 复合表位免疫原的制备 |
| 3.1.1 复合表位免疫原的设计 |
| 3.1.2 复合表位免疫原的原核表达 |
| 3.1.3 阳性重组酵母菌的获得 |
| 3.2 试验二复合表位免疫原免疫途径与免疫效果的评价 |
| 3.2.1 腹腔免疫及免疫效果评价 |
| 3.2.2 口服免疫及免疫效果评价 |
| 3.2.3 滴鼻免疫及免疫效果评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Asia1 型 FMDV 复合表位免疫原的设计 |
| 4.2 复合表位免疫原的制备 |
| 4.2.1 复合表位免疫原在原核表达系统中的制备 |
| 4.2.2 复合表位免疫原在毕赤酵母表达系统中的制备 |
| 4.2.3 Asia1 型 FMDV 衣壳蛋白在酵母中的共表达 |
| 4.3 复合表位免疫原免疫途径与免疫效果的评价 |
| 4.3.1 复合表位免疫原腹腔免疫效果评价 |
| 4.3.2 黏膜免疫在 FMDV 防控中的意义 |
| 4.3.3 以 HBcAg 为载体复合表位免疫原口服免疫效果评价 |
| 4.3.4 复合表位免疫原滴鼻免疫效果的评价 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
四、HCVC区与HBc融合蛋白在大肠杆菌中表达及鉴定（论文参考文献）
- [1]以乙肝病毒核心抗原为载体的结直肠癌治疗性疫苗研究[D]. 赵振伯. 北京工业大学, 2020(06)
- [2]弓形虫病毒样颗粒疫苗的免疫原性研究[D]. 郭晶晶. 山东大学, 2019(02)
- [3]PD-1纳米抗体的人源化及其在大肠杆菌中的表达研究[D]. 汤杰. 暨南大学, 2019(02)
- [4]APOBEC3A-HBc融合蛋白的克隆表达及其抗病毒作用研究[D]. 杜娟. 中国人民解放军空军军医大学, 2018(05)
- [5]肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究[D]. 霍春玲. 武汉大学, 2017(02)
- [6]用于制备HCV抗原抗体一体化检测试剂盒相关试剂的研究[D]. 刘亚妮. 陕西师范大学, 2016(04)
- [7]人乳头瘤病毒L2蛋白的病毒样颗粒疫苗研究[J]. 蒋蓉,李军强,杨鸣鸣,朱涛,宇学锋,邵忠琦. 中国免疫学杂志, 2016(03)
- [8]PEP-3与HBc融合原核表达载体的构建与表达[J]. 杨星,陈皓,叶明付,代鑫,夏海滨. 陕西师范大学学报(自然科学版), 2015(03)
- [9]截短序列和全序列HBcAg基因以及HBV C-S融合基因的克隆与表达[J]. 朱翔,路文明,丁宁玲,叶建中,王锋,沙莉,李扬,高胜兰. 实用肝脏病杂志, 2015(01)
- [10]Asia1型FMDV复合表位免疫原的研制及免疫效果研究[D]. 曹永生. 东北农业大学, 2013(08)