GM-CSF、IL-3、GM-CSG/IL-3融合蛋白对辐照诱导人髓系白血病细胞Tf-1凋亡的影响

GM-CSF、IL-3、GM-CSG/IL-3融合蛋白对辐照诱导人髓系白血病细胞Tf-1凋亡的影响

一、Effects of GM-CSF, IL-3, and GM-CSG/IL-3 fusion protein on apoptosis of human myeloid leukemic cell line Tf-1 induced by irradiation(论文文献综述)

吕萃[1](2020)在《多能干细胞分化再生T细胞的体内抗肿瘤评估及再生可移植髓系细胞研究》文中进行了进一步梳理从多能干细胞诱导分化出可移植、有功能的血液及免疫细胞一直是再生医学领域的研究热点和难点。本文第一部分证明小鼠胚胎干细胞分化来源、体内成熟的T细胞可以结合CAR-T技术改造实现体内清除肿瘤的目的,第二部分初步实现诱导小鼠胚胎干细胞获得可移植的髓系祖细胞种子,移植后可在体内短期再生髓系细胞(包括粒细胞、单核-巨噬细胞)。本研究为再生T细胞以及可移植髓系细胞的转化研究提供了技术借鉴。嵌合抗原受体 T 细胞(Chimeric Antigen Receptor T cells,CAR-T)疗法已成为临床上治疗血液肿瘤的有效手段。通常CAR-T细胞是通过分离患者外周血来源的T细胞在体外进行基因编辑而制备,但是患者自身的T细胞数量有限且经常出现功能异常或耗竭,因此需要探索T细胞新的来源。本研究基于课题组已开发的定向诱导T细胞技术,利用Runx1-Hoxa9条件性表达的多能干细胞系诱导分化出可植入免疫缺陷鼠(B-NDG)的造血祖细胞(induced hematopoietic progenitorcells,iHPCs),移植B-NDG小鼠5周后,从脾脏中分离出再生的T细胞(induced T cells,iT),通过将iT细胞感染CD19-CAR逆转录病毒制备CD19-CAR iT细胞。为了验证CD19-CAR iT细胞在体内针对B淋巴瘤细胞的杀伤功能,本研究首先通过移植表达荧光素酶(luciferase)的B淋巴瘤细胞(Ka539-luciferase)构建了基于C57BL/6的肿瘤负荷鼠模型,随后分别将CD19-CAR iT细胞和Ctrl-CARiT细胞(阴性对照)过继移植到肿瘤模型中,流式检测发现CD19-CAR iT细胞可以持久抑制外周血中CD19+B细胞的产生,这表明了其具有针对特异抗原的直接杀伤能力。同时小鼠活体成像实验证实CD19-CAR iT细胞可以有效缓解肿瘤模型鼠的肿瘤负荷,并且相比于对照组,经过CD19-CAR iT细胞治疗的肿瘤鼠能够显着延长生存时间(>70天)。其次,CD19-CAR iT细胞在体内接受到CD19抗原刺激后能够快速增殖,并且可被大量激活(CD44+CD62L-),从侧面印证了 CD19-CARiT细胞功能的有效性。以上结果说明CD19-CAR iT细胞可以有效清除B淋巴瘤细胞,也验证了由多能干细胞诱导再生的iT细胞可以用于制备CAR-T细胞,这为T细胞疗法的新细胞来源提供了技术参考。与此同时,髓系细胞,特别是粒细胞和单核-巨噬细胞,是天然免疫系统重要成员,在吞噬、杀菌和抗病原体感染中发挥关键作用。因此,再生有功能的髓系细胞对移植和化疗后的抗感染治疗具有重要的临床意义。本研究发现,Runx1-Hoxa10二因子条件性诱导表达的mES细胞系(iR10 mESCs细胞系)可诱导分化获得可移植的造血细胞种子,移植后体内再生出髓系细胞,包括粒细胞和单核-巨噬细胞。具体而言,首先通过形成拟胚体(Embryoid bodies,EBs)的方式模拟胚胎发育早期阶段,随后通过诱导Runx1和Hoxa10的表达和添加特定造血细胞因子进行培养获得诱导型生血内皮细胞(iHECs,CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201hi)。生成的iHECs再和OP9-DL1基质细胞共培养获得诱导型造血祖细胞(induced hematopoietic progenitor cells,iHPCs),这些 iHPCs 植入半致死辐照后的Rag1-/-小鼠后成功再生髓系细胞(CD11b+)。PCR测序结果证明体内再生的髓系细胞确实插入了目的基因Runx1和Hoxa10。此外,在骨髓和脾脏组织中均检测到再生的髓系细胞,包括粒细胞(CD11b+Gr1+)、单核细胞(CD11b+Gr1-F4/80-)和巨噬细胞(CD11b+F4/80+)。最后,iHPCs在移植入半致死辐照后的野生型受体鼠后也成功再生髓系细胞。结合再生髓系细胞的功能实验结果,本研究将为再生人髓系细胞提供技术参考,也有望为临床上抗感染细胞疗法等提供新的细胞来源。

张灵莉[2](2019)在《巴桑母酥油丸对小鼠MC3T3-E1细胞增殖、成骨分化及造血调节因子分泌的影响》文中认为目的:探讨巴桑母酥油丸对小鼠成骨细胞株MC3T3-E1细胞增殖、成骨、造血调节功能的影响及作用机制,探究巴桑母酥油丸“强筋骨”功效与促进“虚损不足”机体造血功能恢复作用的具体靶点,为传统藏医基本“滋补”理论与方药的临床运用提供生物学依据。方法:小鼠灌胃巴桑母酥油丸制备含药血清(巴血清)并加入小鼠MC3T3-E1细胞培养体系,采用CCK-8法检测成骨细胞的增殖情况;采用碱性磷酸酶(ALP)染色及茜素红S染色法观察成骨细胞的ALP活性及钙化情况;采用实时荧光定量PCR检测成骨细胞成骨相关信号通路中β-catenin、Runx2、Osx的mRNA表达量;采用蛋白质印迹法(WB)和ELISA酶联免疫吸附法检测成骨细胞基质细胞衍生因子1(SDF-1)、造血调节因子GM-CSF和LIF的表达量,并与不加小鼠血清的空白组和灌胃生理盐水(NS)的血清组比较。结果:1.与空白组比较,培养24h时,含巴血清组5、10%浓度的OD值极显着升高(P<0.01);48h、72h时,含NS血清组1、5%浓度及含巴血清组各浓度的OD值均有极显着升高(P<0.01),且72h时NS血清组10%浓度OD值也有显着升高(P<0.05)。与相同浓度NS血清组比较,24h时,巴血清组5、10、20%浓度及48h、72h时10、20%浓度OD值均有极显着升高(P<0.01)。含巴血清组10%与20%浓度比较,72h时,含巴血清组10%浓度OD值极显着高于20%浓度(P<0.01)。2.10%巴血清组细胞培养不同时间点后ALP活性及钙化结节数均极显着高于10%NS血清组(P<0.01)。3.10%巴血清组细胞培养48h后Runx2 mRNA表达量低于10%NS血清组,β-catenin mRNA和Osx mRNA表达量虽高于10%NS血清组,但无统计学意义。4.10%巴血清组细胞培养48h后上清液中LIF、SDF-1含量均极显着高于10%NS血清组(P<0.01),GM-CSF含量虽高于10%NS血清组,但无统计学意义。结论:1.巴桑母酥油丸含药血清可促进成骨细胞的增殖、成骨分化和矿化,因而可能具有促进受损的造血细胞成骨龛(hematopoietic cell osteoblastic niche)恢复,进而促进造血功能恢复的作用。2.巴桑母酥油丸含药血清可通过促进成骨细胞分泌黏附分子SDF-1,促进造血干细胞粘附于成骨龛,从而维持其干细胞特性(不对称分裂,自我更新,分裂分化同时进行)。3.巴桑母酥油丸含药血清可通过促进成骨细胞分泌LIF等造血调节因子调节并维持正常造血功能活动。4.成骨细胞是巴桑母酥油丸“强筋骨”功效与“虚损不足”主治作用的链接位点。

刘静[3](2017)在《西达本胺对急性髓系白血病(AML)作用机制及临床应用的初步研究》文中研究表明目的:t(8;21)急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是一类异质性很大的血液系统恶性肿瘤,尽管标准化疗方案疗效较好,但仍有20~40%的患者不能达到完全缓解(complete remission, CR), 60%左右的患者最终复发[1],年轻患者5年生存率仅为40~45%,而老年患者小于10%[2],因此针对这类白血病的靶向治疗研究非常重要。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone Deacetylases Inhibitors, HDACi)是一类具有广泛抗肿瘤活性的小分子化合物,文献报道HDACi可抑制t(8;21)AML细胞增殖,诱导其凋亡、促进分化和阻滞周期[3],已进入白血病治疗的临床试验阶段[4]。西达本胺(Chidamide,CS055,爱谱沙(?)/Epidaza(?))是我国自主研发的选择性HDACi,本研究旨在观察西达本胺对t(8;21)AML细胞的作用,并初步探讨其作用机制。方法:本研究采用CCK-8、流式细胞技术检测西达本胺对AML1/ETO阳性及阴性AML细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。收集AML患者骨髓样本,用西达本胺处理原代AML细胞,观察其对细胞增殖的影响。筛选最佳西达本胺处理条件,并保证其浓度符合人体血药浓度范围,进行基因表达芯片筛查,通过蛋白免疫印迹实验对芯片结果进行验证,并观察西达本胺对AML1/ETO融合蛋白、C-KIT蛋白表达的影响。用MEK1/2特异性抑制剂U0126处理AML 1 /ETO阳性AML细胞,观察细胞增殖及对AML1 /ETO融合蛋白、C-KIT蛋白表达的影响。西达本胺处理AML1-ETO阳性AML细胞后,q-PCR检测其对AML1/ETO、C-KIT mRNA转录水平的影响。结果:1、西达本胺可有效抑制AML细胞增殖,且抑制作用呈浓度和时间依赖性。西达本胺通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期,对AML1/ETO阳性的AML细胞抑制率最高达70%以上,明显高于AML1/ETO阴性AML细胞。西达本胺可抑制原代AML细胞增殖,且抑制作用具有时间和剂量依赖性。2、利用基因表达芯片进行基因功能筛查。通过分子功能聚类分析发现,0.25μM西达本胺处理AML1/ETO阳性Kasumi-1细胞48h,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路相关基因发生了重要变化,MAPK家族的重要成员之一细胞外信号调节激酶1/2 (extracellμlar signal-regμlated kinase,ERK1/2)的主要分子功能是调控细胞增殖和凋亡等。ERK1/2通路参与细胞凋亡的基因有16个,提示西达本胺诱导AML1/ETO阳性细胞凋亡的主要分子通路可能是抑制ERK1/2 通路。3、蛋白免疫印迹实验结果显示,西达本胺作用于AML细胞后,下调ERK1/2通路的重要成员ERK1/2蛋白的磷酸化水平,且相对于AML1/ETO阴性AML细胞,西达本胺对AML1/ETO阳性AML细胞的作用更为明显,持续时间更长。在上调乙酰化组蛋白H3同时,下调AML1/ETO阳性细胞中AML1/ETO融合蛋白、C-KIT蛋白表达水平。4、西达本胺处理AML1-ETO阳性AML细胞后,与对照组相比,药物处理组AML1-ETO融合基因、C-KIT mRNA转录水平变化无明显统计学意义。5、U0126处理AML1/ETO阳性AML细胞后,可抑制其增殖,同时下调AML1/ETO、C-KIT的蛋白的表达水平,但对AML1/ETO、C-KITmRNA转录水平的影响不明显。结论:西达本胺可通过抑制ERK1/2信号通路中ERK1/2的磷酸化,进而通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期,抑制t(8;21)AML细胞增殖,同时降低AML1/ETO和C-KIT蛋白表达,为西达本胺在临床精准靶向治疗t(8;21)AML提供新的思路及理论依据。背景:随着联合化疗及造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)方案的不断完善,AML的疗效明显提高,但仍有20~40%的患者不能达到完全缓解(CR),约50~70%获得CR的患者最终复发[1]。这类疾病的治疗成为白血病临床科研领域亟待解决的难题和热点。目的:对于难治/复发AML的治疗,NCCN指南推荐临床试验,《急性髓系白血病(复发难治性)中国诊疗指南2017年版》推荐的FLAG、CAG、HAA等方案在临床上取得一定的疗效,但对于危险分层预后不良、反复复发的患者尚需探索更有效的治疗方案。基于前期体内外实验室研究结果,我们组合了西达本胺联合DCAG(DCCAG)方案。本研究旨在分析难治/复发AML的临床特点,以及DCCAG方案对该类白血病患者治疗的有效性和安全性。方法:按WHO诊断、临床研究入组和排除标准筛选患者,入组患者予DCCAG方案治疗2周期。第1周期后疗效达到PR、CR的患者继续第2周期,疗效NR的患者由研究者判定是否进入第2周期治疗。治疗结束后4周完善相关检查评价近期疗效,疗效分为:CR、部分缓解(partial remission, PR)、未缓解(non-remission, NR); CR和PR患者数之和占患者总数的百分比为总反应率(overall response rate, OR )。同时观察患者的不良反应,血液学和非血液学不良反应均参照WHO药物不良反应分级。结果:1、入组情况:筛选入组43例患者,其中20例反复复发2次以上,1例造血干细胞移植后复发。按2016年NCCN危险度分层标准,预后不良13例(30.2%),预后中等16例(37.2%),预后良好5例(11.6%)。其中甲基化相关基因DNMT3A7例(18.4%)、IDH2 2例(5.2%)、TET2 2例(5.2%)。与不良预后相关的基因突变比例较高,FLT-ITD 11例(28.9%),RUNX1 7例(18.4%), GATA2 6 例(15.8%),TP53 2例(5.2%), ASXL1例(2.6%)。因病情需要28例(65.1%)接受过其它难治/复发AML方案治疗,11例(25.6%)接受过8周期以上化疗。2、疗效评价:退出4例,39例完成了疗效评价。近期总疗效:CR率41.0%(16/39),OR59.0% (23/39)。AML1/ETO 阳性 AML 的 CR 率 75.0% (1/4),预后良好组CR率100%。既往接受过其它难治/复发方案治疗的患者中,CR率36.0%(9/28), OR 52.0% (13/25);未接受过其它难治/复发方案治疗的患者CR率50.0%(7/14),OR71.4% (10/14)。既往使用过CAG方案的5例患者,CR4例;使用过DCAG的6例患者中,CR2例、PR1例;使用过FLAG方案的9例,CR4例。4、不良反应:以血液学毒性为主,60.5%的患者发生了与治疗相关的粒细胞减少,粒细胞缺乏(<0.5×109/L)持续时间16.5 (2-31) d。51.2%的患者发生了与治疗相关的血小板减少,血小板减少(<20×109/L)持续时间17 (2-48) d。共有5例患者死亡,2例死于疾病进展,1例死于败血症,1例死于肺部感染、呼吸衰竭,中位OS 45.5 (36-65) d。结论:本研究中,DCCAG方案治疗39例难治/复发AML患者,CR率41.0%,获得近60%的总有效率。在反复多次复发、耐药、有不良预后因素、既往接受过其它高效难治/复发AML方案治疗的患者中,OR 50%以上。主要不良反应为骨髓抑制和感染。初步研究结果表明,DCCAG方案对于临床上治疗难度非常大、预后很差的难治AML患者具有一定的疗效,为这类患者进行HSCT等进一步治疗争取了机会。这类患者骨髓造血功能差,免疫功能低下,粒细胞缺乏时间延长,感染的风险明显增大,需注意加强感染的预防及治疗。

张哲峰[4](2014)在《不同发育阶段人胸腺的组成分析及其在人源化小鼠模型构建中的应用》文中提出背景:过去的几十年中,生命科学和生物医学研究飞速发展并取得了一系列的重要的成就,令人鼓舞。然而,针对严重影响人类健康的疾病,如艾滋病、恶性肿瘤、糖尿病的治疗领域却鲜有突破性进展。主要原因之一是:由于种属间的差异,利用传统动物模型,如小鼠、大鼠等,得出的实验结论往往无法反应人体中的实际情况。为此,建立更能模拟人体情况,且使用较简便的动物模型显得非常重要,而人源化小鼠模型的发展和进步就是最具代表模型之一。人源化小鼠模型是指移植有人的细胞、组织,或表达人基因的小鼠模型,在本论文中特指具有人造血免疫系统的人源化小鼠。人源化小鼠的发展已经有20多年的历史,其中由当时在哈佛大学医学院工作的杨永广(Yong-Guang Yang)教授在2006年提出的通过共移植人胚胎胸腺组织块(肾被膜下移植)和人胚胎肝脏CD34+造血干细胞(尾静脉注射)建立的人源化小鼠模型被公认为是人免疫系统功能最为健全、研究人类免疫系统相关疾病最理想的模型之一。并且,该模型在艾滋病、肿瘤、移植排斥等领域已经有广泛的应用。但是,该模型的缺点是建立模型所需的人胚胎组织获取较为困难,影响了该模型的进一步推广、应用。因此我们考虑,结合本人在胸心外科的临床工作中的优势,利用相关手术(如小儿先天性心脏病)需要切除的胸腺组织,比较不同发育阶段和病理情况下的人胸腺组织的组成,并探索利用该胸腺建立不依赖人胚胎组织使用的人源化小鼠的方案,以期建立更加简便且易于推广的新型具有人免疫系统的人源化小鼠模型。实验目的:比较不同发育阶段和病理情况的人胸腺的细胞组成情况,尝试利用这些胸腺替代人胚胎胸腺组织,结合人脐带血造血干细胞移植,建立不依赖于人胚胎组织使用的新型人源化小鼠模型。并通过分析该新型人源化小鼠中人的免疫系统组成,探索其在人类免疫系统疾病研究中的应用价值,以及进一步优化人源化小鼠模型的方法。实验方法:依赖人胚胎组织使用的人源化小鼠模型的构建:通过将大小约1mm3的人胚胎胸腺移植到亚致死剂量(2Gy)全身照射的NOD-SCID小鼠的肾被膜下,并且将同一胚胎肝脏来源的CD34+造血干细胞通过静脉注射入小鼠体内,建立具有人造血免疫系统的人源化小鼠模型。不同发育阶段、不同病理情况下人胸腺的免疫学组成分析:利用多色流式分析的方法检测人免疫细胞在不同时期、不同淋巴组织的发育、组成的情况,并使用组织病理学的方法,如H/E染色等,检测人源化小鼠的淋巴器官组织结构;利用流式分析的方法技术比较幼儿胸腺、胸腺瘤、胸腺增生和胸腺炎性假瘤内人免疫细胞的发育的情况,同时使用H/E染色和免疫组化的方法用来诊断炎性假瘤。探索不依赖于人胚胎组织使用的人源化小鼠模型的构建:在经过2Gy亚致死剂量全身照射的NOD/SCID小鼠中,移植人胸腺(如幼儿胸腺)和人异体来源的CD34+造血干细胞(如脐血或胎肝来源),并利用免疫抑制剂环孢素A(CsA,CyclosporineA)克服可能产生的异基因免疫排斥。实验结果:第一部分:本研究通过在经过亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠上,移植人胚胎胸腺组织(肾被膜下移植),以及相同来源的人胎肝造血干细胞(尾静脉注射),建立了具有高水平人免疫系统组成的人源化小鼠的模型。具体的说,在移植后3周的小鼠体内有约110%的人淋巴造血细胞重建。此后随该小鼠的免疫系统人源化水平逐渐增加,到移植后12周人淋巴造血细胞可以占小鼠外周血单个核细胞(PBMC,Peripheral blood mononuclear cell)约70%。其中CD3+的T细胞和CD19+的B细胞占很大的比例,也能够在小鼠体内检测到人CD14+单核细胞。在移植后12周处死小鼠时发现在小鼠的免疫器官脾脏和骨髓都能检测到人的嵌合体细胞。第二部分:分析和比较幼儿胸腺与胸腺增生或胸腺瘤组织及炎性假瘤组织中的人免细胞组成。检测结果显示,人幼儿胸腺的人胸腺细胞组成与人胚胎胸腺的情况相近。然而,人AB型胸腺瘤与人胚胎胸腺的组成却明显不同。另外,用HE染色和免疫组化方法还发现临床较少见的炎性假瘤的病例。因此可以尝试用幼儿胸腺替代人胚胎胸腺建立人源化小鼠的模型。第三部分:利用幼儿胸腺结合异体来源的人造血干细胞移植,在NOD-SCID小鼠中建立不依赖人胚胎组织的人源化小鼠。结果显示,由于幼儿胸腺和造血干细胞来源的不同产生的排斥作用,一些小鼠中初见了人CD19+B细胞消失的现象。所以,当我们给予免疫抑制剂CsA抑制这种排斥后,在一些人源化小鼠体内既可以检测到人的T细胞,也可检测到造血干细胞来源的CD19+B细胞,证明该方法可能克服了免疫排斥。在下一步的研究中我们将尝试新的方法来清除幼儿胸腺内残留的T细胞从而抑制幼儿胸腺对造血干细胞的排斥,从而支持T细胞发育,增加移植的成功率。结论:首先,利用人胚胎组织,我们成功的建立了具有高水平人淋巴造血细胞组成的人源化小鼠的模型。其次,我们分析比较了不同发育阶段和不同病理条件下人胸腺的免疫系统组成和组织学结构差异,发现胸腺疾病组织内免疫细胞的发育可能与胸腺疾病常伴随自身免疫疾病相关,为选取合适的组织建立新型人源化小鼠模型奠定基础。最后,我们通过幼儿胸腺肾被膜移植、异基因人造血干细胞微静脉注射,结合免疫抑制剂环孢素A的使用,初步建立了一种新型的不依赖人胚胎组织使用的人源化小鼠模型。

郭德军[5](2012)在《靶向肿瘤重组毒素IL6T23-PE38KDEL的表达、纯化及其生物活性的研究》文中指出肿瘤疾病已成为人类的第一杀手,对于恶性肿瘤目前还缺少较为理想的药物,利用细胞因子及其受体介导杀伤癌细胞是癌症靶向治疗的一个策略。根据IL-6R在一些肿瘤细胞表面过表达,而正常细胞表面数量极少表达或不表达的事实,我们利用基因工程原理和分子生物学技术,将截短的IL6的基因与绿脓杆菌外毒素变体PE38KDEL的基因相偶联,构建了重组毒素IL6T23-PE38KDEL的原核表达载体和酵母表达载体,并分别在大肠杆菌和毕赤酵母中实现了重组毒素的活性表达;同时初步建立了该重组毒素的纯化工艺,其体外和体内抗肿瘤生物学活性表明,重组毒素IL6T23-PE38KDEL在体内和体外具有明显的靶向抗肿瘤活性,为其进一步开发提供技术和理论支持。重组毒素IL6T23-PE38KDEL的构建与表达。利用PCR技术,将N端截去23个氨基酸的IL6基因与改造的绿脓杆菌外毒素PE38KDEL基因相连接,成功构建了重组毒素IL6T23-PE38KDEL的基因。然后将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a和pET-22b上,构建了大肠杆菌表达质粒28a-IL6T23-PE38KDEL和22b-IL6T23-PE38KDEL,重组毒素IL6T23-PE38KDEL在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,可溶性表达的重组毒素IL6T23-PE38KDEL具有选择性细胞毒;28a-IL6T23-PE38KDEL表达量高于22b-IL6T23-PE38KDEL,28℃表达时可溶性重组毒素占可溶蛋白总量的12.9%。28a-IL6T23-PE38KDEL在改良ZYM-5052培养基中可实现高密度自诱导表达,菌体密度与IPTG诱导的LB培养基相比,可提高4倍,目的蛋白占菌体上清蛋白总量的11.7%,这为利用醇溶性单抗纯化该重组蛋白奠定了基础。成功构建了巨大芽胞杆菌pHis-IL6T23-PE38KDEL重组质粒,但重组巨大芽胞杆菌在培养基中分泌表达的重组毒素IL6T23-PE38KDEL无细胞活性。利用密码子优化的IL6T23-PE38KDEL基因,成功构建了甲醇酵母pPICZ-IL6T23-PE38KDEL重组质粒,并在毕赤酵母GS115中获得分泌性表达,表达产物具有选择性细胞活性,但表达量较低。重组毒素的纯化。利用包涵体复性技术和层析技术,建立了利用大肠杆菌制备重组毒素IL6T23-PE38KDEL的纯化工艺。大肠杆菌表达的重组毒素的包涵体,经洗涤、复性、Q Bio-sep HP和MonoQ层析和多粘菌素B除内毒素等步骤,制备了高纯度、具有细胞活性的重组毒素IL6T23-PE38KDEL,为体外和体内抗肿瘤试验奠定了基础。重组毒素的体外抗肿瘤活性。初步建立了重组毒素IL6T23-PE38KDEL体外抗肿瘤谱;IL6T23-PE38KDEL可特异性杀伤骨髓瘤细胞、髓系白血病细胞、肝癌细胞,而对其他供试细胞无效,并使用MTT法测定了敏感细胞的半致死剂量;重组毒素的半致死剂量在同系细胞间表现为明显的IL6R数量依赖关系,非同系细胞间无受体数量依赖关系。IL6T23-PE38KDEL与IL6R受体的结合时间在1530min之间。IL6可竞争阻断IL6T23-PE38KDEL的细胞毒性,当IL6浓度达到IL6T23-PE38KDEL二倍以上时,其阻断效果明显增加。重组毒素的体内抗肿瘤活性。在小鼠腹腔瘤模型的静脉给药治疗试验中,重组毒素IL6T23-PE38KDEL在体内表现出明显的抗肿瘤效应,能明显延长荷瘤鼠的生存期;高剂量组与对照组相比延长荷瘤鼠的生存期6.6d,肿瘤完全消退率为30%,治疗效果在组间表现出明显的剂量依赖关系。在小鼠腹腔瘤模型的腹腔给药治疗试验中,介入给药表现为强烈的抗肿瘤效果,肿瘤完全消退率为70%,有效率为100%,肿瘤转移抑制率100%。重组毒素IL6T23-PE38KDEL在体内具有明显的抗肿瘤效应,毒副作用低,对其他实质性脏器未见明显损伤,仅表现为转氨酶轻度升高和红细胞数略微下降,可能成为一个潜在的抗肿瘤候选药物。

方芳[6](2012)在《转录因子E2F1调节树突状细胞成熟的分子机制》文中进行了进一步梳理近来的研究发现,转录因子E2F1除参与细胞周期调控,通过p53依赖和p53非依赖的两种方式参与细胞凋亡外,在造血系统细胞的发育分化上还起到重要调节作用。E2F1基因敲除鼠中淋巴细胞显着增生,但耐受下降并导致淋巴瘤。树突状细胞(DC)活化会诱导淋巴细胞增生,在E2F1基因敲除鼠中是否E2F1影响到DC的功能,从而引起淋巴细胞的异常?为此,本研究集中的研究了E2F1在树突状细胞中的调控作用和机制。首先我们发现,在LPS诱导的人外周血单核细胞来源树突状细胞和鼠源树突状细胞系DC2.4成熟过程中,E2F1的基因转录和蛋白表达都表现出瞬时下降。利用所建立的DC2.4敲低或高表达E2F1细胞为模型分析和发现,敲低E2F1可导致DC2.4表型和功能都趋于成熟。相反,高表达E2F1能显着抑制LPS诱导的DC2.4的成熟。通过E2F1基因敲除鼠骨髓来源的DC表型的检测,验证了上述的研究结果,提示了E2F1对DC成熟起到反馈调节作用。为了进一步揭示E2F1调控树突状细胞成熟的分子机制,利用所建立的DC2.4基因修饰细胞模型分析发现:敲低E2F1导致包括Erk1/2, NF-κB和PI3K/Akt等涉及树突状细胞成熟的主要信号通路活性明显增高。对E2F1可能参与的转录调节的部分基因分析发现,E2F1可影响信号通路中重要的接头蛋白Gab2的表达。对Gab2启动子的分析和实验研究发现,E2F1可能通过与Spl相互作用,从而对Gab2转录调节,并进一步影响了DC多个细胞信号通路的活性。虽然Gab2参与多个细胞信号通路的活化,但Gab2的上调并未能完全模拟E2F1敲低所导致信号通路活性的所有变化,提示Gab2可能仅仅是众多E2F1下游调控基因中的一个,而E2F1诱导DC成熟可能是多个因子共同作用的综合结果。本研究进一步扩展了转录因子E2F1的功能,首次阐明了其在DC成熟过程中的反馈调控作用及部分分子机制。研究结果显示,在DC成熟过程中E2F1的表达经历了先下调后恢复的动态变化过程,因此推测E2F1的反馈调节作用主要是在DC细胞成熟后期,避免DC过度活化,起到了很好的平衡机体内细胞稳态的作用。虽然已有研究报道在肿瘤细胞中E2F1对Gab2的表达调控,但本研究中发现在DC中E2F1对Gab2转录调控利用了不同的机制。本研究提示,Gab2可能在免疫细胞中发育和分化的新功能。树突状细胞的成熟和活化在免疫应答中起到关键的作用,它功能的异常会直接关系到机体对病原体的抵抗和自身的保护。本研究成果为后续深入研究树突状细胞成熟的分子调控网络及对治疗用DC疫苗的研究打下了必要的基础。

张秀丽[7](2011)在《靶向白血病干细胞的抗CD3/IL3及其二硫键稳定构型的融合蛋白的构建、表达及活性研究》文中认为背景与目的白血病的发生、治疗中耐药乃至白血病复发的根本原因在于患者体内存在着一群白血病干细胞(LSC)。它跟正常的干细胞一样具有自我更新和分化潜能。它在全血细胞中仅占0.25-1.0%。传统的白血病治疗通常是细胞毒药物的联合化疗配合造血干细胞移植,然而这种方法选择性差,在杀伤肿瘤细胞的同时也损害体内某些类型的正常细胞,而且只能杀死大部分已分化的肿瘤细胞不能杀死肿瘤干细胞,因此造成肿瘤治疗效果的不理想。所以,只有靶向肿瘤干细胞的治疗才能使恶性肿瘤治愈。在白血病干细胞表面具有一些不同于正常干细胞的表面标志。针对这些表面标志的靶向治疗将有效地靶向肿瘤干细胞而对正常干细胞没有任何损伤。研究发现CD123是AML干细胞所特有的表面标志,其在正常造血干细胞(CD341,CD38-)的表达<1%,而在急性髓系白血病干细胞的的表达>99%。除此之外,CD123在其他白血病细胞的表面也有表达。人白细胞介素3(IL-3)是CD123的配体,是造血干细胞增殖分化的正性调节因子,可刺激多能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化。IL-3还可增强白血病细胞对某些化疗药物敏感性,能选择性地诱导白血病细胞进人细胞周期,使周期特异性化疗药物对急性粒细胞白血病(AML)细胞的毒性增强。此外IL-3还可与IL4协同作用,促进T淋巴细胞前体细胞的发育,诱导CD4+T淋巴细胞自分泌生长,IL3可直接或间接地影响细胞毒T淋巴细胞的成熟和增殖。基于外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocyte, PBL)的生物治疗已经成为重要的抗肿瘤策略之一。PBL中的T细胞可以通过与肿瘤细胞接触形成T细胞-肿瘤细胞突触样结构,直接对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。然而,T细胞识别过程的复杂给肿瘤细胞提供了很多机会来逃逸T细胞对其特异性识别,因此肿瘤细胞得以存活并增殖。CD3是T淋巴细胞表面特异分子,通过它可以募集具有杀伤作用的T淋巴细胞。本实验基于此构建了抗CD3抗体的Fv与IL3融合形成的抗CD3-IL3融合蛋白,并且通过改造获得了表达量高、稳定性好的抗CD3-m2IL3,抗CD3-⊿IL3融合蛋白。为增强抗CD3-m2IL3,抗CD3-⊿IL3融合蛋白的稳定性,在VL间VH引入了人二硫键,表达并纯化后测定它们体外生物学活性和介导效应细胞杀伤靶细胞的作用。方法用重叠PCR (Overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3/IL3表达载体pAYZCD3/IL3,再用PCR法通过引物在抗CD3VL-100位和抗CD3VH-44位引入半胱氨酸突变,构建二硫键稳定的抗CD3/IL3表达载体pAYZCD3*/IL3,转化感受态大肠杆菌16C9进行原核表达。表达产物经6×His-tag亲和层析柱分离纯化,12%SDS-PAGE电泳及westen-blot鉴定。用同样的方法表达抗CD3*/m2IL3、抗CD3/m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FACS)检测抗CD3*/m2IL3.抗CD3/m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白与CD123+ M07e细胞和CD3+ Jurkat细胞的结合活性,将4种融合蛋白在0.2%的人血清白蛋白中37℃温育不同时间点至72h后,通过间接免疫荧光法FACS检测其结合活性,并比较二者的稳定性。利用非放射性荧光染料Calcein-AM进行抗体介导的体外特异性杀伤活性检测,Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(PBL)作为效应细胞,首先以TF1细胞或M07e或AML病人干细胞(CD34+CD38-CD123+为靶细胞,按不同效靶比,不同抗体浓度设组,以PBS,抗CD3/抗CD19双功能抗体为对照,另设CD123一的k562细胞为非相关靶细胞组,比较融合蛋白介导的特异性体外杀伤活性。取上述杀伤实验效靶比25:1,融合蛋白浓度500ng/ml各组,实时定量PCR检测各组穿孔素(Perforin)和颗粒酶A(Granzyme A)的释放。结果基因重组质粒pAYZCD3*/IL3.pAYZCD3/IL3.pAYZ CD3*/m2IL3.pAYZ CD3/ m2IL3,pAYZCD3*/⊿IL3及pAYZCD3/⊿IL3经测序证实序列正确,构建成功。抗CD3*/IL3在原核表达系统中进行可溶性表达过程中发现,表达产物经6×His-tag蛋白纯化柱纯化,浓缩后,12%SDS-PAGE显示在27kD,30KD和57kD各有一条带,但western-blot显示在30KD和57kD均有带,与预测结果一致。但后续实验发现pAYZCD3*/IL3.pAYZCD3/IL3的稳定性差,极易发生沉淀和降解。流式检测发现该蛋白与CD3单抗HIT3A有竞争活性,但与抗CD123单抗竞争活性很弱;ELISA检测结果发现,纯化蛋白中活性IL3的含量很低,约为蛋白定量结果的104分之一,所以我们推测IL3的一端发生了断裂或蛋白构象发生了变化。改造后的抗CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3非还原性SDS-PAGE中,在57KD、30kD和27KD有条,western-blot在57KD和30KD显示有带;还原性SDS-PAGE显示57KD带消失,在30kD和27kD各有一条带,western-blot在30kD显示有带,这些均与理论相符。57KD为二硫键稳定的二聚体,在还原剂巯基乙醇作用下二硫键断开,形成30kD和27kD的2条带。表达产物经纯化定量抗CD3*-m2IL3可达1mg/L,抗CD3*-⊿IL3可达2mg/LFACS检测四种融合蛋白均可与CD123+M07e细胞和CD3+Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制单抗AntiCD123和HIT3a与上述细胞的结合。体外血清稳定性实验结果抗CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3 37℃72h后活性基本不变,而抗CD3-m2IL3、抗CD3-⊿IL3则递减至消失,证明引入二硫键可增加蛋白的稳定性。抗CD3*-m2IL3、抗CD3-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3、抗CD3-⊿IL3体外介导T细胞杀伤靶细胞TF1、M07e细胞的效果比对照组明显(p<0.05),激活T细胞释放Perforin和Granzyme A的量均明显高于对照组(p<0.05)。结论本实验成功构建了pAYZCD3*/IL3、pAYZCD3/IL3、pAYZ CD3*/m2IL3、pAYZ CD3/m2IL3,pAYZCD3*/⊿IL3及pAYZCD3/⊿IL3的表达载体并获得了可溶性表达,改造后的抗CD3*/m2IL3、抗CD3/m3IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3,其稳定性或活性均有明显提高。二硫键稳定的CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3融合蛋白与抗CD3/ m2IL3,抗CD3/⊿IL3相比稳定性有明显提高,且抗原结合活性和体外介导T细胞发挥杀伤效应的能力没有明显改变。

陈婧婧[8](2009)在《远红外线对造血干/祖细胞生物学特性的影响》文中认为造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)是不均一的具有自我更新和多向分化潜能的细胞群。在发生学上,HSC属于成体干细胞,至少可分化为12种血细胞。利用造血干细胞的这一特性,进行HSC移植可能使遗传血液病、免疫缺陷病及恶性肿瘤等完全治愈。远红外线(far infrared rays,FIR,4—1000μm)是指4—1000μm的不可见光,其中对人体健康最有益的远红外线波长为4—15μm,据基尔霍夫定律证实,人体本身是一个远红外辐射源,他可以吸收及发射远红外光,所以当远红外线照射人体时,其频率与身体中的细胞分子、原子间的水分子运动频率相一致时,引起共振效应,其能量最高且能被生物体所吸收,使皮下组织深层部位的温度升高,产生的热效应使水分子活化,处于高能状态,加速人体需要的生物酶的合成,同时活化蛋白质等生物分子,从而增强机体免疫力和生物细胞的组织再生能力。通过科学检测,远红外线的热效应和使人体共振吸收后主要产生的影响有:激活生物大分子包括核酸和蛋白质;促进血液循环;增强新陈代谢;提高人体免疫功能和镇痛作用。还有报道称,远红外线可保持细胞高数量、高活性,促进损伤自愈,血管扩张,改善微循环,增加血流量,对血液循环有良好的作用,进一步抑制血压的上升,在防止血管内血栓形成的同时增进健康,防止老化,并具有消炎,止痛的作用。正因为远红外对人类些疾病有治疗作用,因此远红外产品接蹱而至。科学家早已注意到其对人体的副作用。因此我们以小鼠骨髓造血干/祖细胞为研究对象,观察远红外线对靶细胞生物学特性的影响,旨在对远红外线的生物学影响的机理进行探讨,并为临床治疗疾病提供实验依据。本实验所用方法:应用体外小鼠骨髓细胞培养技术,观察远红外线对粒-单祖细胞(CFU—GM)、红系祖细胞(CFU—E)、巨核细胞(CFU—Meg)和成纤维细胞(CFU—F)增殖和分化的影响,并且利用免疫荧光纳米粒子(IFNB)检测靶细胞表面分化抗原(CD),进一步评估远红外线对造血干/祖细胞的影响。进一步通过RT-PCR检测法证明远红外线的生物学影响的机理。实验结果证明:远红外线在37℃条件下照射时,CFU—E,CFU—F,CFU—Meg和CFU—GM生成有促进作用,小鼠骨髓细胞表面标记有变化,靶细胞经2min照射后,增殖最旺盛。2min组与其它实验组(1min,5min,10min)数据经统计学处理,具有差异性(P均<0.05)。通过RT—PCR进行m GM—CSF、m IL—2和m IL—3基因的扩增最终证明了远红外线的生物学效应。结论:远红外线对小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖具有正调节作用。

曲恒燕[9](2008)在《可穿膜的重组人TAT-tCNTF的制备及治疗作用研究》文中认为睫状神经营养因子(CNTF)是神经性细胞因子家族的成员,在体内具有多种生物学功能,主要作用对象是神经系统,对多种神经细胞都有作用,可促进这些神经细胞的分化、生长,支持其生存,促进神经损伤后的再生和修复。CNTF作为一种肯定的能促进神经再生的营养因子,可用于多种疾病的治疗研究,如亨廷顿舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森病、视网膜变性疾病、脑损伤、听神经和视神经损伤等。已报道的给药途径主要包括外周系统给药、大脑实质直接注射、侧脑室给药、鞘内注射、前房内注射、及玻璃体内注射等,外周给药,创伤性小,但受到血脑屏障的严重影响,进入大脑实质的量非常有限;后几种方式虽然作用部位直接,给药量容易控制,但创伤性风险大,应用困难。CNTF是蛋白质大分子,很难透过血脑屏障,从而限制了其在中枢的治疗应用,目前细胞移植和基因治疗方面的研究虽然在动物实验中取得了一些进展,由于这些治疗方案都采取手术和脑室注射等创伤性手段,离临床应用尚有很大的距离。蛋白转导域(PTD)介导的蛋白质治疗是一种极其方便而且高效的蛋白质转导方法,利用PTD的介导可以快捷有效地使外源性蛋白质通过外周血、腹腔等途径,跨越血脑屏障进入脊髓、脑组织细胞,在运送蛋白质、DNA或复合物治疗病毒感染、特异性杀伤肿瘤细胞及神经退行性疾病等方面有巨大的潜力,为神经系统疾病的治疗提供新的研究思路。因此根据现有的重组人CNTF半衰期短、稳定性差和存在免疫原性等问题将其基因进行改构,去掉容易降解的N端序列,删除产生免疫原性的C端序列,只保留必要的活性区域,采用重叠延伸PCR技术获得截短式CNTF活性片段,然后将转导效率较高的蛋白转导域TAT的核苷酸序列与改构的CNTF基因重组并原核高效表达出融合蛋白TAT-tCNTF。体外实验证明TAT-tCNTF具有明显的促进TF-1细胞生长的活性,促进细胞的增殖,并且具有明显的剂量依赖关系;促进SH-SY5Y细胞增殖与分化,并对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞损伤有保护作用,能明显的抑制损伤细胞的凋亡和坏死。将TAT与CNTF融合表达结合了两者的优势,以期无创进入脑组织达到治疗中枢神经退行性疾病是本研究的目的,因此TAT-tCNTF能否跨过膜屏障是首要的关注点,故进行了一系列穿膜实验,结果显示TAT-tCNTF能快速进入SH-SY5Y细胞,并且不受温度的限制,存在受体以外的转运途径;并能较快进入皮肤屏障,存在剂量和时间依赖关系;TAT-tCNTF在脑实质各处均有分布,而rhCNTF只能局限地分布在脑室周围的狭小区域,而不能进入实质深处的神经元细胞,对照鲜明地说明了连接有转导肽的TAT-tCNTF成功的透过血脑屏障进入神经元;另外,静脉注射和直肠给予大鼠100μg/kg TAT-tCNTF的药代动力学行为均符合二室开放模型一级动力学消除过程。表明TAT-tCNTF能穿越细胞膜、皮肤屏障、血脑屏障和直肠粘膜屏障。因而首次获得具有跨膜转导功能并且具有比市售rhCNTF更高生物活性的截短型人睫状神经营养因子活性片段。阿尔茨海默疾病(AD)是一种进行性、致命性神经变性疾病,破坏脑细胞,引起记忆障碍,影响思考和行为能力,分析判断能力衰退、情绪改变、行为失常、甚至意识模糊,最后导致死亡。AD患病率随年龄的增加而升高。CNTF是对外周及中枢神经系统具有广谱神经营养作用和诱导分化效能的细胞因子,可促进感觉神经元、运动神经元及中枢皮质和海马神经元的存活和生长,因此是治疗神经退行性疾病的有力候选者。透射电镜显示TAT-tCNTF可抑制Aβ在体外聚集和纤维形成,故随即进行了动物实验检测TAT-tCNTF是否在体内对Aβ也有作用,能否减少毒性老年斑的形成。Morris水迷宫行为学实验表明腹腔注射和直肠给予TAT-tCNTF均可以显着改善Aβ诱导的AD模型小鼠的空间学习记忆能力,刚果红染色显示老年斑减少,可阻止Aβ沉积;同时提取海马部位总RNA,进行RT-PCR以考察TAT-tCNTF治疗对Aβ代谢和转运相关基因表达的影响。经TAT-tCNTF治疗的海马中内皮素转化酶1和胰岛素降解酶的mRNA表达明显的增加,这两种Aβ降解酶表达的增加共同对Aβ消除起到了重要作用,相辅相成,协同起效,促进Aβ降解和移除,减轻Aβ对AD模型动物的损伤,减少神经元丢失;Western blot显示能提高AD小鼠脑内海马区域的nestin和ChAT的表达,诱发神经再生,诱导神经祖细胞向胆碱能神经元分化,增加ChAT在脑中的表达水平。因此,TAT-tCNTF抑制Aβ纤维的形成,减少老年斑的形成,对减缓疾病进程,甚至阻止疾病发生起到了重要作用,更关键的是促进了神经再生,逆转了神经退行性疾病的环境。由于血脑屏障的限制,CNTF从未用于AD的治疗,TAT-tCNTF的有效转导和显着治疗效果在Aβ诱导AD模型小鼠上得到成功表现,而且直肠给药具有方便、无创、肝脏首过效应低等特点,因而在神经系统疾病治疗中的应用前景令人瞩目,这种非创伤性给药途径更使TAT-tCNTF成为AD治疗的新策略。在将CNTF用于运动神经元疾病的治疗研究当中,就意外地发现其能够导致确切的体重下降,因而又对TAT-tCNTF进行饮食诱导型肥胖(DIO)小鼠的减肥治疗研究,并对其减肥机制进行初步探讨。TAT-tCNTF可以使高脂饲料喂养的DIO小鼠体重增长率降低,脂肪湿重减轻,脂肪细胞变小,并降低肥胖小鼠的血糖水平,高剂量组效果更明显。TAT-tCNTF降低了神经肽Y在脑中的表达水平,减少了其增加摄食的功效。而且无论是腹腔注射还是直肠给予TAT-tCNTF对肥胖症都显示出同样的治疗作用。可见,TAT-tCNTF是一个多效因子,可以保护细胞免于死亡,抑制Aβ聚集沉积和形成老年斑,促进Aβ降解和移除,增加nestin和ChAT的表达,诱发神经再生,减轻体重,降低血糖。TAT-tCNTF不仅解决了大分子通过血脑屏障的问题,而且为中枢治疗药物提供了一条新颖无创的治疗方式。TAT-tCNTF可以通过直肠粘膜吸收进入体内,为人用舌下含服制剂的研发开辟了道路,从而增加用药安全性及患者依从性。因此,TAT-tCNTF不仅是神经退行性疾病和肥胖相关疾病的很有前途的治疗药物,而且开辟了治疗中枢神经系统疾病的非创伤性治疗途径。

陈妤[10](2008)在《免疫毒素IL3-PE38KDEL的表达纯化及生物学活性鉴定》文中研究表明急性髓性白血病(Acute myelogenous leukemia,AML)是我国最常见的恶性血液病。已有研究表明,白血病干细胞(Leukemia stem cell ,LSC)是产生白血病和维持白血病状态的祖先细胞。LSC多处在G0期,对常规化疗药物无效,是白血病复发的根源。近年的研究显示,IL3受体α链(CD123)是白血病干细胞(LSC)特异性的表面标志,而正常人类造血干细胞没有此标志。因而IL3受体α链成为治疗白血病的重要靶点。本课题拟用基因工程技术构建一种新的免疫毒素IL3-PE38KDEL,细胞因子白介素3(Interleukin-3,IL-3)为导向分子,铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL为细胞毒性分子,免疫毒素IL3-PE38KDEL可以靶向性的针对LSC发挥特异性的杀伤作用。目的:本实验通过构建pQE30-IL3-Linker-PE38KDEL原核表达载体,表达并用金属Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,对目的蛋白进行功能复性,并采用MTT实验,用带有CD123表型的TF-1(人红白血病细胞)细胞株对融合蛋白IL3-PE38KDEL进行生物学活性鉴定,分析重组蛋白对TF-1细胞的杀伤效应及蛋白浓度影响关系,为将来的进一步研究奠定基础。方法:1.重组pQE30-IL3-Linker-PE38KDEL融合蛋白的诱导表达及鉴定:构建的重组质粒IL3-PE38KDEL经限制性内切酶酶切鉴定,DNA双向测序证实克隆序列完全无误后转入表达菌SG13009中,经筛选用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Westernblot鉴定。2.用金属Ni2+亲和层析柱纯化分离出目的蛋白及重组蛋白IL3-PE38KDEL的生物学活性检测:提纯的目的蛋白经梯度透析复性,用MTT法观察不同浓度下重组蛋白IL3-PE38KDEL对含有CD123表型的TF-1人红白血病细胞侵袭过程的影响及对侵袭影响程度的剂量关系。结果:1.重组质粒载体在工程菌SG13009中得到高效表达,产物经SDS-PAGE方法鉴定为57kDa的带有组氨酸标签的融合蛋白,用抗6-His标签的单抗做Westernblot得到清晰单一的条带,证明融合蛋白成功表达。2.用金属Ni2+亲和层析柱纯化得到纯度为90%以上的融合蛋白,梯度复性后得到纯度更高有活性的重组蛋白IL3-PE38KDEL,对TF-1人红白血病细胞侵袭的抑制呈剂量依赖性,发现当融合蛋白IL3-PE38KDEL的浓度为200μg/ml,作用72小时,对细胞侵袭能力的抑制达到高峰,约83%的细胞增殖能力受到抑制;而当浓度升至500μg/ml时抑制率无太大改变,为85%。结论:利用pQE30原核表达载体构建的重组质粒pQE30-IL3-Linker-PE38KDEL能在工程菌SG13009中高效表达重组蛋白IL3-PE38KDEL,而且运用亲和层析技术能使目标蛋白得到有效的分离纯化。实验结果表明,重组蛋白IL3-PE38KDEL能有效抑制TF-1人红白血病细胞侵袭,说明利用原核表达系统可以得到有活性的融合蛋白IL3-PE38KDEL,而且这种抑制作用具有剂量依赖性。统计学证明对TF-1细胞侵袭的抑制作用具有统计学意义。发现经浓度为200μg/ml融合蛋白IL3-PE38KDEL作用72小时后,对细胞侵袭能力的抑制达到高峰,约有83%的TF-1细胞侵袭能力受到抑制;而当浓度继续升高直至500μg/ml时抑制率无太大变化,约85%的细胞侵袭能力受到抑制。这为将来探寻融合蛋白对AML干细胞NF-κB活性的影响及IL3–PE38KDEL对AML长期始动细胞(动物模型)的选择性作用打下实验基础。

二、Effects of GM-CSF, IL-3, and GM-CSG/IL-3 fusion protein on apoptosis of human myeloid leukemic cell line Tf-1 induced by irradiation(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、Effects of GM-CSF, IL-3, and GM-CSG/IL-3 fusion protein on apoptosis of human myeloid leukemic cell line Tf-1 induced by irradiation(论文提纲范文)

(1)多能干细胞分化再生T细胞的体内抗肿瘤评估及再生可移植髓系细胞研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第1章 多能干细胞分化再生的T细胞体内抗肿瘤评估
    1.1 引言
        1.1.1 癌症细胞免疫疗法概述
        1.1.2 CAR-T细胞免疫疗法概述
        1.1.3 再生T细胞的研究进展
    1.2 实验材料和实验方法
        1.2.1 实验动物
        1.2.2 实验试剂
        1.2.3 实验器材
        1.2.4 实验方法
    1.3 实验结果
        1.3.1 iR9 mESCs体外定向分化获得造血祖细胞iHPCs
        1.3.2 iR9 mESCs来源的iHPCs移植免疫缺陷鼠再生T淋巴细胞
        1.3.3 CD19-CAR iT细胞体内肿瘤杀伤功能验证策略
        1.3.4 CD19-CAR iT可有效清除肿瘤模型鼠外周血中的B淋巴细胞
        1.3.5 CD19-CAR iT可有效消除肿瘤模型鼠的肿瘤负荷
        1.3.6 CD19-CAR iT可有效延长肿瘤模型鼠的生存期
        1.3.7 CD19-CAR iT细胞在小鼠体内显示出增殖和激活能力
    1.4 总结和讨论
第2章 多能干细胞再生可移植髓系细胞研究
    2.1 引言
        2.1.1 髓系细胞的发育和调控
        2.1.2 再生髓系细胞的现状和进展
        2.1.3 髓系细胞再生新思路
    2.2 实验材料和方法
        2.2.1 实验动物
        2.2.2 实验试剂
        2.2.3 实验器材
        2.2.4 实验方法
    2.3 实验结果
        2.3.1 iRunx1-P2A-Hoxa10-EGFP mES打靶细胞系(iR10 mESCs)构建成功
        2.3.2 iR10 mESCs体外诱导分化生成造血祖细胞
        2.3.3 基质细胞OP9-DL1较MS5-DL1更能促进造血祖细胞产生
        2.3.4 iR10 mESCs来源iHPCs移植Rag1~(-/-)小鼠能够再生髓系细胞
        2.3.5 受体鼠各组织中能检测到再生髓系细胞
        2.3.6 受体鼠骨髓中检测到再生的髓系祖细胞
        2.3.7 iR10 mESCs来源髓系细胞在体内短期存在
        2.3.8 野生型受体鼠体内再生髓系细胞
    2.4 总结和讨论
参考文献
附录 缩略词
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

(2)巴桑母酥油丸对小鼠MC3T3-E1细胞增殖、成骨分化及造血调节因子分泌的影响(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
中英文缩略词表
前言
第一部分 巴桑母酥油丸含药血清对小鼠MC3T3-E1 细胞增殖、分化、矿化的影响
    引言
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 细胞株
        1.3 实验药物
        1.4 实验耗材和主要设备
    2 实验方法
        2.1 巴桑母酥油丸乳浊液的制备
        2.2 巴桑母酥油丸含药血清的制备
        2.3 细胞培养、冻存、复苏
        2.4 细胞形态观察
        2.5 CCK-8 法检测细胞增殖情况
        2.6 碱性磷酸酶染色具体步骤
        2.7 茜素红S(Alizarin red S)染色具体步骤
        2.8 实验数据的统计处理
    3 结果
        3.1 细胞正常形态
        3.2 各组MC3T3-E1 细胞培养72h时未染色结果
        3.3 HE染色结果
        3.4 巴桑母酥油丸含药血清对小鼠MC3T3-E1 细胞增殖的影响
        3.5 碱性磷酸酶染色结果
        3.6 茜素红染色结果
    4 讨论
        4.1 对巴桑母酥油丸组方各药物的认识
        4.2 对巴桑母酥油丸组方的认识
        4.3 巴桑母酥油丸含药血清对成骨细胞增殖、矿化、钙化的影响
    小结
第二部分 巴桑母酥油丸含药血清对小鼠MC3T3-E1 细胞成骨相关通路的影响
    引言
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 细胞株
        1.3 实验药物
        1.4 实验耗材和主要设备
    2 实验方法
        2.1 巴桑母酥油丸含药血清的制备
        2.2 PBS缓冲液制备
        2.3 β-catenin、Runx2和Osx基因表达检测
        2.4 逆转录合成cDNA
        2.5 实时荧光定量PCR反应
        2.6 统计学方法
    3 结果
        3.1 RNA完整性的鉴定
        3.2 目的基因经普通PCR扩增后结果
        3.3 两组MC3T3-E1 细胞的目的、内参基因的实时荧光定量PCR的动力曲线和2-△△Ct值
    4 讨论
    小结
第三部分 巴桑母酥油丸含药血清对小鼠MC3T3-E1 细胞表达黏附因子的影响
    引言
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 细胞株
        1.3 实验药物
        1.4 实验耗材和主要设备
    2 实验方法
        2.1 巴桑母含药血清的制备
        2.2 PBS缓冲液制备
        2.3 基质细胞衍生因子SDF-1 蛋白表达合成的测定
        2.4 MC3T3-E1 细胞分泌SDF-1 情况测定(ELISA法)
        2.5 实验数据的统计处理
    3 结果
        3.1 WB实验结果
        3.2 ELISA实验结果
    4 讨论
    小结
第四部分 巴桑母酥油丸含药血清对小鼠MC3T3-E1 细胞表达造血调节因子的影响
    引言
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 细胞株
        1.3 实验药物
        1.4 实验耗材和主要设备
    2 实验方法
        2.1 巴桑母酥油丸含药血清的制备
        2.2 PBS缓冲液制备
        2.3 GM-CSF含量测定具体步骤
        2.4 LIF含量测定具体步骤
        2.5 实验数据的统计处理
    3 结果
    4 讨论
    小结
结论
附图
创新与不足
参考文献
致谢
附件1 文献综述
    参考文献
附件2 硕士研究生在读期间论文发表情况

(3)西达本胺对急性髓系白血病(AML)作用机制及临床应用的初步研究(论文提纲范文)

英文缩略语表
中文摘要
英文摘要
第一部分: 西达本胺通过阻滞ERK1/2信号通路活化抑制t(8;21)AML细胞增殖及AML1/ETO、C-KIT蛋白表达
    前言
    研究对象和方法
    研究结果
    讨论
    结论
第二部分: 西达本胺联合DCAG方案治疗难治/复发急性髓系白血病(AML)的初步研究:
    前言
    研究对象和方法
    研究结果
    讨论
    结论
参考文献
文献综述
    参考文献
攻读博士学位期间发表文章
致谢

(4)不同发育阶段人胸腺的组成分析及其在人源化小鼠模型构建中的应用(论文提纲范文)

前言
中文摘要
Abstract
中英文缩略词表
第1章 绪论
    1.1 引言
    1.2 综述
        1.2.1 免疫系统人源化小鼠模型的现状、应用和发展
        1.2.2 环孢素研究进展
第2章 用胚胎干细胞和胚胎胸腺组织建立人源化小鼠的模型
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验试剂、仪器及购买公司
        2.2.2 主要药物及生产公司
        2.2.3 实验动物及来源
        2.2.4 组织标本及来源
        2.2.5 使用的手术器械
        2.2.6 配制主要溶液
        2.2.7 实验方法
    2.3 结果
    2.4 讨论
第3章 胚胎、幼儿胸腺及胸腺疾病患者胸腺细胞表型的比较研究及胸腺疾病的探索
    3.1 前言
    3.2 材料及方法
        3.2.1 实验试剂、仪器及购买公司
        3.2.2 组织标本及来源
        3.2.3 实验方法
    3.3 结果
        3.3.1 胚胎胸腺胸腺细胞表型分析
        3.3.2 幼儿胸腺细胞发育分析及外周血表型分析
        3.3.3 胸腺疾病胸腺细胞表型分析
    3.4 讨论
第4章 利用幼儿胸腺建立人源化小鼠模型
    4.1 前言
    4.2 材料及方法
    4.3 结果
    4.4 讨论
第5章 结论
参考文献
作者简介及在学期间取得的科研成果
致谢

(5)靶向肿瘤重组毒素IL6T23-PE38KDEL的表达、纯化及其生物活性的研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
英文缩略词表
第一篇 文献综述
    第1章 细菌毒素源性重组毒素的研究进展
        1.1 免疫毒素的定义
        1.2 细菌毒素的作用机制
        1.3 截断的细菌毒素
        1.4 重组免疫毒素的生产和临床测试
        1.5 针对血液恶性肿瘤的免疫毒素的优缺点
    第2章 IL6 及其受体与癌症的关系
        2.1 IL-6/IL-6R
        2.2 IL6 在人类疾病中所扮演的角色
        2.3 IL6 与癌症
        2.4 极度瘦弱
        2.5 IL6 为导向的治疗策略
    第3章 免疫毒素研究进展及其瓶颈
        3.1 靶点和导向的种类
        3.2 植物及细菌蛋白毒素配体
        3.3 核酸酶及人源蛋白毒素
        3.4 临床测试的免疫毒素
        3.5 免疫毒素在临床的应用及存在的问题
        3.6 前景与展望
第二篇 研究内容
    第1章 IL6_(T23)-PE38KDEL 构建及大肠杆菌表达
        1.1 材料与方法
        1.2 结果
        1.3 讨论
        1.4 小结
    第2章 IL6_(T23)-PE38KDEL 在巨大芽胞杆菌中的分泌表达
        2.1 材料与方法
        2.2 结果
        2.3 讨论
        2.4 小结
    第3章 IL6_(T23)-PE38KDEL 在毕赤酵母中的分泌表达
        3.1 材料与方法
        3.2 结果
        3.3 讨论
        3.4 小结
    第4章 重组毒素 IL6_(T23)-PE38KDEL 的纯化
        4.1 材料与方法
        4.2 结果
        4.3 讨论
        4.4 小结
    第5章 IL6_(T23)-PE38KDEL 重组毒素体外抗癌活性
        5.1 材料与方法
        5.2 结果
        5.3 讨论
        5.4 小结
    第6章 IL6_(T23)-PE38KDEL 重组毒素对鼠骨髓瘤模型的治疗试验
        6.1 材料与方法
        6.2 结果
        6.3 讨论
        6.4 小结
结论
参考文献
导师及作者简介
攻读学位期间发表的学术论文及取得的成果
致谢

(6)转录因子E2F1调节树突状细胞成熟的分子机制(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 引言
    1.2 树突状细胞的研究概况
        1.2.1 树突状细胞的来源和分类
        1.2.2 DC的生物学功能
        1.2.3 DC分化的分子调控网络
    1.3 转录因子E2F1的研究概况
        1.3.1 E2F家族组成和结构
        1.3.2 E2F1的生物学功能
        1.3.3 E2F1对信号通路调控的研究
    1.4 接头蛋白Gab2的研究概况
        1.4.1 Gab家族和结构
        1.4.2 Gab2的生物学功能
        1.4.3 Gab2与信号转导
    1.5 研究意义、内容和方案
        1.5.1 研究意义
        1.5.2 主要研究内容和方案
第2章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验用细胞
        2.1.2 实验用材料和试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 质粒构建
        2.2.2 细胞的培养和转染
        2.2.3 人外周血单核细胞来源DC的获得和培养
        2.2.4 人外周血单核细胞来源DC的转染
        2.2.5 mRNA的抽提,反转录和PCR
        2.2.6 蛋白的提取和Western Blot
        2.2.7 流式细胞术
        2.2.8 ELISA
        2.2.9 迁移实验
        2.2.10 T细胞增殖实验
        2.2.11 报告基因实验
        2.2.12 小鼠Bone Marrow derived-DC获取和培养
第3章 实验结果
    3.1 E2F1对树突状细胞成熟的调控作用
        3.1.1 LPS诱导DC成熟过程中E2F1表达瞬时下调
        3.1.2 敲低E2F1增强DC2.4表型的成熟
        3.1.3 敲低E2F1增强DC2.4的功能成熟
        3.1.4 过表达E2F1抑制DC成熟
        3.1.5 E2F1基因敲除鼠的BMDC表型更加成熟
        3.1.6 改变E2F1表达影响DC细胞中多条信号通路的活化
    3.2 E2F1对树突状细胞成熟调控的机制
        3.2.1 E2F1调控信号通路上游接头蛋白的表达
        3.2.2 Gab2调控DC2.4的成熟
        3.2.3 E2F1调控Gab2表达的机制
第4章 讨论
    4.1 研究总结
    4.2 研究中存在的问题及期待
    4.3 研究的创新性
参考文献
附录引物和dsRNA
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

(7)靶向白血病干细胞的抗CD3/IL3及其二硫键稳定构型的融合蛋白的构建、表达及活性研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
前言
实验材料
第一部分 抗CD3-IL3融合蛋白的构建、改造、及结合活性测定
第二部分 抗CD3~*-m_2IL3、抗CD3-m_2IL3,抗CD3~*-⊿IL3及抗CD3-⊿IL3融合蛋白介导的细胞毒作用
    讨论
    结论
    参考文献
综述一 单克隆抗体和双功能抗体的临床应用
    参考文献
综述二 IL-3的研究进展
    参考文献
附录一
附录二
附录三
致谢

(8)远红外线对造血干/祖细胞生物学特性的影响(论文提纲范文)

摘要
Abstract
缩略词表
第一章 综述
    1.1 造血干细胞研究进展
    1.2 免疫学标记研究进展
    1.3 远红外线研究进展
    参考文献
第二章 远红外线对小鼠骨髓造血干细胞影响的研究实验
    2.1 引言
    2.2 实验部分
        2.2.1 材料与试剂
        2.2.2 仪器设备
        2.2.3 实验方法
    2.3 结果与分析
    2.4 讨论
第三章 远红外线对小鼠骨髓造血祖细胞集落形成的影响
    3.1 引言
    3.2 实验部分
        3.2.1 材料与试剂
        3.2.2 仪器设备
        3.2.3 实验方法
    3.3 结果与分析
    3.4 讨论
第四章 远红外线对小鼠骨髓细胞的分子机理探讨
    4.1 引言
    4.2 实验部分
        4.2.1 材料与试剂
        4.2.2 仪器设备
        4.2.3 实验方法
    4.3 结果与分析
    4.4 讨论
致谢
参考文献
攻读学位期间研究成果
答辩委员会签名

(9)可穿膜的重组人TAT-tCNTF的制备及治疗作用研究(论文提纲范文)

中文摘要
英文摘要
前言
    I. CNTF 的结构
    II. CNTF 的分布
    III. CNTF 的信号转导通路
    IV. CNTF 的生理活性与相关疾病
    V. 重组人 CNTF 的研究现状
    VI. CNTF 与血脑屏障
    VII. CNTF 与蛋白转导域
第一章 TAT-tCNTF 的载体构建与蛋白表达
    一、实验材料
    二、实验方法
    三、实验结果
        1. SOE-PCR 扩增tCNTF 基因
        2. 重组表达质粒的构建流程
        3. 重组表达质粒pBV220-TAT-tCNTF 的鉴定
        4. TAT-tCNTF 在大肠杆菌中的表达及优化
        5. 融合蛋白包涵体的洗涤
        6. 融合蛋白的溶解与复性
        7. Western blot 鉴定TAT-tCNTF 融合蛋白
    四、讨论
第二章 TAT-tCNTF 的生物学作用
    一、实验材料
    二、实验方法
    三、实验结果
        1. TAT-tCNTF 对SH-SY5Y 细胞形态学的影响
        2. TAT-tCNTF 的生物学活性检测
        3. TAT-tCNTF 蛋白样品活性的稳定性结果
        4. TAT-tCNTF 对细胞周期的影响
        5. 软琼脂培养克隆形成实验结果
        6. TAT-tCNTF 对细胞凋亡的作用
        7. TAT-tCNTF 对损伤细胞的LDH 分析
        8. TAT-tCNTF 对损伤细胞存活率的影响
    四、讨论
第三章 TAT-tCNTF 穿膜作用的研究
    一、实验材料
    二、实验方法
    三、实验结果
        1. TAT-tCNTF 透过细胞膜结果
        2. TAT-tCNTF 透过细胞膜机制
        3. TAT-tCNTF 穿透血脑屏障入脑
        4. TAT-tCNTF 穿透皮肤屏障结果
        5. 药代动力学行为
    四、讨论
第四章 TAT-tCNTF 对阿尔茨海默疾病模型小鼠的治疗作用
    一、实验材料
    二、实验方法
    三、实验结果
        1. TAT-tCNTF 抑制A?纤维聚集
        2. TAT-tCNTF 对AD 模型小鼠空间学习记忆的改善效果
        3. TAT-tCNTF 对AD 模型小鼠脑组织病理形态的影响
        4. TAT-tCNTF 对AD 模型小鼠老年斑形成的影响
        5. TAT-tCNTF 对AD 模型小鼠海马中A?代谢酶mRNA表达的影响
        6. TAT-tCNTF 对AD 模型小鼠海马中ChAT 和nestin 表达的影响
    四、讨论
第五章 TAT-tCNTF 对饮食诱导型肥胖小鼠的减肥作用研究
    一、实验材料
    二、实验方法
    三、实验结果
        1. 对DIO 小鼠体重的影响
        2. 对DIO 小鼠血清生化指标的影响
        3. 对DIO 小鼠腹腔脂肪重量及肥胖指数的影响
        4. 对DIO 小鼠脂肪细胞形态的影响
        5. 对DIO 小鼠NPY 和Leptin 基因表达的影响
    四、讨论
结论
参考文献
致谢
缩略词表
文章列表

(10)免疫毒素IL3-PE38KDEL的表达纯化及生物学活性鉴定(论文提纲范文)

符号说明
中文摘要
英文摘要
论文正文:免疫毒素IL3-PE38KDEL 的表达纯化及生物学活性鉴定
    前言
    第一部分 免疫毒素IL3-PE38KDEL 的表达与鉴定
        1 实验材料
        2 实验方法
        3 实验结果
        4 讨论
    第二部分 融合蛋白IL3-PE38KDEL 的纯化复性及生物学活性检测
        1 实验材料
        2 实验方法
        3 实验结果
        4 讨论
    结论
    参考文献
文献综述:急性髓系白血病干细胞研究进展
致谢
攻读硕士期间发表的学术论文

四、Effects of GM-CSF, IL-3, and GM-CSG/IL-3 fusion protein on apoptosis of human myeloid leukemic cell line Tf-1 induced by irradiation(论文参考文献)

  • [1]多能干细胞分化再生T细胞的体内抗肿瘤评估及再生可移植髓系细胞研究[D]. 吕萃. 中国科学技术大学, 2020(01)
  • [2]巴桑母酥油丸对小鼠MC3T3-E1细胞增殖、成骨分化及造血调节因子分泌的影响[D]. 张灵莉. 成都中医药大学, 2019(04)
  • [3]西达本胺对急性髓系白血病(AML)作用机制及临床应用的初步研究[D]. 刘静. 中国人民解放军医学院, 2017(02)
  • [4]不同发育阶段人胸腺的组成分析及其在人源化小鼠模型构建中的应用[D]. 张哲峰. 吉林大学, 2014(09)
  • [5]靶向肿瘤重组毒素IL6T23-PE38KDEL的表达、纯化及其生物活性的研究[D]. 郭德军. 吉林大学, 2012(09)
  • [6]转录因子E2F1调节树突状细胞成熟的分子机制[D]. 方芳. 中国科学技术大学, 2012(01)
  • [7]靶向白血病干细胞的抗CD3/IL3及其二硫键稳定构型的融合蛋白的构建、表达及活性研究[D]. 张秀丽. 北京协和医学院, 2011(11)
  • [8]远红外线对造血干/祖细胞生物学特性的影响[D]. 陈婧婧. 上海师范大学, 2009(07)
  • [9]可穿膜的重组人TAT-tCNTF的制备及治疗作用研究[D]. 曲恒燕. 中国人民解放军军事医学科学院, 2008(11)
  • [10]免疫毒素IL3-PE38KDEL的表达纯化及生物学活性鉴定[D]. 陈妤. 重庆医科大学, 2008(01)

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GM-CSF、IL-3、GM-CSG/IL-3融合蛋白对辐照诱导人髓系白血病细胞Tf-1凋亡的影响
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