一、不同表型的人宫颈癌细胞亚克隆株的基因表达谱（论文文献综述）
刘健[1]（2021）在《基于单细胞转录组测序技术对宫颈恶性肿瘤异质性及相关基因的研究》文中研究表明背景宫颈癌（cervical cancer）是目前世界上所有女性人口中第四大癌症发病类型,全世界每年有超过50万名女性被诊断为宫颈癌,且这种疾病已经导致了30多万病例的死亡,它已经成为了全球范围内的一种公共健康问题。在宫颈癌的发生发展过程中,伴随着一系列细胞谱系和突变基因的出现,然而在癌前病变和恶性病变的宫颈组织中,各种细胞类型及其分子特性的全谱仍没有明确定义,进而无法明确它们在宫颈癌发病机理中的作用。同时,目前针对宫颈癌的筛查主要依据人乳头瘤病毒DNA（human papillomavirus DNA,HPV-DNA）检测和液基细胞学检测（Thinprep cytologic test,TCT）的联合筛查,这种方法虽然可以近早发现宫颈病变降低宫颈癌的发病率和死亡率,但是也易漏检部分病人;阴道镜下活检并进行病理检查虽然可以确诊,但有创性检查也大大限制了阴道镜的临床应用。因此,筛选肿瘤相关基因对于宫颈癌的早期诊断以及发现其治疗靶点是十分必要的。先前基于临床组织样本的实验或应用数学模型探索宫颈癌分子特征的研究掩盖了不同细胞群体之间的差异。部分研究也只是依赖已知的膜标记物来筛选特定的细胞类型,无法完全区分组织中不同的细胞类型、检测出稀有细胞群体或发现具有特定状态的细胞,这就需要对恶性组织中不同的细胞群体进行全面系统的了解。为了更好地表征宫颈恶性肿瘤的细胞异质性就要通过单细胞转录组测序（Single-cell RNA-sequencing,sc RNA-seq）技术对单个细胞进行RNA分析,从而在肿瘤微环境中区分不同的细胞群体,捕获稀有细胞亚群的变化,从而提供了有关单细胞特性和异质性的更多信息。同时对宫颈癌进行sc RNA-seq分析获得的差异基因可能为其特异标志物的筛选以及精准治疗提供新的方向。本研究通过对来源于宫颈恶性肿瘤和癌旁的组织样本的群体细胞进行单细胞转录组测序,获得目标群体的单细胞转录组数据,实现对高通量单细胞数据进行细胞群体的分类以及细胞群体间基因表达的差异分析,探究宫颈恶性肿瘤微环境的异质性,并筛选出差异表达基因。方法采集新鲜的宫颈鳞状细胞癌组织和相应的宫颈癌旁组织样本制备单细胞悬液,将通过质检的上万个细胞应用10x Genomics和Illumina Nova Seq 6000平台进行sc RNA-seq。将获得的基因表达量进行PCA（主成分）线性降维分析,通过t SNE（非线性降维）将PCA结果在二维空间进行可视化,使用Seurat软件包进行Marker基因鉴定,使用Single R包进行sc RNA-seq的无偏细胞类型识别,独立地推断每个单细胞的起源细胞,得到细胞群体的分类并确定主要细胞簇。使用Seurat软件包进一步筛选出宫颈癌组织与癌旁组织间的差异表达基因。通过超几何分布检验进行差异显着基因的GO和KEGG富集分析。使用Monocle进行拟时序分析,描绘肿瘤细胞分化的动态轨迹。最后,依据纳入排除标准收集临床上2020年8月-2021年3月之间通过病理诊断为宫颈癌的患者,采集其癌症组织及癌旁组织,通过RT-q PCR实验对7个cluster特异性基因的转录水平进行验证。结果1.细胞类型鉴定:将从宫颈鳞状细胞癌组织获得的12,037个单细胞进行下游分析。通过t SNE降维聚类和已知的细胞类型marker,将细胞聚成了6个主要的cluster,包括:NK＿T cells;Fibroblasts cells;Epithelial cells;Endothelial cells;B cells;Macrophage cells。2.差异表达基因筛选:与癌旁组织对比,在癌症样本中共筛选出117个差异基因,其中有29个上调和1个下调的差异显着表达基因。差异表达基因多表达于Fibroblasts cells和Epithelial cells。进一步通过对组间差异基因的筛选得到7个在每个cluster显着差异表达的基因:HSPA6、KRT19、TACSTD2、CLDN4、WFDC2、S100A2、SLPI。3.差异基因富集分析:GO分析表明差异基因的功能多集中于蛋白折叠（热激蛋白家族）;趋化因子和细胞因子相关的信号通路;细胞对肿瘤坏死因子的反应;受体介导的细胞内吞作用等生物过程。KEGG分析表明差异表达基因多集中于免疫系统,与感染性疾病相关,以及信号转导过程相关的通路。4.宫颈恶性肿瘤的免疫微环境:由NK细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞、单核细胞组成,并包含多种亚型,同时KEGG pathway分析表明趋化因子CCL2、CCL3、CXCL1参与了免疫细胞的多条通路。5.拟时序分析:通过进一步对Epithelial cells簇的分析,共得到两个细胞亚簇,我们将其定义为type 1和type 2 Epithelial cells,宫颈癌上皮细胞趋向于由type 1向type 2分化进展,type 1高表达PIK3R3、CENPF等基因,type 2高表达KLK5、CEACAM1等基因。6.基因表达水平的验证:筛选得到每个cluster特有的7个基因通过RT-q PCR实验证实在宫颈癌症和癌旁组织中具有显着差异:HSPA6（p=0.0013）、KRT19（p=0.016）、TACSTD2（p=0.0182）、CLDN4（p<0.001）、WFDC2（p=0.0321）、S100A2（p=0.0027）、SLPI（p=0.0172）。结论1.本研究通过scRNA-seq描绘了宫颈鳞状细胞癌的肿瘤微环境的单细胞图谱,证明了宫颈恶性肿瘤的异质性,系统的分析了组成宫颈癌组织的6种细胞,肿瘤微环境中的5种免疫细胞及其亚型,并发现了宫颈癌症上皮细胞的2种不同亚型。2.Fibroblasts cells和Epithelial cells具有显着的组间差异,组间差异基因几乎均来自两种类型的细胞,证明成纤维细胞可能密切参与宫颈癌的进展。3.宫颈癌复杂的免疫微环境为研究宫颈癌的发生发展机制提供了基础,同时趋化因子CCL2、CCL3和CXCL1在调节免疫微环境中起到了重要作用。4.探索了两种类型的癌症上皮细胞分化的动态轨迹,肿瘤上皮细胞由type 1向type 2转化,type 2具有更明显的恶性表型。可以推测type 1高表达的CENPF基因可能通过激活PI3K/AKT通路促进细胞增值为早期癌症发生事件。Type 2高表达的KLK5、CEACAM1等基因可能为宫颈癌晚期治疗效果和预后的标靶。5.从单细胞水平探究了宫颈癌的差异表达基因,宫颈癌组织中7个cluster特有的显着差异基因（HSPA6、KRT19、TACSTD2、CLDN4、WFDC2、S100A2、SLPI）可能对宫颈癌的发生发展具有重要意义,有可能作为未来诊断和预后的标志物。
张兰兰[2]（2021）在《人的AKT1启动子及其mRNA的3’-UTR区域中G-四链体结构的鉴定和功能研究》文中认为富含鸟嘌呤（G-rich）的DNA和RNA能够折叠形成一种特殊的结构,G-四链体（G-quadruplex）。该结构广泛存在于人类的基因组中,能够调节包括DNA复制、端粒维持、基因表达与调控以及遗传稳定性在内的多个生物学过程。AKT又称蛋白激酶B（PKB）,是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,参与多种重要的细胞信号转导途径,包括细胞生存、增殖、侵袭、凋亡和血管生成。AKT1在细胞生长和存活中起着关键作用,其在肿瘤中的激活是由不同的机制介导的,目前所知的主要包括基因表达升高和翻译后蛋白磷酸化。本研究通过生物信息学和生物技术从mRNA水平及DNA/RNA结构的角度探讨AKT1在癌症中上调的机制,研究了人的AKT1启动子及其mRNA 3’-UTR中多个鸟嘌呤簇（G-tracts）之间形成G-四链体结构的可能性。本研究主要实验结果如下:1.利用生物信息学的方法系统展示了 AKT1在多种癌症中的表达上调,探索其高表达指标用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和肝癌等临床预后因子的可能性,同时探讨了AKT1基因表达在多种癌症中与免疫浸润细胞的相关性。2.圆二色谱分析表明,基于AKT1启动子G-tracts区域序列合成的寡聚核苷酸在G-四链体结构的特异波长处呈现摩尔椭圆峰。利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶迁移实验和G-四链体特异性抗体免疫染色实验,也证明了这些寡核苷酸在钾离子或锂离子存在的退火条件下形成G-四链体结构。硫酸二甲酯（DMS）足迹保护试验鉴定了参与G-四链体形成的核苷酸。染色质免疫共沉淀和PCR阻滞试验也验证了 AKT1启动子区存在G-四链体结构。在荧光素酶报告试验中,AKT1启动子的G-tracts突变降低了这些G-rich区域介导的报告基因的表达,表明G-四链体结构正向调控AKT1基因表达。实验结果还显示,AKT1启动子区G-四链体结构的形成可能受转录因子SP1调控。此外,DNA解旋酶RECQL与AKT1的表达呈负相关,因此可能调节AKT1 G-四链体的形成。3.利用圆二色谱分析、凝胶迁移实验和DMS足迹保护试验,证明了 AKT1 mRNA 3’-UTR区域存在G-四链体结构。进一步的实验结果表明,该G-四链体结构的形成可能影响了miR-193b-3p与AKT1 mRNA 3’-UTR的结合和该区域对AKT1基因表达的调控作用。4.利用已知的人MYC基因启动子的G-四链体晶体结构及分子对接技术对小分子化合物石蒜碱进行了分子对接,显示该小分子药能够很好的和G-四链体结合。非变性聚丙烯凝胶电泳及Taq聚合酶延伸阻滞试验的方法,验证了石蒜碱可以诱导形成并且稳定G-四链体结构。因此,石蒜碱代表了一类新的G-四链体结合配体,可能成为潜在的抗癌药物。综上所述,本论文的研究证明G-四链体结构存在于人AKT1的启动子和mRNA 3’-UTR区域,此结构对AKT1基因转录具有正调控作用,其机制可能是所形成的G-四链体分别影响SP1对AKT1启动子的结合和miR-193b-3p对AKT1 3’-UTR的识别。同时,RECQL可能通过解旋AKT1启动子和/或其3’-UTR中的G-四链体而介导AKT1基因表达。因此,AKT1所形成的G-四链体可能成为癌症治疗的有效靶点。另外,筛选出的小分子配体石蒜碱能够稳定G-四链体,具有开发为抑制癌症药物的潜能。
王丽娟[3]（2021）在《基于全外显子测序分析高级别浆液性卵巢癌肿瘤异质性》文中进行了进一步梳理目的:利用全外显子测序（WES）研究高级别浆液性卵巢癌肿瘤相关基因突变情况,寻找不同取样位点差异表达的突变基因,对高级别浆液性卵巢癌的肿瘤异质性进行初步分析与探索。方法:本研究依据纳入标准与排除标准选取就诊于兰州大学第一医院的高级别浆液性卵巢癌患者3名,分别于肿瘤组织中心及两端收取新鲜组织标本,测序样本迅速放于液氮罐中冷冻后转入-80℃冰箱保存,切片样本置于10%中性福尔马林保存。提取组织DNA后使用BGI杂交试剂盒对外显子进行捕获,然后在BGISEQ-500平台上进行测序。下机数据质控合格并经过过滤、检测及注释后进行单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失标记（InDel）分析,结果对比NCBI基因数据库,绘制所有样本的SNP、InDel热图,根据基因突变结果最终筛选出不同取样位点差异表达的突变基因,同时选取样本进行免疫组化验证。结果:1.在SNP突变中,以错义突变最多,其中碱基改变形式以GC→AT最常见,分别占比38.9%,39.6%,39.6%;3组样本中分别筛选出23、21、23个SNP位点,对比不同取样位点后样本A、C各有差异突变3个,样本B未发现差异突变。2.在InDel结果中,插入或缺失的发生以1-3bp的片段长度为主;3组样本中分别筛选出13、11、17个InDel位点,对比不同取样位点后样本A有差异突变4个,样本B有差异突变2个,样本C有差异突变8个。3.免疫组化结果中,不同取样位点中蛋白表达具有明显差异（P<0.05）。4.3组样本的SNP和InDel共筛选突变基因12个:FMN2、MAN2B2、ESPNL、SEC16A、MUC6、SIX3、ATP13A5、NOP14、PDLIM2、PPP6C、ITGB3、UNK6。结论:1.卵巢癌是一种异质性疾病,不仅存在肿瘤内异质性,也存在患者间异质性。2.所得的12个突变基因:FMN2、MAN2B2、ESPNL、SEC16A、MUC6、SIX3、ATP13A5、NOP14、PDLIM2、PPP6C、ITGB3、UNK6可作为卵巢癌分子靶向治疗的潜在位点。3.为实现个体化治疗,肿瘤组织需要多点取样以明确不同位点的基因突变情况,进而进行靶向治疗。
谢游龙[4]（2020）在《猪iPSCs中miRNA-mRNA调控网络分析及其关键miRNAs参与多能性调控的机制研究》文中研究说明诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。同胚胎干细胞相比,它不仅具有广泛的细胞来源,还避免了伦理道德和免疫排斥问题,在细胞治疗和组织再生等方面具有广阔的应用前景。同小鼠或者人的iPSCs相比较,目前已报道建系的猪iPSCs还存在很多缺陷,深入研究猪iPSCs的分子调控机制,对猪iPSCs的建系和完善培养条件具有重要的意义。本研究通过分析mRNA-seq和miRNA-seq数据,筛选出调控关键多能基因的miRNAs,并研究其对猪iPSCs的调控作用,为优化猪iPSCs的诱导体系,获得原始态（Na?ve state）猪iPSCs提供新的思路。具体研究内容和结果如下:1.MiRNA和mRNA联合分析我们对三种不同培养条件下产生的猪iPSCs,包括piPS-L,piPS-F和piPS-LF,进行了miRNA测序,得到了165个特异表达的miRNAs。通过预测这些miRNAs的靶向mRNA,并通过GO和KEGG分析,发现部分靶向mRNA与干细胞多能性表达调控相关联。然后,对上述三种细胞的mRNA-seq数据进行分析,得到1416个特异表达的mRNAs。将上述miRNAs靶向mRNA和1416个特异表达的mRNAs进行联合分析,获得了猪iPSCs关键miRNA-mRNA靶点图,其中包括了16个miRNAs和对应靶向关系的13个mRNAs。2.靶向LIN28A基因miRNAs的验证及其在猪iPSCs中的调控作用根据miRNA-mRNA靶点图,我们对多能基因LIN28A展开进一步研究。首先,构建了3’UTR双荧光素酶报告系统,将miR-370,miR-31863分别与LIN28A 3’UTR报告载体共转293T细胞,36h后检测荧光素酶活性。结果显示,只有miR-370可以靶向多能基因LIN28A的3’UTR区。我们研究发现,猪iPSCs在分化过程中,LIN28A的表达降低,而miR-370的表达显着上调。利用构建的miR-370慢病毒表达载体感染猪iPSCs,我们发现miR-370可以抑制内源LIN28A的表达,并导致其他多能基因的表达降低,引起与干细胞分化相关基因的上调,使猪iPSCs的碱性磷酸酶活性和自我更新能力降低。回补LIN28A的实验,可以显着扭转上述miR-370的负调控作用。上述结果表明,miR-370可以靶向LIN28A,从而调控猪iPSCs的多能性状态。3.靶向调控OTX2基因miRNAs的生物信息分析及验证通过聚类分析,我们对不同培养条件获得的猪iPSCs的多能状态相关基因的表达谱进行了比较。结果表明,在测试的三种猪iPSCs中,激发态（Primed state）相关基因OTX2和ZIC3的表达量比原始态（Na?ve state）相关基因NANOG和ESRRB的表达量高5-10倍。我们通过三个miRNA靶基因预测平台,预测到6个可能调控OTX2基因的miRNAs。双荧光素酶实验结果发现,其中两个miRNAs（miR-1343和miR-545）可以特异性的靶向调控OTX2基因的3’UTR区。通过构建miRNA慢病毒表达载体,感染猪iPSCs,进一步证实了这两个miRNAs可以显着抑制OTX2 mRNA表达水平,从而抑制内源OTX2蛋白的表达。4.MiRNA-OTX2对猪iPSCs的调控作用本研究发现,miR-1343和miR-545可以促进猪iPSCs的增殖,提高碱性磷酸酶活性,上调多能基因SOX2,NANOG以及ESRRB的表达,抑制OTX2下游基因FGF5和OCT6的表达。通过EB分化实验,发现miR-1343和miR-545可以促进猪iPSCs向神经外胚层分化。在过表达miRNA的实验组中回补OTX2,可以扭转这两个miRNA的正调控作用。通过启动子双荧光素酶实验发现,OTX2可以抑制SOX2和ESRRB启动子活性。在过表达miR-1343或者miR-545的猪iPSCs中,SOX2和ESRRB的启动子活性可以被显着激活。我们还发现,SOX2可以抑制OTX2的启动子活性。进一步研究发现,SOX2和ESRRB可以促进miR-1343的表达,相反OTX2可以抑制miR-1343的表达,而miR-545的表达并没有明显的被上述转录因子调控。以上结果表明,miR-1343-OTX2调控轴参与调控猪iPSCs的自我更新和分化。
李学浩[5]（2020）在《lncRNA RHPN1-AS1靶向MiR-299-3p/TNFSF12通路参与调控NSCLC耐药的机制研究》文中研究指明背景:肺癌是目前造成死亡率最高的癌症之一,其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的85%。肺癌的发病率在世界上的一些地区已经逐渐达到高峰,但在世界上许多其他地区,特别是中国,肺癌的发病率仍在逐年上升。目前NSCLC的诱因尚不完全清楚,有研究表明吸烟是导致肺癌最重要的因素,但是随着大多数西方国家吸烟率的下降,NSCLC在患者中仍占有主导地位,其诱因可能是环境、情绪、遗传等多方面因素共同作用的结果。依据目前的治疗方法,NSCLC患者并不能完全治愈,多数患者会出现复发或者出现转移。NSCLC的治疗方式包括早期手术、局部晚期肿瘤的同步放化疗、靶向治疗和转移性疾病的姑息性化疗等。肿瘤治疗学的一个重要发现是NSCLC中表皮生长因子磷酸激酶（EGFR TK）结构域的体细胞突变及其与表皮生长因子磷酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）反应的相关性。EGFR基因扩增在东方人群中更为普遍,而与之密切相关的人表皮生长因子受体-2（HER2）基因扩增在东亚患者中更为常见,这也可能对NSCLC的治疗产生影响。抗血管生成药物和EGFR-TKI的引入提高了NSCLC患者的应答率。但是随着治疗时间的延长,患者会对一些药物出现耐药现象,尤其是对EGFR-TKI的耐药。所以探索NSCLC患者的耐药机制迫在眉睫,有利于新的治疗方法提高患者的生活质量。非编码RNA（Lnc RNA）与微小RNA（Micro-RNA）在肺癌的发生、发展及对靶向药物的获得性耐药方面均具有调控作用,因此,我们从LncRNA入手,探究了新型Lnc RNA RHPN1-AS1靶向的Micro-RNA,并进一步深入研究了该LncRNA在NSCLC吉非替尼获得性耐药中所发挥的作用及相关机制。目的:1、探究RHPN1-AS1在对吉非替尼耐药的患者和NSCLC细胞中的表达情况;2、探究RHPN1-AS1调控NSCLC对吉非替尼耐药性的耐药机制方法:1、收集EGFR突变的NSCLC患者肿瘤组织,通过RT-qPCR技术检测耐药组织和敏感组织中RHPN1-AS1的表达水平。2、体外培养人肺腺癌细胞系（PC-9）和人NSCLC细胞系（HCC-827）,两种细胞经RHPN1-AS1敲减和过表达处理,CCK-8实验测定RHPN1-AS1对两种细胞系的吉非替尼响应的影响。3、RHPN1-AS1敲减和过表达处理吉非替尼诱导的PC-9和HCC827细胞,Annexin V/PI染色,FACS分析检测细胞凋亡水平;Transwell结晶紫染色,显微镜下观察RHPN1-AS1对吉非替尼处理的上述两类细胞的侵袭的影响。4、通过建立裸鼠成瘤实验检测过表达RHPN1-AS1后是否可以影响肿瘤在体内的生长。我们使用LV-RHPN1-AS1和LV-NC构建稳定过表达RHPN1-AS1的NSCLC-PC9-GR细胞和对照组细胞,皮下注射入裸鼠,30天后测量肿瘤大小。5、生物信息学预测RHPN1-AS1的作用miRNA,采用免疫共沉淀RNA、实时定量和荧光素报告基因法确证RHPN1-AS1对MiR-299-3p的表达影响以及直接相互作用和位点。并在患者水平验证组织中MiR-299-3p表达水平。6、生物信息学预测MiR-299-3p结合的靶基因mRNA,并模拟其与MiR-299-3p的结合位点,采用实时定量法在组织和细胞水平验证靶基因TNFSF12的表达。7、采用荧光素酶报告基因法验证MiR-299-3p与靶基因TNFSF12的结合以及结合位点;用实时定量PCR和WB法分别在RNA和蛋白水平验证MiR-299-3p对结合靶基因TNFSF12表达的影响。8、采用回补实验分别从分子和细胞水平,验证RHPN1-AS1参与调控的信号通路;并检测了该通路对细胞增殖、凋亡和侵袭功能的影响。结果:1、应用吉非替尼治疗的患者肿瘤组织标本进行了组织中表达水平的检测显示:吉非替尼耐药组中RHPN1-AS1的表达明显低于吉非替尼敏感组,随着RHPN1-AS1的表达增高吉非替尼的耐药性下调,代表吉非替尼的IC50与pcDNARHPN1-AS1量呈负相关。2、用小干扰RNA的转染吉非替尼敏感细胞来抑制RHPN1-AS1的表达,构建RHPN1-AS1低表达细胞系,发现可以提高吉非替尼处理的细胞增殖能力,降低了细胞凋亡的细胞的数量,导致吉非替尼刺激下细胞移动性增加,说明NSCLC对吉非替尼耐药性需要RHPN1-AS1的存在。3、构建RHPN1-AS1过表达细胞系并用实时定量PCR检测了RHPN1-AS1的过表达转染效率,结果显示过表达RHPN1-AS1的耐药NSCLC细胞对吉非替尼的IC50左移,在吉非替尼处理下的细胞凋亡比例增多,侵袭迁移能力下降,说明过表达RHPN1-AS1赋予NSCLC细胞耐药株对吉非替尼的敏感性。4、使用Starbase预测可结合miRNA,并采用了生物素亲和素下拉实验验证了MiR-299-3p对RHPN1-AS1的识别,采用荧光素酶报告基因测定,我们发现只有RHPN1-AS1-WT可以与MiR-299-3p结合。说明MiR-299-3p可以与RHPN1-AS1直接结合。5、使用Targetscan进行靶标预测。预测结果显示TNFSF12可能为MiR-299-3p的靶点,然后采用荧光素酶报告基因验证MiR-299-3p可以与TNFSF12直接结合,并用实时定量PCR和WB法验证Mi R-299-3p可以影响TNFSF12的表达,证实了预测结果的真实性。6、通过转染、CCK8、流式和Transwell实验检测细胞增殖、凋亡和迁移水平,结果显示TNFSF12可以部分逆转细胞对吉非替尼的药物敏感性,说明RHPN1-AS1通过靶向MiR-299-3p/TNFSF12通路调控吉非替尼耐药株的耐药机制。结论:在这项研究中,我们首先采用实时定量PCR对44例吉非替尼敏感和40例吉非替尼耐药的患者肿瘤组织标本进行了组织中表达水平的检测,结果显示在吉非替尼耐药组中RHPN1-AS1的表达明显低于吉非替尼敏感组。为了进一步确认,我们又在PC9细胞系上转染不同量的pcDNA-RHPN1-AS1,结果发现随着RHPN1-AS1的表达增高,吉非替尼的耐药性下调。接下来,转染一个小干扰RNA来抑制RHPN1-AS1的表达,然后检测沉默RHPN1-AS1后两株细胞的耐药性。与对照组相比,下调RHPN1-AS1表达可提高吉非替尼敏感株的耐药性,这些数据表明,NSCLC细胞对吉非替尼耐药需要RHPN1-AS1的存在。我们在吉非替尼耐药的NSCLC细胞中构建RHPN1-AS1过表达细胞系,检测了过表达RHPN1-AS1的耐药株对吉非替尼的耐药性,结果显示过表达RHPN1-AS1赋予NSCLC细胞耐药株对吉非替尼的敏感性。我们使用Starbase v.2.0来预测与RHPN1-AS1直接相互作用的潜在miRNA,发现MiR-299-3p和MiR-7-5p是最可能的靶点。为了进一步验证MiR-299-3p与RHPN1-AS1的结合,我们突变RHPN1-as1的序列,并采用双荧光素酶报告基因测定,发现只有RHPN1-AS1-WT可以与MiR-299-3p结合。采用qRT-PCR检测NSCLC患者中MiR-299-3p的表达,与敏感的吉非替尼NSCLC患者相比,显示对吉非替尼耐药的NSCLC患者中MiR-299-3p表达上调。总之,从我们的研究结果中证实,RHPN1-AS1对MiR-299-3p表达有抑制作用,并直接作为海绵作用于MiR-299-3p。我们应用实时定量PCR检测了TNFSF12在NSCLC组织和细胞系中的表达。结果表明,在吉非替尼耐药患者组织中TNFSF12的表达较吉非替尼敏感的患者中明显降低。然后,进行了荧光素酶报告基因检测,提示TNFSF12是MiR-299-3p的直接靶点。后续实验证明:RHPN1-AS1通过靶向Mi R-299-3p/TNFSF12通路调控吉非替尼耐药株的耐药机制。
崔高峰[6]（2019）在《去氢骆驼蓬碱调控PI3K/Akt通路和溶酶体Rab7/RILP诱导Sf9细胞自噬》文中研究表明植物源农药被认为是化学农药的重要补充,在有害生物综合治理中可发挥重要作用。去氢骆驼蓬碱（Harmine）属于β-咔啉生物碱,具有多种生物活性,可用于医药和植物保护等领域。Harmine可通过拒食、生长发育调节等方式有效防控多种昆虫,但其杀虫及发育调节机制尚不明确。本文从harmine对果蝇Drosophila melanogaster生长发育抑制作用和对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda离体Sf9细胞的增殖抑制作用入手,逐步探索harmine诱导昆虫细胞自噬过程中的主要调控通路,主要结果如下:（1）Harmine对果蝇生长发育的抑制作用呈剂量依赖效应,随着harmine浓度增加（0-200 mg/L）,果蝇蛹的质量、长度、化蛹高度、羽化率、雌雄比等都受到显着抑制。200 mg/L harmine处理后果蝇蛹期生长发育信号网络中的Wnt、Notch、TGF-β、Hippo、Hedgehog等通路上基因的表达呈全面抑制状态,并且各个通路在雌雄差异、胁迫应激中的表现不尽相同。其中,PI3K/Akt通路也受到显着抑制,提示harmine可能通过诱导自噬参与果蝇发育抑制。（2）以harmine为代表的5种β-咔啉生物碱均能抑制Sf9细胞的增殖,在0-0.2 m M之间,抑制作用呈现时间和剂量依赖效应。抑制效果从强到弱依次为harmine>harmol>harmaline>harmalol>tryptoline。其中,不饱和的β-咔啉生物碱harmine和harmol具有较强的生物活性,能损害细胞形态,引起细胞空泡化、肿胀等,随剂量和时间的增加,出现凋亡小体等现象。Harmine和harmol具有很强的自噬诱导能力,能够显着增强Sf9细胞自噬荧光染料Monodansylcadaverine（MDC）和溶酶体染料Lyso Tracker Red的荧光强度,促进Atg8等自噬相关基因和蛋白的表达。（3）不同浓度harmine处理Sf9细胞24 h后,从0.05 m M开始,MDC和Lyso Tracker Red染色荧光增强,自噬相关基因和蛋白表达量逐渐增多,0.2 m M处理后细胞开始出现凋亡现象。选取0.05m M为处理剂量,研究harmine诱导Sf9细胞自噬中转录水平和蛋白水平的变化。Harmine处理Sf9细胞后,转录组中2463个基因上调,689个基因下调,蛋白组中36个蛋白上调,77个蛋白下调。这些差异基因主要富集在内质网、胞外基质和代谢通路等方面,参与细胞的跨膜转运、免疫应激、代谢调节、信号转导、自噬等生命过程,提示了harmine对Sf9细胞的作用方式。（4）PI3K/Akt通路作为重要的自噬调控通路,选用3种特异性通路抑制剂,pictilisib、MK-2206 2HCl和rapamycin和两种通路激活剂1,3-dicaffeoylquinic acid和MHY1485,研究harmine诱导Sf9细胞自噬过程中PI3K/Akt通路的作用。结果表明,通路抑制剂能够显着增强harmine诱导的自噬现象,包括细胞形态和荧光染色等。而2种通路激活剂能缓解harmine产生的细胞增殖抑制作用及荧光染色现象。从而证实PI3K/Akt通路确实参与了harmine诱导的细胞自噬。（5）线粒体特异性染料、线粒体膜电位指示剂及ATPase酶活性检测等发现,线粒体在harmine诱导的自噬中作用相对微弱。重点研究了大自噬中变化比较剧烈的溶酶体。Rab7/RILP在自噬体与溶酶体识别与融合中发挥重要作用,生物信息学分析发现,Rab7在昆虫和哺乳动物中非常保守,而RILP则差异较大,提示可能存在不同作用方式。RNAi干扰和过表达实验,证实Rab7和RILP参与了harmine诱导的昆虫细胞自噬。酵母双杂交和GST-pull down实验发现,RILP需要去掉末端的GC-rich区才能与Rab7互作;昆虫中RILP的N端参与两者相互作用;部分氨基酸的点突变可以影响两者的相互作用,昆虫自噬中Rab7-RILP的互作方式与哺乳动物中存在显着差异。本文通过研究新型杀虫活性成分harmine诱导昆虫细胞自噬和抑制果蝇生长发育的潜在机制,为深入研究harmine的作用方式、相关成分的改造和应用提供了一定理论基础,丰富了昆虫生长发育调节机制及昆虫自噬通路转导研究内容。
成佳楠[7]（2019）在《放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究》文中研究指明第一部分:放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究背景:近年来的研究发现,肿瘤免疫治疗的疗效在很大程度上取决于肿瘤内CD8+T细胞的浸润程度和肿瘤微环境（TME）的状态。放疗可促进肿瘤免疫微环境的炎症反应从而增强CD8+T细胞介导的抗肿瘤反应,因此其可能作为免疫治疗的重要的辅助手段。已有大量证据证实放疗可诱导肿瘤局部I型干扰素介导的免疫微环境改变,然而其诱导的全身性的免疫调节作用仍有待探索。因此,进一步深入阐明放疗对肿瘤免疫微环境的影响,对探索放疗与免疫治疗的联合具有重要意义。在多种动物模型中,我们观察到放疗（RT）通过重塑肿瘤微环境使其利于嗜酸性粒细胞招募,而这种招募作用与CD8+T细胞浸润增强密切相关。当用抗体清除嗜酸性粒细胞后放疗诱导的CD8+T细胞浸润减少,而对肿瘤的控制也被明显削弱,说明放疗诱导的嗜酸性粒细胞增多对于T细胞介导的抗肿瘤作用不可或缺。在对接受过放疗的肿瘤患者进行回顾性分析时我们也发现了嗜酸性粒细胞和CD8+T细胞之间的相关性。利用动物模型我们证实放疗分别增强了回输的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞的瘤内浸润。这一现象与临床实践不谋而合,在一例淋巴瘤患者接受CD19CAR-T细胞治疗的过程中我们发现放疗促进了CAR-T细胞浸润,并缩短了治疗起效时间,延长了患者受益持续时间。综上所述,基于我们的动物和临床发现,放疗引起的嗜酸性粒细胞增多可作为参考预测患者的治疗疗效,甚至提供增强T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗的新策略。方法:1.放疗促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。（1）建立C57BL/6小鼠的黑色素瘤荷瘤模型（B16-F10）,并对肿瘤进行局部放疗（20Gy）,放疗后第7天取肿瘤组织进行RNA-Seq检测及GSEA分析。检测内容包括:炎症信号,粒细胞活性,粒细胞免疫信号。（2）取放疗后第7天的肿瘤组织,通过流式细胞术检测肿瘤内免疫细胞亚群变化。检测内容包括:CD45阳性淋巴细胞,DC细胞,NK细胞,嗜酸性粒细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞,单核细胞,中性粒细胞,Ly6Chi细胞。（3）建立小鼠B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型,一侧肿瘤接受局部20Gy放疗,另一侧不做处理。之后将CFSE标记的活化的嗜酸性粒细胞回输到受辐射小鼠体内,48小时后取肿瘤组织,进行流式细胞术检测双侧肿瘤中CFSE阳性嗜酸性粒细胞。（4）利用Transwell方法检测经放射的肿瘤组织对嗜酸性粒细胞的趋化作用。（5）PCR检测经放射肿瘤组织中与嗜酸性粒细胞趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。2.细胞毒性T淋巴细胞的招募与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。（1）在B16-F10黑色素瘤动物模型中,对肿瘤进行局部放疗（20Gy）或不处理,PCR检测两组肿瘤组织中与T细胞趋化和功能相关的因子的mRNA表达水平。流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8+T细胞的相关性。（2）建立4T1乳腺癌动物模型,流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8+T细胞的比例。PCR检测经放射肿瘤组织中分别与T细胞的趋化和功能,嗜酸性粒细胞的趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。（3）建立MC38结肠癌动物模型,流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8+T细胞的比例。PCR检测经放射肿瘤组织中分别与T细胞的趋化和功能,嗜酸性粒细胞的趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。3.嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。（1）统计嗜酸性淋巴肉芽肿患者外周血中嗜酸性粒细胞数量,免疫组化检测手术标本中嗜酸性粒细胞的数量,分析外周血与组织浸润嗜酸性粒细胞数量的一致性。（2）收集整理既往接受过放疗的非小细胞肺癌患者（NSCLC）234例,统计患者放疗前后外周血中嗜酸性粒细胞的数量变化,并将外周血中嗜酸性粒细胞的升高与患者的无进展生存期（PFS）作相关分析。（3）收集整理既往接受过放疗的鼻咽癌患者（NPC）249例。统计患者放疗前后外周血中嗜酸性粒细胞的数量变化,并将外周血中嗜酸性粒细胞的升高与患者的无进展生存期（PFS）作分析。4.嗜酸性粒细胞在CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。（1）采用anti-Siglec-F抗体清除荷瘤小鼠体内的嗜酸性粒细胞,流式细胞术检测清除效果。（2）流式细胞术检测嗜酸性粒细胞清除小鼠体内的CD8+T细胞及效应性CD8+T细胞的比例,并与嗜酸性粒细胞做相关性分析。（3）PCR检测嗜酸性粒细胞清除小鼠体内小鼠肿瘤组织IFN-gamma相关的mRNA信号。（4）嗜酸性粒细胞清除后测量小鼠的肿瘤体积变化情况。5.嗜酸性粒细胞浸润可促进过继免疫治疗的疗效。（1）利用B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型,通过尾静脉回输Pmel活化的CD8+T细胞,流式细胞术检测双侧肿瘤中Pmel阳性CD8+T浸润情况。（2）建立NPG小鼠双侧荷瘤模型,尾静脉回输CAR-T细胞,流式细胞术检测双侧肿瘤中CAR-T浸润情况。6.放疗可使接受CAR-T治疗的患者受益更多。（1）监测入组临床试验的患者疾病进展。（2）整理患者血常规信息。（3）肿瘤局部穿刺样本检测。结果:1.放疗可促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。（1）RNA-Seq结果提示,放疗后肿瘤组织内活性氧通路、I型干扰素信号、γ干扰素信号及炎症反应信号通路明显增强。其中,关于粒细胞趋化、迁移及活化的基因富集程度明显升高。（2）放疗后肿瘤浸润多种免疫细胞比例增多,其中CD8+T细胞及嗜酸性粒细胞增加明显。（3）双侧荷瘤模型中,与未处理侧肿瘤相比,经放射侧肿瘤内CFSE阳性嗜酸性粒细胞浸润明显增加。（4）体外实验发现,与对照组相比,放射处理的肿瘤组织招募嗜酸性粒细胞的能力更强。（5）PCR检测发现放疗后嗜酸性粒细胞趋化和生存相关的因子表达明显升高。2.嗜酸性粒细胞的浸润与细胞毒性T淋巴细胞的招募密切相关。（1）PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中与T细胞趋化和功能相关分子的mRNA表达明显增高。流式细胞术检测发现小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞的比例与CD8+T细胞及效应CD8+T细胞的比例均高度相关。（2）在4T1乳腺癌动物模型中,流式细胞术检测也发现放疗后肿瘤组织内浸润的CD45阳性免疫细胞,嗜酸性粒细胞,CD8+T细胞的比例都明显升高,且嗜酸性粒细胞的比例与CD8+T细胞的比例高度相关。PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中T细胞及嗜酸性粒细胞的趋化和功能相关分子的表达均明显升高。（3）在MC38结肠癌动物模型中,流式细胞术检测也同样发现放疗后肿瘤组织内浸润的CD45阳性免疫细胞,嗜酸性粒细胞,CD8+T细胞的比例都明显升高,且嗜酸性粒细胞的比例与CD8+T细胞的比例高度相关。PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中T细胞及嗜酸性粒细胞的趋化和功能相关分子的表达均明显升高。3.嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。（1）非小细胞肺癌患者中,外周血中的嗜酸性粒细胞数量与肺癌组织免疫组化染色计数高度相关,提示外周血中嗜酸性粒细胞的数量可用来预测肿瘤组织中嗜酸性粒细胞的浸润程度。（2）非小细胞肺癌患者中,放疗后外周血中嗜酸性粒细胞的数量明显升高,且升高倍数为1.67倍或者2倍以上的患者无进展生存期更长。（3）在鼻咽癌患者中,放疗后外周血中嗜酸性粒细胞的数量也明显升高,且升高倍数为2倍或者2.20倍以上的患者无进展生存期更长。4.嗜酸性粒细胞在CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。（1）流式细胞术检测证明anti-Siglec-F抗体有效的清除了小鼠体内的嗜酸性粒细胞。（2）嗜酸性粒细胞清除后,肿瘤浸润CD8+T细胞及效应性CD8+T细胞的比例都明显降低,且与嗜酸性粒细胞的比例高度相关。（3）PCR检测发现嗜酸性粒细胞清除后,肿瘤组织IFN-gamma相关的mRNA表达明显降低。（4）嗜酸性粒细胞清除削弱了放疗对小鼠肿瘤生长的控制。5.嗜酸性粒细胞可促进过继免疫治疗的疗效。（1）B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型中,与对照侧相比,放疗侧肿瘤内浸润的Pmel CD8+T细胞的比例和数量明显增多。（2）Raji淋巴瘤NPG小鼠双侧荷瘤模型中,与对照侧相比,放疗侧肿瘤内浸润的CAR-T细胞明显增多,且CAR-T细胞与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。6.放疗可使接受CAR-T治疗的患者受益更多。（1）一例恶性淋巴瘤患者中,放疗联合CAR-T回输治疗延缓肿瘤复发。（2）放疗后该患者外周血中嗜酸性粒细胞的数量明显升高。（3）PCR检测肿瘤穿刺样本发现,放疗侧肿瘤内CAR-T细胞浸润明显高于非放疗侧。结论:放疗促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。细胞毒性T淋巴细胞的招募与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。嗜酸性粒细胞在CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。放疗可促进过继免疫治疗的疗效。放疗可增强恶性淋巴瘤患者CAR-T细胞免疫治疗的疗效。第二部分:肿瘤局部的突变多样性引起了免疫的异质性背景:肿瘤是一种遗传性疾病,肿瘤细胞的生长是由激活致癌因子的突变引发的。这一过程也涉及到遗传性或非遗传性促癌基因的激活或抑癌基因的失活。在多种癌症中,肿瘤的发生伴随着突变的积累,突变的积累可以通过增加肿瘤细胞的遗传多样性程度,加速肿瘤细胞的进化适应性,从而为肿瘤细胞群提供选择性优势。然而,这种遗传多样性是有代价的:肿瘤细胞相较于正常细胞分化程度越高,越容易被免疫系统识别为异体细胞。虽然长期以来人们一直认同这种可能性的存在,但直到最近几年才证实肿瘤的总突变负荷（TMB）有助于癌症的免疫识别,而且它可能在一定程度上决定个体对抗肿瘤免疫治疗的反应。结合全外显子组测序、转录组分析和T细胞库分析,我们选取了15例非小细胞肺癌（NSCLC）患者手术切除肿块的多位点组织进行空间特征分析。结果表明肿瘤组织的免疫微环境具有高度的空间异质性,瘤内区域差异与个体间差异一样大。虽然局部总突变量与局部T细胞克隆扩增有关,但局部抗肿瘤细胞毒性与新抗原丰度没有直接关系。综上所述,这些发现提醒我们,免疫学特征不应该仅通过TMB或单位点活检的微环境分析来预测。方法:我们招募了15名新诊断的非小细胞肺癌患者,对于每个从原发肿瘤肿块中采集的多个活检样本,我们进行了多种基因组和免疫原性的基因组分析,包括全外显子组测序（WES）、转录组分析（RNA-seq）和T细胞库测序。为了进一步提高肿瘤免疫微环境评估的准确性,我们开发了一种机器学习方法,将多维免疫相关变量集成起来进行数据挖掘。通过使用一种随机森林算法,输入278个变量将肿瘤位点的免疫微环境分类为“热”肿瘤区域和“冷”肿瘤区域。结果:1.突变负荷与T细胞扩增相关2.突变负荷与细胞毒性不相关3.肿瘤微环境存在空间异质性4.突变异质性与免疫异质性相关结论:瘤内区域间的免疫微环境存在高度的空间异质性,需要综合全面地评价TME免疫表型。
徐通[8]（2019）在《棕榈酰转移酶DHHC21调控急性髓系白血病分化及其机制研究》文中指出研究目的:细胞内基因表达与信号网络的调控失常经常诱发肿瘤的恶性表型,如无限增殖、凋亡抵抗、化疗耐药和转移复发等。在细胞内,存在数百种不同的翻译后修饰可以调控这些信号网络中关键蛋白的定位、稳定性、相互作用与转录,从而影响肿瘤进程。脂质翻译后修饰可以增强底物蛋白的脂溶性,使其对质膜、内质网和高尔基体有更好的亲和性。S型棕榈酰修饰催化棕榈酸连接到底物蛋白半胱氨酸残基上,并且这种结合具有可逆性。迄今为止,研究发现大量肿瘤关键调控蛋白存在S型棕榈酰修饰。因此,介导蛋白S型棕榈酰修饰的棕榈酰转移酶DHHC蛋白家族受到广泛关注。DHHC蛋白与肿瘤和神经系统疾病等多种疾病存在密切联系,提示我们DHHC蛋白具有重要生物学功能。许多研究发现DHHC蛋白的频繁缺失与异常扩增,在不同的肿瘤中发挥相反的作用。急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia,AML）是一种血液系统肿瘤,在临床和生物学上具有异质性。近几年,AML治疗的相关研究从快速发展期逐渐进入瓶颈期。临床上AML的化疗药物主要为阿糖胞苷、蒽环类抗生素和全反式维甲酸类药物。标准化疗后患者长期无病生存率仅30～40%且预后差,经常存在化疗耐药和复发的情况。因此,需要寻找AML治疗的新型潜在靶标和干预手段。而有研究发现DHHC9可以影响N-Ras介导的T细胞急性淋巴细胞白血病以及DHHC14促进急性双表型白血病的发生发展,提示DHHC蛋白可能在白血病中有重要生物学功能。前期研究中,我们发现抑制DHHC活性可诱导AML细胞发生分化。因此,本研究将在此基础上进一步明确调控急性髓系白血病细胞分化的关键DHHC蛋白,并探讨其调控AML分化的内在机制,以期为临床AML治疗提供全新分子靶标和潜在干预策略。研究方法:选定HL60和NB4（AML细胞株）为研究对象。采用NBT还原实验和RG染色实验检测棕榈酰转移酶DHHC活性抑制剂2-Bromopalmitate（2BP）对AML细胞株的分化诱导作用;采用Oncomine数据库考察不同DHHCs在各种肿瘤中的表达情况;采用Oncomine数据库比较正常骨髓细胞和AML细胞的DHHC3和DHHC21的表达情况;采用Quantitative-Real-time PCR确证shDHHCs的沉默效率;采用流式细胞术检测沉默DHHCs对分化标记物CDllb表达的影响;采用NBT还原实验和RG染色实验检测沉默DHHCs对AML细胞的分化作用;采用细胞计数检测沉默DHHC21对细胞增殖能力的影响;采用流式细胞术检测沉默DHHC21后分化标记物CDllb和CD14的时效变化;采用NBT还原实验和RG染色实验检测沉默DHHC21对AML细胞的分化作用:采用Quantitative-Real-time PCR检测沉默DHHC21对STAT1、PU.1及CEBPβ的mRNA水平影响;采用NBT还原实验检测不同的信号抑制剂R041-5253（RARα拮抗剂）、LY-294002（PI3K抑制剂）、PD-98059（MEK 抑制剂）、SB-203580（P38 抑制剂）与 SP-600125（JNK 抑制剂）对 shDHHC21诱导分化的影响;采用基因芯片建立沉默DHHC21的基因表达谱;采用Metabase对差异基因进行功能聚类分析;采用Quantitative-Real-time PCR确证沉默DHHC21后差异基因的变化;采用NBT还原实验检测沉默MAFB、IRF9或PLSCR1对shDHHC21诱导分化的影响。研究结果:①抑制不同DHHC蛋白对AML细胞分化的影响:不同浓度的棕榈酰转移酶活性抑制剂2BP作用后,AML细胞的NBT还原能力增强以及细胞核形态向分化转变;以数据库比较白血病中DHHCs的表达,发现DHHC3与DHHC21的表达最高,DHHC8、DHHC9、DHHC14次之,而其他DHHC表达相对较低;分析数据库发现DHHC21在AML细胞中的表达比正常骨髓细胞高,且具有显着性差异,而DHHC3在两种细胞间表达没有差异;沉默DHHC3、DHHC7、DHHC21或DHHC23后,唯有沉默DHHC21可以特异地提高CDllb的阳性比例、促进NBT还原能力以及介导细胞核形态变化。②确证shDHHC21可诱导AML细胞分化:沉默DHHC21可以提高AML细胞分化标记物CDllb和CD14的表达,且具有一定的时效关系;沉默DHHC21可以增强AML细胞对NBT的还原能力,并促使细胞核质比明显下降、核形态向分化形态转变;沉默DHHC21可以提高STAT1、PU.1及CEBPββ的mRNA水平。③经典分化信号在shDHHC21诱导AML细胞分化中的作用:以LY-294002抑制PI3K活性、PD-98059抑制MEK活性或SP-600125抑制JNK活性可以逆转shDHHC21诱导的AML细胞分化;而以SB-203580抑制P38活性不能逆转shDHHC21诱导的AML细胞分化;以R041-5253抑制RARα活性不能逆转shDHHC21诱导的AML细胞分化。④探索shDHHC21调控AML细胞分化的分子机制:采用基因芯片成功建立沉默DHHC21后AML细胞内的基因表达谱,发现在第1、2和3天多个基因呈现出显着变化（分别有570、137和169个基因上调,118、44和50个基因下调）,而其中同时上调的基因有3 1个,共同下调的基因有5个;Quantitative-Real-time PCR结果显示,沉默DHHC21后,差异基因（AGPAT9、CLEC7A、MAFB、PARP9、IFIT2、IRF9、IFIT5、FPR1、IF16、PLSCRl）的 mRNA 水平的确显着上调;shMAFB、shIRF9或shPLSCRl对沉默DHHC21诱导的AML细胞分化没有明显影响。研究结论:本研究发现通过棕榈酰转移酶活性抑制剂2BP可以诱导AML细胞发生分化。在寻找此效应的关键DHHCs时,发现相较于其他DHHC亚型蛋白,沉默DHHC21可以特异地诱导AML细胞分化,较好地解释了 DHHC21在临床AML患者中异常表达的情况。且我们明确了沉默DHHC21诱导AML细胞的分化方向——单核/巨噬分化,并且依赖其棕榈酰转移酶活性。而进一步深入研究发现,shDHHC21通过调控分化相关转录因子以及PI3K、MEK、JNK等单核/巨噬细胞分化相关信号网络进而诱导AML细胞分化。此外我们还发现shDHHC21诱导的AML分化不依赖与维甲酸受体RARα。本研究不仅发现DHHC21调控AML细胞分化的新生物学功能及其机制,而且为AML的临床治疗提供了潜在的分化新靶标。
刘海霞[9]（2017）在《KLF4抑制宫颈癌放疗敏感性及其分子机制研究》文中研究表明研究目的宫颈癌是妇科三大恶性肿瘤之一,最新统计预测:在美国一年新发的宫颈癌约有12360例。宫颈癌的治疗主要包括手术、放疗、化疗以及综合治疗等。放疗是宫颈癌治疗的重要手段之一,但放疗抵抗成为限制疗效的主要障碍。放疗抵抗的因素很多:凋亡、环氧合酶（cyclooxygenases,COXs）、血管新生、低氧以及温度作用等均可影响放疗效果。Kruppel样因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）是一转录因子,在人类组织中广泛表达,在生长发育、突变及维持正常组织稳态等生理活动中发挥着重要作用。研究发现KLF4在放疗损伤中表现出抗凋亡作用,通过协助DNA修复、降低细胞死亡、增加更新能力或三者共同作用等辅助细胞生存。体内研究发现KLF4在调节BMI1+小肠干细胞内稳态和放疗损伤后再生能力方面起着重要作用。目前有研究表明,放疗后KLF4可导致细胞周期捕获、抑制BAX表达,最终降低细胞凋亡能力;对小鼠放疗后KLF4也表现出抗凋亡作用。再者,我们课题申请前期预实验发现在HeLa细胞中KLF4表达与放疗敏感性相关。于是我们推测KLF4与宫颈癌的放疗敏感性可能相关,如果对调节KLF4表达水平,是否能对宫颈癌细胞的放疗敏感性产生影响,其分子机制如何?为了验证这一假设,我们将从临床资料回顾性研究、分子、细胞、以及动物几个层面进行研究讨论,这将为KLF4参与放疗敏感性的机制研究奠定基础,为提高临床放疗效果提供潜在的药物靶点。研究方法1.在组织层面,采用免疫组织化学技术检测KLF4表达,结合病例资料进行相关性统计分析。2.在分子层面,使用免疫荧光、qPCR和western-blot检测相关分子表达,应用RNAi技术和过表达技术构建慢病毒载体,人源表达谱芯片检测过表达KLF4后调节的下游基因,双荧光素酶报告基因检测启动子转录活性。3.在细胞层面,细胞流式术测细胞周期和凋亡,平板克隆测放疗敏感性。4.在动物层面,建立宫颈癌裸鼠皮下荷瘤模型,根据成瘤模型生长进一步观察KLF4在宫颈癌放疗中的作用,HE染色观察组织形态,免疫组织化学技术检测增殖、凋亡相关蛋白表达水平。研究结果1.放疗敏感性与FIGO分期、肿瘤直径大小、以及肿瘤分化程度相关;KLF4表达水平与FIGO分期以及肿瘤分化程度相关;KLF4表达水平与放疗敏感性相关,在放疗耐受组中表达高于敏感组。耐受组中KLF4的高表达与放疗无反应、放疗后原位复发、远处转移相关。KLF4高表达组总生存期和肿瘤无进展生存期显着低于低表达组。单/多因素回归分析提示:KLF4表达水平、FIGO分期、肿瘤直径大小、以及肿瘤分化程度是影响无瘤生存期和总生存时间的高风险因素。2.4株宫颈癌细胞中KLF4表达水平,其中以HeLa表达水平最高,C33A表达水平最低;比较HeLa和C33A的放疗敏感性,C33A放疗敏感性高于HeLa;成功构建KLF4 RNAi和过表达慢病毒;过表达KLF4降低宫颈癌细胞放疗敏感性,下调KLF4增强宫颈癌放疗敏感性。3.成功建立宫颈癌裸鼠皮下荷瘤模型,KLF4过表达增加宫颈癌瘤体组织的放疗抵抗性。下调KLF4增强宫颈癌瘤体组织的放疗敏感性。4.过表达KLF4上调IGF2基因;过表达KLF4增强IGF2启动子转录活性;过表达KLF4可激活IGF2作用于PI3K-AKT通路从而参与放疗抵抗作用。结论综上所述,高表达KLF4抑制宫颈癌放疗敏感性,干预KLF4表达水平可影响宫颈癌放疗敏感性,KLF4可通过提高IGF2水平,激活PI3K-AKT通路,从而参与宫颈癌放疗抵抗作用。实验为KLF4参与放疗敏感性的机制研究奠定基础,为提高临床放疗效果提供潜在的药物靶点。
李洁[10]（2017）在《LAMP3介导上皮间质转化在绒癌侵袭迁移中的作用及机制研究》文中指出由于有效治疗措施如化疗的出现及人绒毛膜促性腺激素作为肿瘤标记物的广泛应用,妊娠滋养细胞肿瘤（Gestational trophoblastic neoplasia,GTN）成为有可能仅依靠化疗治愈的第一个妇科实体瘤,也是人类最早得以治愈的实体瘤之一。然而,仍然会有患者因为出现化疗耐药和多发转移而导致疾病进展。其中,转移性滋养细胞肿瘤主要经血行播散,转移发生早而且广泛,可同时出现原发灶和转移灶,而且很多患者原发灶消失,仅表现为转移灶症状,使疾病的诊断和治疗都变得更加困难。近年来学术界普遍认为,绒癌转移是多基因、多信号通路共同作用的结果,但具体机制尚不明确。因此,探讨绒癌侵袭转移的发生机制,寻找阻断或逆转绒癌侵袭的新靶点,对改善绒癌患者的预后具有重要的临床意义。溶酶体相关膜蛋白 3（1ysosomal associated membrane protein3,LAMP3）是一种高度糖基化的完整跨膜蛋白,主要位于细胞内的溶酶体膜上,其仅仅在少数几种细胞或者某些细胞的特定分化阶段表达。但是最近相关的体内体外试验均发现,LAMP3可能在肿瘤的侵袭转移中发挥着重要的作用,与肿瘤的预后不良密切相关。亦有研究发现LAMP3是一种新的低氧调节基因,参与低氧诱导的肿瘤的转移过程。文献报道低氧也可以诱导绒癌细胞发生EMT。LAMP3作为新的低氧调节基因是否在绒癌细胞的EMT中发挥作用需要进一步的研究。首先,本研究通过RT-PCR和免疫印迹法发现绒癌细胞JEG-3中LAMP3的mRNA和蛋白表达水平明显低于HTR-8/SVneo（P<0.05）,而HTR-8/SVneo被公认为具有更强的侵袭能力,提示LAMP3的表达水平与细胞侵袭能力呈正相关。同时,通过CCK-8、RT-PCR、免疫印迹法和体外侵袭迁移实验如Transwell、划痕实验等研究发现低氧诱导后绒癌细胞JEG-3中LAMP3的表达增加,细胞侵袭迁移能力增强。研究提示LAMP3的表达可能和JEG-3细胞的侵袭迁移能力呈正相关。其次,通过质粒转染和慢病毒转染技术分别构建过表达和敲减LAMP3的JEG-3细胞,并通过体外侵袭迁移实验如Transwell、划痕实验等检测不同细胞的侵袭迁移能力、并在过表达LAMP3后检测细胞对化疗药物的敏感性,另外通过RT-PCR和免疫印迹法检测不同细胞的EMT相关基因的表达情况。结果显示,过表达LAMP3可以通过在绒癌细胞JEG-3中介导EMT的激活促进其侵袭、迁移、耐药等表型;而对LAMP3敲减后,则会诱导相反的MET过程,使JEG-3细胞的侵袭迁移表型减弱。研究结果表明,LAMP3可以通过诱导EMT促进绒癌细胞JEG-3的侵袭迁移。最后,通过免疫印迹法分别对过表达和敲减LAMP3后以及分别应用小分子抑制剂XAV939和重组人Wnt-3a蛋白后的JEG-3细胞进行β-catenin和Wnt通路的相关靶基因蛋白表达的测定。结果表明,LAMP3的表达通过影响JEG-3细胞中Wnt/β-catenin通路的激活参与了对EMT的调控,这种调控作用可能是通过对EMT转录因子Twist和Snail的调节来实现的,同时也涉及MMP2及MMP9相关表达的改变。研究提示,Wnt信号通路参与了 LAMP3对JEG-3细胞EMT的调控。研究结果表明,LAMP3的表达可能和JEG-3细胞的侵袭迁移能力呈正相关,LAMP3可以通过诱导EMT促进绒癌细胞JEG-3的侵袭迁移,而Wnt信号通路参与了 LAMP3对JEG-3细胞EMT的调控;针对Wnt通路相关靶点设计的药物可能会在转移性绒癌的治疗中发挥重要作用。
二、不同表型的人宫颈癌细胞亚克隆株的基因表达谱（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同表型的人宫颈癌细胞亚克隆株的基因表达谱（论文提纲范文）
（1）基于单细胞转录组测序技术对宫颈恶性肿瘤异质性及相关基因的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 综述 |
| 1.2.1 单细胞转录组测序 |
| 1.2.2 单细胞转录组测序在肿瘤异质性中的研究 |
| 1.2.3 宫颈恶性肿瘤异质性的研究 |
| 1.2.4 小结 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 试剂与器材 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要实验器材 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 样本的采集与保存 |
| 2.4 数据库信息 |
| 2.5 数据分析软件 |
| 2.6 方法 |
| 2.6.1 新鲜单细胞悬液的制备 |
| 2.6.2 实验建库测序 |
| 2.6.3 生物信息分析流程 |
| 2.6.4 实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)实验 |
| 2.7 实验结果分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 宫颈癌组织样本解离结果 |
| 3.2 宫颈癌单细胞转录组测序结果 |
| 3.2.1 基因定量质控 |
| 3.2.2 定量后质控 |
| 3.2.3 降维与聚类分析 |
| 3.2.4 Maker基因鉴定 |
| 3.2.5 细胞类型鉴定 |
| 3.2.6 差异表达基因筛选 |
| 3.2.7 差异基因富集分析 |
| 3.2.8 宫颈癌肿瘤微环境中的免疫景观 |
| 3.2.9 宫颈癌肿瘤细胞的亚群分析 |
| 3.3 RT-qPCR实验验证结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 宫颈癌肿瘤微环境中的细胞类型和细胞类型间差异基因 |
| 4.2 宫颈癌的免疫微环境 |
| 4.3 成纤维细胞对宫颈癌微环境的影响 |
| 4.4 宫颈癌上皮肿瘤细胞的分型 |
| 4.5 小结和展望 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及学期间发表成果 |
| 致谢 |
（2）人的AKT1启动子及其mRNA的3’-UTR区域中G-四链体结构的鉴定和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 AKT的研究概述 |
| 1.1.1 AKT的激活和下游效应因子 |
| 1.1.2 经典的PI3K信号通路 |
| 1.1.3 AKT相关的其他通路 |
| 1.2 AKT1在癌症中的作用 |
| 1.2.1 AKT1是一种原癌基因 |
| 1.2.2 AKT的抑制剂 |
| 1.2.3 AKT1在肿瘤特征中的作用 |
| 1.3 G-四链体的结构特征以及生物学功能 |
| 1.3.1 G-四链体的结构特征 |
| 1.3.2 G-四链体的生物学功能 |
| 1.4 G-四链体结构在肿瘤中的研究 |
| 1.5 G-四链体结构小分子配体 |
| 1.6 G-四链体结构结合蛋白 |
| 1.7 本课题的目的与意义 |
| 2 生信分析AKT1在泛癌中的表达水平及其临床预后意义 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 生物信息预测方法 |
| 2.2.1 Oncomine数据挖掘方法 |
| 2.2.2 UALCAN-TCGA数据挖掘方法 |
| 2.2.3 cBioportal数据挖掘方法 |
| 2.2.4 Kaplan-Meier Plotter数据挖掘方法 |
| 2.2.5 LinkedOmics数据挖掘方法 |
| 2.2.6 TIMER数据挖掘方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 AKT1在多种癌症及其对照正常组织中的差异表达 |
| 2.3.2 AKT1的表达水平在多种癌症中的预后价值分析 |
| 2.3.3 AKT1分别与AKT2及AKT3在多种癌症中的相关性分析 |
| 2.3.4 AKT1基因在多种肿瘤中与免疫浸润的关系 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 AKT1启动子区域G-四链体结构的鉴定及功能的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 细胞系及载体 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 试剂的配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 生物信息学分析 |
| 3.3.2 细胞培养和细胞转染 |
| 3.3.3 慢病毒包装及侵染 |
| 3.3.4 基因组DNA提取及AKT1启动子区的扩增 |
| 3.3.5 载体构建 |
| 3.3.6 RNA提取与逆转录 |
| 3.3.7 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 3.3.8 圆二色性(CD)光谱 |
| 3.3.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) |
| 3.3.10 DNA银染 |
| 3.3.11 硫酸二甲酯足迹保护实验(DMS Footprinting) |
| 3.3.12 凝胶迁移实验 |
| 3.3.13 免疫荧光检测G-四链体结构 |
| 3.3.14 PCR阻滞试验 |
| 3.3.15 染色质免疫共沉淀(Chip) |
| 3.3.16 荧光素酶(Gluc)报告实验 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 AKT1基因启动子序列的生物信息学分析 |
| 3.4.2 AKT1启动子富含G区域形成稳定的G-四链体结构 |
| 3.4.3 G-四链体结构阻滞DNA合成 |
| 3.4.4 G-四链体结构对AKT1启动子的正调控 |
| 3.4.5 RECQL通过解旋G-四链体结构调控AKT1启动子转录活性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 人AKT1 3'-UTR区域G-四链体结构的鉴定及功能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 生物信息学分析 |
| 4.3.2 细胞培养和细胞转染 |
| 4.3.3 慢病毒包装及侵染 |
| 4.3.4 载体构建 |
| 4.3.5 RNA提取与逆转录 |
| 4.3.6 实时荧光定量PCR (RT-qPCR) |
| 4.3.7 圆二色性(CD)光谱分析 |
| 4.3.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) |
| 4.3.9 硫酸二甲酯足迹保护实验(DMS Footprinting) |
| 4.3.10 凝胶迁移实验 |
| 4.3.11 miR-193b-3p和3'-UTR体外结合实验 |
| 4.3.12 荧光素酶(Gluc)报告实验 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 AKT1基因3'-UTR序列的生物信息学分析 |
| 4.4.2 AKT1 3'-UTR富含G区域形成稳定的G-四链体结构 |
| 4.4.3 G-四链体结构对AKT1 3'-UTR的正调控 |
| 4.4.4 AKT1 3'-UTR G-四链体调控miR-193b-3p结合 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 基于分子对接技术鉴定石蒜碱作为G-四链体小分子配体 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 主要仪器 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 分子对接 |
| 5.3.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 5.3.3 DNA银染 |
| 5.3.4 基因组DNA PCR阻滞实验 |
| 5.3.5 检测石蒜碱对肿瘤细胞生长的抑制作用 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 分子对接结果 |
| 5.4.2 石蒜碱与G-四链体Pu22相互作用的凝胶分析 |
| 5.4.3 石蒜碱抑制G-四链体DNA的扩增而不抑制非G-四链体DNA的扩增 |
| 5.4.4 石蒜碱抑制肿瘤细胞增殖 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（3）基于全外显子测序分析高级别浆液性卵巢癌肿瘤异质性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料方法 |
| 2.1 标本信息与选取 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 DNA提取 |
| 2.3.2 样本质检 |
| 2.3.3 全外显子文库制备与测序 |
| 2.3.4 数据过滤 |
| 2.3.5 对比、检测与注释 |
| 2.3.6 石蜡切片制备及免疫组化 |
| 2.4 免疫组化结果判读 |
| 2.5 统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 测序结果 |
| 3.2 SNP分析 |
| 3.2.1 突变统计 |
| 3.2.2 SNP筛选 |
| 3.3 InDel分析 |
| 3.3.1 插入与缺失统计 |
| 3.3.2 InDel筛选 |
| 3.4 免疫组化结果分析 |
| 3.5 异质性分析 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 卵巢癌肿瘤内异质性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩写对照表 |
| 在校期间研究成果 |
| 致谢 |
（4）猪iPSCs中miRNA-mRNA调控网络分析及其关键miRNAs参与多能性调控的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 文献综述 |
| 第一章 多能干细胞研究进展 |
| 1.1 不同类型多能干细胞的研究 |
| 1.1.1 胚胎干细胞 |
| 1.1.2 原始外胚层干细胞 |
| 1.1.3 诱导多能干细胞 |
| 1.2 猪多能干细胞的研究 |
| 1.2.1 猪胚胎干细胞 |
| 1.2.2 猪诱导多能干细胞 |
| 第二章 MiRNA与多能干细胞 |
| 2.1 MiRNA的生成和作用机制 |
| 2.2 MiRNA与多能干细胞 |
| 2.2.1 多能性相关miRNA |
| 2.2.2 MiRNA多能性调控机理 |
| 2.2.3 MiRNA与体细胞重编程 |
| 2.2.4 MiRNA与多能干细胞分化 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪iPSCs中特异miRNAs的筛选 |
| 3.1 试验材料,仪器和方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试剂与耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 猪iPSCs中 miRNAs表达谱分析 |
| 3.2.2 特异表达miRNAs的靶基因及其功能分析 |
| 3.2.3 猪iPSCs中 mRNAs表达谱分析 |
| 3.2.4 特异表达mRNAs的功能分析 |
| 3.2.5 特异表达miRNAs和 mRNAs的联合分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 靶向LIN28A基因miRNAs的验证及其在猪iPSCs中的调控作用 |
| 4.1 试验材料,仪器和方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试剂与耗材 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 MiR-31863和miR-370与LIN28A的负相关性 |
| 4.2.2 MiR-370 靶向调控LIN28A3’UTR区 |
| 4.2.3 猪iPSCs分化促进miR-370 的表达 |
| 4.2.4 MiR-370 抑制LIN28A的表达 |
| 4.2.5 MiR-370 通过下调LIN28A表达影响猪iPSCs的多能状态 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 靶向调控OTX2 基因miRNAs的生物信息分析及验证 |
| 5.1 试验材料、仪器和方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂与耗材 |
| 5.1.3 主要仪器设备及器材 |
| 5.1.4 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 猪iPSCs中多能性基因表达谱分析 |
| 5.2.2 预测靶向OTX2 基因的miRNAs |
| 5.2.3 验证miRNAs靶向调控OTX2 |
| 5.2.4 MiR-1343和miR-545 抑制OTX2 的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 OTX2 在猪iPSCs中的调控网络研究 |
| 6.1 试验材料,仪器和方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 主要试剂与耗材 |
| 6.1.3 主要仪器设备及器材 |
| 6.1.4 试验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 MiR-1343和miR-545 促进猪iPSCs的自我更新 |
| 6.2.2 miR-1343和miR-545 调控猪iPSCs的分化 |
| 6.2.3 OTX2 抑制SOX2和ESRRB的启动子活性 |
| 6.2.4 SOX2 抑制OTX2 启动子活性 |
| 6.2.5 多能基因调控miR-1343的表达 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点及未来研究计划 |
| 创新点 |
| 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）lncRNA RHPN1-AS1靶向MiR-299-3p/TNFSF12通路参与调控NSCLC耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 1.1 肺癌概述 |
| 1.2 临床表现与病理特征 |
| 1.2.1 临床表现 |
| 1.2.2 病理分型与特征 |
| 1.3 NSCLC的治疗 |
| 1.4 吉非替尼及其耐药 |
| 1.5 MicroRNA及 LncRNA在癌症病理及治疗中的作用 |
| 1.6 TNF阻滞剂(TNFSF12) |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 仪器和厂家 |
| 2.1.3 临床样本来源与处理 |
| 2.1.4 细胞系培养 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 RNA的提取和RT-qPCR( real-time quantitative polymerase chainreaction) |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 细胞活力检测 |
| 2.2.4 细胞凋亡流式检测 |
| 2.2.5 克隆形成 |
| 2.2.6 侵袭转移Transwell检测 |
| 2.2.7 免疫共沉淀 |
| 2.2.8 荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.9 免疫印迹 |
| 2.2.10 裸鼠成瘤 |
| 2.2.11 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 RHPN1-AS1 在吉非替尼耐药的NSCLC细胞系中显着下调,其表达与NSCLC患者预后正相关 |
| 3.1.1 RHPN1-AS1在NSCLC患者组织中的表达情况 |
| 3.1.2 RHPN1-AS1 在不同NSCLC细胞株中的表达以及各个细胞株的耐药情况 |
| 3.1.3 RHPN1-AS1 与吉非替尼耐药性以及患者生存率相关性分析 |
| 3.2 RHPN1-AS1 可以增加NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性 |
| 3.2.1 采用干扰RNA敲减NSCLC中 LncRNA RHPN1-AS |
| 3.2.2 敲减LncRNA RHPN1-AS后,NSCLC细胞耐药和凋亡特征 |
| 3.2.3 敲减LncRNA RHPN1-AS后,NSCLC细胞侵袭和迁移能力特征 |
| 3.3 过表达RHPN1-AS1 赋予NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性 |
| 3.3.1 体外NSCLC中过表达RHPN1-AS1 |
| 3.3.2 过表达RHPN1-AS1 后,对NSCLC细胞耐药和凋亡影响 |
| 3.3.3 过表达RHPN1-AS1 后,对NSCLC细胞侵袭能力的影响 |
| 3.3.4 构建裸鼠成瘤模型,检测过表达LncRNA RHPN1-AS1 后,给予吉非替尼后对瘤体生长情况的影响 |
| 3.4 在NSCLC细胞中,LncRNA RHPN1-AS1是MiR-299-3p的分子海绵 |
| 3.4.1 采用生物信息学寻找LncRNA RHPN1-AS1 的结合靶点 |
| 3.4.2 验证LncRNA RHPN1-AS1与MiR-299-3p的调控关系 |
| 3.4.3 采用荧光素报告实验验证LncRNA RHPN1-AS1与MiR-299-3p的结合 |
| 3.4.4 MiR-299-3p在 NSCLC患者组织中的表达情况 |
| 3.5 TNFSF12是MiR-299-3p的直接靶点 |
| 3.5.1 采用生物信息学预测MiR-299-3p作用靶点,并在组织和细胞中验证其表达 |
| 3.5.2 TNFSF12 m RNA表达与MiR-299-3p的相关性 |
| 3.5.3 TNFSF12为MiR-299-3p结合靶点 |
| 3.5.4 验证MiR-299-3p调控TNFSF12 表达 |
| 3.6 RHPN1-AS1 通过靶向MiR-299-3p/TNFSF12 通路调控吉非替尼耐药 |
| 3.6.1 回补实验验证RHPN1-AS1 靶向MiR-299-3p/TNFSF12 通路 |
| 3.6.2 回补实验验证RHPN1-AS1 靶向MiR-299-3p/TNFSF12 通路调控的细胞凋亡 |
| 3.6.3 回补实验验证RHPN1-AS1 靶向MiR-299-3p/TNFSF12 通路调控的细胞迁移 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）去氢骆驼蓬碱调控PI3K/Akt通路和溶酶体Rab7/RILP诱导Sf9细胞自噬（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 1 前言 |
| 1.1 β-咔啉生物碱 |
| 1.1.1 β-咔啉生物碱的概述 |
| 1.1.2 β-咔啉生物碱的抗肿瘤活性 |
| 1.1.3 β-咔啉生物碱在植物保护领域的应用 |
| 1.1.4 去氢骆驼蓬碱抗肿瘤的机制研究 |
| 1.2 细胞自噬的概述 |
| 1.2.1 细胞程序性死亡的方式 |
| 1.2.2 细胞自噬的分类 |
| 1.2.3 细胞自噬的发生 |
| 1.2.4 自噬过程中的PI3K/Akt通路 |
| 1.2.5 自噬过程中溶酶体Rab7/RILP通路 |
| 1.3 选题依据及研究思路 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 去氢骆驼蓬碱对果蝇发育的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试果蝇品系 |
| 2.2.2 供试药剂及主要试剂 |
| 2.2.3 供试耗材及主要仪器 |
| 2.2.4 果蝇培养 |
| 2.2.5 剂量筛选处理 |
| 2.2.6 Harmine处理实验 |
| 2.2.7 果蝇发育相关基因q RT-PCR检测 |
| 2.2.8 统计学方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同浓度去氢骆驼蓬碱对果蝇生长发育的影响 |
| 2.3.2 去氢骆驼蓬碱对果蝇生长发育的影响 |
| 2.3.3 去氢骆驼蓬碱对果蝇生长发育和自噬相关基因的影响 |
| 2.4 小结 |
| 3 去氢骆驼蓬碱等五种β咔啉生物碱的细胞活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 供试细胞株系 |
| 3.2.2 供试药剂及主要试剂 |
| 3.2.3 供试耗材及主要仪器 |
| 3.2.4 昆虫细胞培养及保存 |
| 3.2.5 细胞毒力检测方法 |
| 3.2.6 倒置相差显微镜形态观察 |
| 3.2.7 透射电子显微镜形态观察 |
| 3.2.8 MDC荧光染色检测方法 |
| 3.2.9 Lyso Tracker Red荧光染色检测方法 |
| 3.2.10 细胞自噬相关基因的qRT-PCR检测 |
| 3.2.11 细胞自噬相关蛋白的Western Blot检测 |
| 3.2.12 统计学方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 五种β-咔啉生物碱对Sf9细胞增殖生长的影响 |
| 3.3.2 五种β-咔啉生物碱的对Sf9细胞形态的影响 |
| 3.3.3 β-咔啉生物碱对Sf9细胞亚细胞结构的影响 |
| 3.3.4 β-咔啉生物碱对Sf9 细胞MDC染色的影响 |
| 3.3.5 β-咔啉生物碱对Sf9 细胞Lyso Tracker Red染色的影响 |
| 3.3.6 β-咔啉生物碱对Sf9细胞自噬相关基因表达的影响 |
| 3.3.7 β-咔啉生物碱对Sf9细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 小结 |
| 4 去氢骆驼蓬碱诱导Sf9细胞自噬中的组学关联分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 供试药剂及主要药剂 |
| 4.2.2 供试耗材及主要仪器 |
| 4.2.3 倒置相差显微镜IPCM形态观察 |
| 4.2.4 MDC荧光染色检测方法 |
| 4.2.5 Lyso Tracker Red荧光染色检测方法 |
| 4.2.6 细胞自噬相关基因的qRT-PCR检测 |
| 4.2.7 细胞自噬相关蛋白的Western Blot检测 |
| 4.2.8 细胞转录组的检测 |
| 4.2.9 蛋白质iTRAQ定量检测 |
| 4.2.10 转录组与蛋白组的关联分析 |
| 4.2.11 统计学方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同浓度去氢骆驼蓬碱对Sf9细胞形态的影响 |
| 4.3.2 不同浓度去氢骆驼蓬碱对Sf9细胞MDC染色的影响 |
| 4.3.3 不同浓度去氢骆驼蓬碱对Sf9 细胞Lyso Tracker Red染色的影响 |
| 4.3.4 不同浓度去氢骆驼蓬碱对Sf9细胞相关基因表达的影响 |
| 4.3.5 不同浓度去氢骆驼蓬碱对Sf9细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 4.3.6 去氢骆驼蓬碱处理Sf9细胞后转录组结果分析 |
| 4.3.7 去氢骆驼蓬碱处理Sf9细胞后蛋白组结果分析 |
| 4.3.8 去氢骆驼蓬碱处理Sf9细胞后转录组和蛋白组关联结果分析 |
| 4.4 小结 |
| 5 PI3K/Akt通路参与去氢骆驼蓬碱诱导的Sf9 细胞自噬 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 供试药剂及主要药剂 |
| 5.2.2 供试耗材及主要仪器 |
| 5.2.3 细胞毒力MTT检测方法 |
| 5.2.4 倒置相差显微镜IPCM形态观察 |
| 5.2.5 MDC荧光染色检测方法 |
| 5.2.6 Lyso Tracker Red荧光染色检测方法 |
| 5.2.7 统计学方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 通路抑制剂与激活剂对去氢骆驼蓬碱诱导细胞形态变化的影响 |
| 5.3.2 通路抑制剂与激活剂对去氢骆驼蓬碱诱导细胞增殖抑制的影响 |
| 5.3.3 通路抑制剂与激活剂对去氢骆驼蓬碱诱导细胞MDC染色的影响 |
| 5.3.4 通路抑制剂与激活剂对去氢骆驼蓬碱诱导细胞Lyso Tracker染色的影响 |
| 5.4 小结 |
| 6 溶酶体Rab7/RILP通路在Sf9 细胞自噬中的作用方式 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 供试药剂及主要试剂 |
| 6.2.2 供试耗材及主要仪器 |
| 6.2.3 线粒体膜电位Rhodamine123 染色 |
| 6.2.4 线粒体Mito Green染色 |
| 6.2.5 线粒体ATPase的检测 |
| 6.2.6 溶酶体Cathepsin L与自噬Atg8 的免疫荧光检测 |
| 6.2.7 溶酶体Rab7/RILP通路的生物信息学分析 |
| 6.2.8 Rab7和RILP全长、截短和定点突变 |
| 6.2.9 溶酶体Rab7和RILP的过表达实验 |
| 6.2.10 溶酶体Rab7和RILP的 RNAi干扰实验 |
| 6.2.11 Rab7 的表达与RILP的截短表达 |
| 6.2.12 Rab7与RILP蛋白互作的酵母双杂交检测 |
| 6.2.13 Rab7与RILP蛋白互作的GST-pull down检测 |
| 6.2.14 统计学方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 去氢骆驼蓬碱对细胞线粒体膜电位Rhodamine123 染色的影响 |
| 6.3.2 去氢骆驼蓬碱对细胞线粒体Mito Green染色的影响 |
| 6.3.3 去氢骆驼蓬碱对细胞线粒体ATPase的影响 |
| 6.3.4 去氢骆驼蓬碱处理后Cathepsin L与 Sf-Atg8 的免疫荧光共定位 |
| 6.3.5 草地贪夜蛾溶酶体Rab7和RILP的生物信息学分析 |
| 6.3.6 Rab7和RILP过表达对去氢骆驼蓬碱诱导Sf9 细胞自噬的影响 |
| 6.3.7 RNAi干扰Rab7和RILP对去氢骆驼蓬碱诱导Sf9 细胞自噬的影响 |
| 6.3.8 定点突变和截短表达对Rab7和RILP互作酵母双杂交的影响 |
| 6.3.9 截短表达对Rab7和RILP相互作用GST-pull down的影响 |
| 6.4 小结 |
| 7 讨论与结论 |
| 7.1 讨论 |
| 7.1.1 β-咔啉生物碱生物活性与结构优化的关系 |
| 7.1.2 自噬与活性成分杀虫机理研究 |
| 7.1.3 生长发育信号网络与harmine诱导的果蝇生长发育抑制 |
| 7.1.4 细胞程序性死亡与果蝇生长发育 |
| 7.1.5 组学关联分析在昆虫研究中的应用 |
| 7.1.6 PI3K/Akt通路在去氢骆驼蓬碱诱导的Sf9 细胞自噬中的作用 |
| 7.1.7 哺乳动物细胞自噬中Rab7与RILP的相互作用 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 本文创新之处 |
| 7.4 本文后续研究思路 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 在读期间发表论文及获奖情况 |
（7）放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 :放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8~+T细胞浸润的作用及机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 放疗促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果及分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 嗜酸性粒细胞浸润与细胞毒性T淋巴细胞的招募密切相关 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果及分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 嗜酸性粒细胞在CD8~+T 细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果及分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 嗜酸性粒细胞可促进过继免疫治疗的疗效 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果及分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 放疗可使CAR-T治疗患者受益更多 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.3 结果及分析 |
| 7.4 讨论 |
| 第二部分 :肿瘤局部的突变多样性引起了免疫的异质性 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果及分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 放疗对肿瘤微环境的影响研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表及撰写的文章 |
| 致谢 |
（8）棕榈酰转移酶DHHC21调控急性髓系白血病分化及其机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与仪器 |
| 2.1 细胞株和质粒 |
| 2.2 药物与主要试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 蛋白水平检测Western blot |
| 3.3 mRNA水平检测——Quantitative Real-time PCR |
| 3.4 细胞计数 |
| 3.5 细胞表面分化标记物检测——流式细胞术 |
| 3.6 NBT还原实验 |
| 3.7 瑞式-吉姆萨染色实验 |
| 3.8 构建短发夹shRNA-PLKO.1载体质粒 |
| 3.9 慢病毒颗粒的包装 |
| 3.10 慢病毒感染细胞 |
| 3.11 基因表达谱建立 |
| 3.12 数据分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 寻找调控AML细胞分化的关键DHHC亚型蛋白 |
| 4.1.1 抑制棕榈酰转移酶活性促进AML细胞分化 |
| 4.1.2 Oncomine数据库白血病基因中DHHC亚型的表达分析 |
| 4.1.3 DHHC亚型蛋白对AML细胞分化的影响 |
| 4.2 shDHHC21诱导AML细胞株HL60分化 |
| 4.2.1 沉默DHHC21对HL60细胞增殖的影响 |
| 4.2.2 沉默DHHC21对HL60细胞表面分化标记物的影响 |
| 4.2.3 沉默DHHC21对HL60细胞NBT还原能力以及细胞核形态的影响 |
| 4.2.4 沉默DHHC21对HL60细胞分化调控相关转录因子的影响 |
| 4.3 shDHHC21诱导AML细胞株NB4分化 |
| 4.3.1 沉默DHHC21对NB4细胞增殖的影响 |
| 4.3.2 沉默DHHC21对NB4细胞分化指标的影响 |
| 4.3.3 沉默DHHC21对NB4细胞分化调控相关转录因子的影响 |
| 4.4 DHHC21调控AML分化依赖其棕榈酰转移酶活性 |
| 4.5 经典分化信号在shDHHC21促进AML细胞分化中的作用 |
| 4.5.1 单核/巨噬细胞分化相关信号在shDHHC21促进AML分化中的作用 |
| 4.5.2 shDHHC21诱导的AML分化不依赖于RARα |
| 4.6 DHHC21调控AML细胞分化的内在机制探索 |
| 4.6.1 建立shDHHC21诱导AML细胞分化过程中的基因表达谱 |
| 4.6.2 shDHHC21诱导AML细胞分化过程中基因表达谱的分析及确证 |
| 4.6.3 寻找shDHHC21诱导AML细胞分化过程的关键分子 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 DHHC蛋白家族在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及硕士期间科研成果 |
（9）KLF4抑制宫颈癌放疗敏感性及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 KLF4与宫颈癌组织放疗敏感性的关系 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 KLF4促进宫颈癌细胞的放疗抵抗 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 KLF4对宫颈癌裸鼠移植瘤生长及放疗敏感性的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 KLF4对宫颈癌细胞放疗敏感性的分子机制初步研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）LAMP3介导上皮间质转化在绒癌侵袭迁移中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 LAMP3在绒癌细胞JEG-3中的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 LAMP3通过调控EMT介导绒癌细胞JEG-3的侵袭迁移 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 小结 |
| 第三部分 Wnt信号通路参与了LAMP3对JEG-3细胞EMT的调控 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 非论文答辩部分 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生在读期间参加学术活动、发表论文情况 |
四、不同表型的人宫颈癌细胞亚克隆株的基因表达谱（论文参考文献）
- [1]基于单细胞转录组测序技术对宫颈恶性肿瘤异质性及相关基因的研究[D]. 刘健. 吉林大学, 2021(01)
- [2]人的AKT1启动子及其mRNA的3’-UTR区域中G-四链体结构的鉴定和功能研究[D]. 张兰兰. 东北林业大学, 2021
- [3]基于全外显子测序分析高级别浆液性卵巢癌肿瘤异质性[D]. 王丽娟. 兰州大学, 2021(12)
- [4]猪iPSCs中miRNA-mRNA调控网络分析及其关键miRNAs参与多能性调控的机制研究[D]. 谢游龙. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [5]lncRNA RHPN1-AS1靶向MiR-299-3p/TNFSF12通路参与调控NSCLC耐药的机制研究[D]. 李学浩. 中国医科大学, 2020(01)
- [6]去氢骆驼蓬碱调控PI3K/Akt通路和溶酶体Rab7/RILP诱导Sf9细胞自噬[D]. 崔高峰. 华南农业大学, 2019
- [7]放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究[D]. 成佳楠. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [8]棕榈酰转移酶DHHC21调控急性髓系白血病分化及其机制研究[D]. 徐通. 浙江大学, 2019(04)
- [9]KLF4抑制宫颈癌放疗敏感性及其分子机制研究[D]. 刘海霞. 第四军医大学, 2017(02)
- [10]LAMP3介导上皮间质转化在绒癌侵袭迁移中的作用及机制研究[D]. 李洁. 北京协和医学院, 2017(11)