一、bcl-2基因对血管内皮细胞保护作用的研究（论文文献综述）
万绍芬[1]（2021）在《沉默LMP2基因对OGD/R大鼠脑微血管内皮细胞血脑屏障蛋白表达影响》文中研究表明第一部分沉默LMP2基因对OGD/R条件下大鼠脑微血管内皮细胞血脑屏障蛋白表达影响目的探讨沉默免疫蛋白酶体亚基LMP2（lowmolecularweight protein 2,LMP2,低分子量蛋白2;又称β1i基因）表达对氧气-葡萄糖剥夺/复氧条件下大鼠脑微血管内皮细胞血脑屏障蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1表达和细胞迁移影响。方法大鼠脑微血管内皮细胞（rats brain microvascular endothelial cells,RBMVECs）复苏培养和传代,建立稳定、可靠的氧气-葡萄糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型,采用CCK8检测细胞活性,LMP2-si RNA及阴性对照si RNA转染RBMVECs,免疫荧光染色（Immunofluorescence stain,IF）和免疫蛋白印迹（western-blot,WB）测定血脑屏障（blood brain barrier,BBB）相关蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1表达,细胞划痕实验评估RBMVECs的迁移能力。结果（1）RBMVECs经复苏传代后细胞生长状态良好,VWF因子免疫荧光染色鉴定培养的RBMVECs的纯度>90%。（2）建立了稳定可靠的氧气-葡萄糖剥夺1h/复氧24h（OGD/R）体外细胞缺血模型。（3）IF显示OGD/R组LMP2蛋白表达较正常条件培养组（Normal组）升高,但ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表达降低。WB结果显示,与Normal组比较,OGD/R组LMP2蛋白表达上调,但ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表达降低（P<0.001）。（4）细胞划痕实验显示在正常条件下培养（Normal组）,RBMVECs在“划痕损伤”后48h明显呈现增殖迁移修复这个“伤痕”,但在OGD/R条件下这种迁移能力明显下降。（5）WB结果显示,与Normal组相比,OGD/R条件下RBMVECs的ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表达明显降低,有统计学差异（P<0.001）。但沉默LMP2基因表达后,这些蛋白下调的趋势被逆转了。与Control-si RNA组比较,LMP2-si RNA组ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表达明显升高（P<0.001）。（6）WB结果显示,与Normal组相比,OGD/R条件下RBMVECs的Bax、cleaved Caspase3蛋白表达上调,抗凋亡Bcl-2蛋白表达明显降低,有统计学差异（P<0.001）。与Control-si RNA组比较,转染LMP2-si RNA沉默LMP2基因表达可逆转Bcl-2蛋白下调趋势,减少Bax、cleaved Caspase3蛋白表达P<0.001)。（7）细胞划痕实验显示,与control-si RNA组（阴性对照组）比较,OGD/R条件下,沉默LMP2基因的RBMVECs增殖迁移能力明显增加。结论沉默LMP2基因表达能够上调OGD/R条件下RBMVECs血脑屏障蛋白的表达,抑制细胞凋亡和促进细胞迁移。第二部分沉默β-catenin基因对OGD/R条件下大鼠脑微血管内皮细胞血脑屏障蛋白表达影响目的探讨沉默β-catenin基因表达对OGD/R条件下RBMVECs内Claudin-1、Occludin、ZO-1表达和细胞迁移影响。方法RBMVECs复苏培养和传代,建立稳定、可靠的OGD/R模型,采用CCK8检测细胞活性,β-catenin-si RNA及阴性对照si RNA转染RBMVECs,免疫荧光染色和western-blot测定目的蛋白表达,细胞划痕实验评估RBMVECs的迁移能力。结果（1）IF显示在OGD/R条件下RBMVECs的β-catenin蛋白表达较正常条件培养组（Normal组）降低。Western-blot结果显示,与Normal组比较,OGD/R组β-catenin蛋白表达明显下调（P<0.001）。（2）WB结果显示,与在正常条件培养的细胞（Normal组）相比,OGD/R条件下RBMVECs的ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表达都明显降低,转染β-catenin-si RNA沉默β-catenin基因表达加剧这些蛋白下调趋势,β-catenin-si RNA组ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表达较Control-si RNA组都有明显降低,有统计学差异（P<0.001）。（3）WB结果显示,与正常条件培养组（Normal组）相比,OGD/R条件下RBMVECs的Wnt3a、β-catenin蛋白表达明显降低,但转染LMP2-si RNA沉默LMP2基因表达可逆转这些蛋白下调趋势,LMP2-si RNA组Wnt3a、β-catenin蛋白表达较Control-si RNA组明显升高,有统计学差异（P<0.001）。（4）WB结果显示,与Normal组相比,OGD/R条件下RBMVECs的ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表达明显降低（P<0.001）;转染LMP2-si RNA沉默LMP2基因表达可逆转这些蛋白下调趋势,但这种效果被合并转染β-catenin-si RNA所抵消,有统计学差异（P<0.001）。（5）细胞划痕实验显示,与control-si RNA组（阴性对照组）和blank组（空白组）比较,转染β-catenin-si RNA的RBMVECs在OGD/R条件下细胞增殖迁移能力明显减弱。结论Wnt/β-catenin通路调控脑微血管内皮细胞BBB蛋白表达,沉默LMP2基因表达可能通过活化Wnt/β-catenin通路上调脑微血管内皮细胞BBB蛋白表达,促进细胞迁移。
李泳欣[2]（2021）在《Nrf2-ARE信号通路抵御小鼠乳腺氧化应激的分子机制及槲皮素对其调控研究》文中进行了进一步梳理泌乳功能对哺乳动物的生存繁衍至关重要。乳汁不仅可以保证哺乳动物的新生儿存活,同时也为人类生长发育提供了营养物质。动物哺乳期间,多种疾病和亚健康状态均会影响乳腺健康。氧化应激是损害乳腺健康的常见因素,通常会抑制乳腺功能,造成泌乳量和乳品质下降。自然界中的天然活性物质具有抗氧化、抗炎等特性,得到了广泛关注。Nrf2-ARE是目前已知最重要的抗氧化相关信号通路之一,生物活性物质是否可通过Nrf2-ARE途径缓解乳腺氧化应激,值得深入研究。因此,本研究利用Nrf2敲除小鼠,解析了Nrf2-ARE途径在乳腺氧化应激中的作用机制,随后以乳腺上皮细胞为模型探究可通过Nrf2-ARE通路抵御氧化应激的生物活性物质,并阐明其作用机制。本研究旨在为Nrf2-ARE信号通路抵御乳腺氧化应激的分子机制提供理论依据,为定向调控和防治乳腺氧化应激的饲料添加剂开发奠定科学基础。1 Nrf2基因敲除对小鼠生长繁殖和乳腺健康的影响本研究首先对小鼠进行基因型鉴定,确定Nrf2基因型不影响母鼠生长繁殖性能和10-12周龄母鼠哺乳期6-11天平均泌乳量,明确Nrf2基因敲除小鼠可用于乳腺健康研究。继而选用10-12周龄泌乳早期（第3天）WT、Nrf2（+/-）和Nrf2（-/-）小鼠各6只,每只小鼠第四对乳腺的一侧注射50μL LPS（0.2 mg/ml）作为处理组,另一侧乳腺注射50μL PBS作为对照组,注射后24 h采集第四对乳腺组织。另取10-12周龄泌乳中期（第12天）WT、Nrf2（+/-）和Nrf2（-/-）小鼠各5只,分别注射LPS和PBS后3 h取乳样。分析乳腺组织外观、乳中蛋白含量、乳腺炎性因子和氧化还原平衡相关基因表达,综合判断乳腺健康情况。结果表明,应激条件下Nrf2（-/-）小鼠的乳腺组织中β酪蛋白基因表达显着升高,κ酪蛋白基因表达显着降低,而WT小鼠乳蛋白基因无明显变化。转录组学结果显示,LPS处理后,Nrf2（-/-）小鼠乳腺血红素加氧酶1（HO-1）、谷氨酸/胱氨酸反向转运体轻链（x CT）和谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基（GCLM）的m RNA水平显着低于WT小鼠,同时总抗氧化能力明显降低。应激条件下Nrf2（-/-）小鼠乳腺出现更多炎性因子表达上调。以上结果提示,相比WT小鼠,Nrf2（-/-）小鼠乳腺的氧化还原平衡被打乱,乳腺健康更易受到外界刺激的不利影响。2 Nrf2-ARE信号通路抵御小鼠乳腺氧化损伤的作用机制本试验使用上述泌乳早期（第3天）小鼠注射LPS 24 h后采集得到的第四对乳腺组织样本,检测乳腺抗氧化酶类表达、谷胱甘肽（GSH）含量、GSH与还原性谷胱甘肽（GSSG）比例、GSH合成与代谢相关基因表达、细胞凋亡与内质网应激情况。结果表明,LPS刺激不改变WT小鼠的过氧化氢酶和过氧化物还原酶1表达,但在Nrf2（-/-）小鼠乳腺降低了以上抗氧化酶表达。LPS刺激上调了WT小鼠乳腺Nrf2和HO-1的基因表达,但Nrf2（-/-）小鼠中未见明显上调。此外,两种Nrf2敲除小鼠未能如WT小鼠一样,受到LPS诱导后显着上调GSH含量和GSH/GSSG比例。Nrf2（-/-）小鼠中谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）、GCLM和x CT的m RNA表达丰度在LPS应激条件下也低于WT小鼠。另外,LPS处理增加了Nrf2（-/-）小鼠中促凋亡因子（BAX）的表达、BAX/Bcl-xl比例和内质网应激标记物（GPR78）表达,而WT鼠未见明显差异。以上结果提示,Nrf2-ARE信号通路同时调节酶类和非酶类抗氧化防御系统,可通过Nrf2/GCL/GSH/GPx1途径准确调控GSH的合成与消耗,并且对细胞凋亡和内质网应激也具有影响作用。3 Nrf2-ARE通路介导槲皮素抵御乳腺上皮细胞氧化损伤的作用机制3.1槲皮素抵御乳腺上皮细胞氧化损伤的作用效果本试验旨在探究可缓解乳腺氧化应激的生物活性物质。首先采用不同浓度H2O2（50,100,250,500,750,1000μΜ）刺激乳腺上皮（HC11）细胞24 h建立氧化损伤模型。使用不同浓度槲皮素（0、5、10、15、20、25μΜ）刺激HC11细胞24 h,确定HC11细胞耐受浓度,检测槲皮素预处理2 h对H2O2引起的HC11细胞增殖受阻和乳酸脱氢酶（LDH）释放的改善效果。随后,将HC11细胞分为四组处理,槲皮素和槲皮素预处理组使用20μΜ槲皮素培养细胞;2小时后,H2O2和槲皮素预处理组加入100μΜH2O2培养细胞24小时,对照组使用无血清培养基培养。对四组细胞提取蛋白,检测CAT与SOD活性、抗氧化蛋白（x CT,GCLM,TXNRD1）表达和细胞凋亡相关蛋白（BAX,BCL-2）表达。结果发现100μΜH2O2可降低HC11细胞活力至对照组60%以下,LDH释放达到24%以上,适合作为应激研究模型。20μΜ槲皮素对HC11细胞的保护效果最好,可显着恢复H2O2造成的T-AOC降低,且槲皮素预处理显着改善了细胞的抗氧化酶活性和抗氧化蛋白表达,但对细胞凋亡未见明显影响。以上结果提示槲皮素具有改善HC11细胞增殖受阻、细胞毒性和氧化损伤的重要作用。3.2 Nrf2-ARE通路介导槲皮素抵御乳腺上皮细胞氧化损伤的分子机制本试验旨在阐明Nrf2-ARE信号通路介导槲皮素改善HC11细胞氧化损伤的分子机制。首先将HC11细胞分为四组处理,处理方式如上文所述,探究槲皮素对应激状态下Nrf2-ARE和MAPKs信号通路激活情况的影响。随后,使用信号通路抑制剂,探究Nrf2-ARE信号通路对MAPKs通路调控槲皮素作用的调控机制,研究两者在槲皮素抵御氧化应激中的关系。最后,将细胞分为7组,其中对照组、H2O2组和槲皮素预处理组处理方法如上文所述。抑制剂组分别使用Nrf2抑制剂ML385（5μM）、p38 MAPK抑制剂SB203580（25μM）、ERK抑制剂PD98059（100μM）和JNK抑制剂SP600125（10μM）预处理HC11细胞1小时,之后添加槲皮素处理2小时,最后使用H2O2刺激细胞24小时,检测细胞增殖、细胞毒性、抗氧化防御系统的变化,以阐明抗氧化相关信号通路在槲皮素抵御氧化应激中的重要作用。结果表明,H2O2造成HC11细胞Nrf2-ARE信号通路被激活,MAPKs信号通路也被激活。槲皮素预处理显着改善了Nrf2-ARE和MAPKs信号通路激活情况。ERK抑制剂显着提高p-NRF2/NRF2比例,p38 MAPK抑制剂显着降低p-NRF2的蛋白表达,提示p38 MAPK和ERK信号通路可能通过调节Nrf2-ARE信号途径的激活状态,从而影响槲皮素的抗氧化能力。四种抑制剂均显着降低了槲皮素对细胞增殖的改善作用,不影响槲皮素的抗细胞毒性。对抗氧化防御系统来说,槲皮素对T-AOC的改善作用主要依赖于Nrf2-ARE、p38 MAPK和ERK通路,x CT表达主要依赖于Nrf2-ARE信号途径,槲皮素对CAT酶活和GCLM表达的恢复作用同时受到Nrf2-ARE和MAPKs信号通路的调节。综上所述,Nrf2-ARE信号通路调节下游抗氧化酶表达,介导Nrf2/GCL/GSH/GPx1途径调控GSH的合成与消耗,对细胞凋亡和内质网应激具有调节作用,以此维持乳腺氧化还原平衡。Nrf2-ARE信号通路介导槲皮素改善HC11细胞增殖和抗氧化防御能力,恢复氧化还原平衡。此外,MAPKs信号通路也参与调节槲皮素的细胞保护功能。
赵倩[3]（2021）在《HSP70调控Bcl-2/Bax对缺氧性肺高压新生大鼠肺血管内皮细胞凋亡及肺动脉压力的作用研究》文中研究说明目的:通过研究缺氧性肺高压（hypoxia pulmonary hypertension,HPH）新生大鼠肺组织热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）、Bcl-2（B-cell lymphoma-2）和Bax（BCL2-Associated X）的表达变化、平均右心室内收缩压（RVSP,等同于肺动脉平均压）及肺血管内皮细胞凋亡变化情况,探讨HSP70调控Bcl-2/Bax,对缺氧性肺高压新生大鼠肺血管内皮细胞凋亡及肺动脉压力的作用。方法:将128只Wistar新生大鼠随机盲法分为对照组和缺氧组,其中缺氧组新生大鼠建立HPH模型,缺氧组按干预方法分为HPH组、HSP70+HPH组（HSP70过表达组）和KNK437+HSP70+HPH组（HSP70抑制剂组）,各组按观察时间点缺氧造模分为3d、7d、10d和14d,HSP70+HPH组和KNK437+HSP70+HPH组新生大鼠经口气管插管途径转染Ad-HSP70-EGFP（增强型绿色荧光蛋白标记的HSP70腺病毒载体）,HPH组和对照组经口气管插管转染Ad-CON-EGFP（增强型绿色荧光蛋白标记的空腺病毒载体）,KNK437+HSP70+HPH组每日腹腔注射HSP70抑制剂KNK437,对照组常氧下饲养。在各观察时间点检测新生大鼠平均右心室收缩压（RVSP）,通过荧光共聚焦显微镜观察携HSP70的绿色荧光腺病毒在新生大鼠肺组织中的定位,于电子显微镜观察肺血管内皮细胞凋亡变化情况,同时借助免疫组化方法评价肺组织HSP70、Bcl-2和Bax的表达水平。结果;1)平均RVSP:各观察时间点HPH组平均RVSP均高于对照组（P<0.05）,说明HPH新生大鼠造模成功;缺氧造模3、7、10d,HSP70+HPH组平均RVSP低于HPH组和KNK437+HSP70+HPH组（P<0.05）,和对照组对比差异无统计学意义,说明腺病毒介导的外源性HSP70可以降低肺动脉压力;2)免疫荧光:各组均观察到缺氧造模3、7、10d绿色荧光（标记的腺病毒载体）随时间的延长而逐渐减弱,绿色荧光位于细支气管周围,缺氧造模14d各组均未见明显荧光,说明经气管插管途径成功将腺病毒载体转染至新生大鼠肺组织;3)肺血管内皮细胞凋亡:HPH组缺氧造模3d可观察到内皮细胞发生凋亡形态,但缺氧造模14d凋亡减少,以胶原纤维增生为主,说明在HPH缺氧早期即发生肺血管内皮细胞凋亡;HSP70+HPH组在缺氧造模7d时可观察到凋亡改变,随着缺氧时间延长其凋亡和增生程度均低于同日龄HPH组;KNK437+HSP70+HPH组缺氧3d可观察到凋亡变化,随着缺氧时间延长其程度高于同日龄HSP70+HPH组,说明在缺氧早期HSP70能够降低肺血管内皮细胞凋亡严重程度及迟滞其凋亡出现时间。4)HSP70的表达:缺氧造模3、7、10d HPH组HSP70表达高于对照组（P<0.05）,说明缺氧可使内源性HSP70表达升高;缺氧造模3、7d HSP70+HPH组HSP70表达高于HPH组（P<0.05）,缺氧造模10、14d与HPH组比较差异无统计学意义（P>0.05）,说明携带HSP70腺病毒成功将HSP70高表达于新生大鼠肺组织,且随着缺氧时间延长,HSP70表达逐渐降低;缺氧造模3、7、10d KNK437+HSP70+HPH组HSP70表达均低于HSP70+HPH组和HPH组（P<0.05）,说明KNK437成功抑制HSP70的表达。5)Bcl-2和Bax的表达:HPH组缺氧造模3d时,Bcl-2的表达低于同日龄的对照组（P<0.05）,缺氧造模3、7d时,Bax的表达高于同日龄的对照组（P<0.05）,说明在HPH缺氧早期Bcl-2的表达下降、Bax的表达上升;HSP70+HPH组在各观察时间点,Bcl-2的表达均高于同日龄的HPH组（P<0.05）,缺氧造模3d时,Bax的表达低于同日龄的HPH组（P<0.05）,说明HSP70可成功上调Bcl-2、下调Bax的表达;KNK437+HSP70+HPH组Bcl-2表达缺氧造模3、7、10d低于HSP70+HPH组（P<0.05）,缺氧3d Bax表达高于HSP70+HPH组（P<0.05）。结论:经气管插管途径成功将HSP70基因高效表达于新生大鼠肺组织中,HSP70可能通过上调凋亡抑制蛋白Bcl-2,下调凋亡蛋白Bax,在缺氧早期抑制了肺血管内皮细胞凋亡,降低了肺动脉压力,在新生大鼠HPH中发挥保护作用。
耿嘉男[4]（2020）在《基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究》文中指出动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是导致不稳定冠状动脉综合征和心源性猝死的重要原因之一,流行病学统计结果显示,自2015年以来亚洲众多国家中因脂代谢异常引发AS导致的心血管疾病发病率急剧上升,已成为除传染性疾病外有较高死亡率的疾病。内皮细胞是血管内膜的主要组成细胞,是保护血管的第一道重要屏障,内膜异常是AS典型病理改变,表现为内皮细胞愈合能力降低、抗炎症细胞浸润能力下降以及细胞凋亡等,进而累及血管进一步损伤。人参皂苷Rg3（ginsenoside Rg3,Rg3）是人参的主要活性成分之一,其抗肿瘤和免疫调节等药理作用已经被熟知。随着研究的不断深入,Rg3对心血管系统的保护作用亦被证实,但有关Rg3抗AS作用及相关机制尚未明确。瑞舒伐他汀属他汀类药物,为HMG-Co A还原酶抑制剂,因具有比其他同类药物调节血脂作用更强、半衰期更短以及生物利用度更高等优点而备受青睐,但其抗AS机制及是否与内皮保护作用有关尚需深入研究。本论文基于吉林省科技厅自然科学基金项目:“瑞舒伐他汀对ox-LDL导致内皮细胞内质网应激的干预作用及分子机制研究”（编号:20150101200JC）,探讨瑞舒伐他汀在脂代谢异常引发AS中除降脂外的内皮保护作用及机制,同时对比研究Rg3的内皮保护和抗AS作用及机制。并通过体内实验比较瑞舒伐他汀、Rg3或二者联用对ApoE-/-小鼠AS的保护作用,以期为临床不能耐受全剂量他汀类药物或高肝酶活性患者,联合应用瑞舒伐他汀和Rg3治疗,确保更有效的冠状动脉护理提供理论依据。主要研究如下:1.Rg3对ox-LDL诱导内皮细胞功能异常的作用及机制研究为确定Rg3是否对ox-LDL导致内皮细胞异常有改善作用,建立ox-LDL（200μg/mL）诱导的内皮细胞（HUVECs）损伤模型,Rg3（15、30μmol/L）对HUVECs进行预处理,应用划痕实验、单核细胞黏附实验和Western blotting等方法,研究Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的影响。实验结果显示,Rg3可显着对抗ox-LDL导致的HUVECs愈合能力及抗单核细胞黏附功能下降,减少FAK的磷酸化,抑制黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达,抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达,表明Rg3可抑制ox-LDL诱导HUVECs功能异常,且与抑制FAK介导的黏附因子表达有关。为阐明Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的作用机制,采用了迁移实验、单核细胞黏附实验、Western blotting、免疫荧光和qPCR等方法和技术,对相关指标进行了检测。实验结果显示,Rg3可显着增强ox-LDL抑制HUVECs的PPARγ表达,抑制损伤的内皮细胞内NF-κB活化后核易位,降低炎症因子MCP-1和IL-6 mRNA水平;给予GW9662（PPARγ特异性抑制剂）对HUVECs进行预处理,可显着抑制Rg3增强HUVECs迁移及抗单核细胞黏附能力的作用,并抑制Rg3下调FAK的磷酸化、黏附因子和基质金属蛋白酶表达、NF-κB活化后核易位以及炎症因子的作用,表明Rg3可能通过上调内皮细胞PPARγ表达发挥抑制ox-LDL诱导HUVECs异常的作用。2.瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究建立ox-LDL诱导的内皮细胞损伤模型,瑞舒伐他汀（0.01、0.1及1μmol/L）对HUVECs进行预处理,应用试剂盒、MTT、流式细胞术、DAPI染色和Western blotting等技术和方法,探究瑞舒伐他汀的抗AS作用是否与内皮保护及抗内皮凋亡有关。实验结果显示,瑞舒伐他汀可显着增强ox-LDL刺激下HUVECs分泌NO水平降低,降低细胞氧化应激水平,增强HUVECs的PI3K/Akt/eNOS通路活化及Bcl-2/Bax的比率;MTT结果显示,瑞舒伐他汀可抑制ox-LDL诱导的HUVECs生存率下降;流式细胞术检测结果显示,瑞舒伐他汀可显着降低ox-LDL诱导的HUVECs凋亡率升高;DAPI染色结果显示,瑞舒伐他汀可显着抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞核损伤,以上均表明瑞舒伐他汀可以抑制ox-LDL诱导的HUVECs损伤及凋亡。此外,内皮细胞因其含有丰富的内质网,提示其可能对内质网应激异常导致细胞凋亡更为敏感,为阐明瑞舒伐他汀抑制ox-LDL诱导HUVECs凋亡的作用机制,对内质网应激相关通路进行检测,结果显示瑞舒伐他汀显着降低CHOP、sXBP1和Caspase-12mRNA水平,抑制GRP78表达,降低PERK、IRE1α及eIF2α的磷酸化,表明瑞舒伐他汀可能通过抑制内质网应激相关通路来抑制ox-LDL诱导的HUVECs凋亡。3.Rg3与瑞舒伐他汀联合应用对高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化作用研究为比较Rg3与瑞舒伐他汀的抗AS作用,探究Rg3与瑞舒伐他汀联用是否可更有效抑制AS发生及发展,本研究采用高脂饲料（含40%脂肪,1.25%胆固醇）饲养ApoE-/-小鼠成功复制动脉粥样硬化模型后,随机分为4组:模型组、Rg3组（Rg3）、瑞舒伐他汀组（RSV）和Rg3与瑞舒伐他汀联用组（Rg3+RSV）,以C57BL/6J小鼠保持喂养普通饲料作为正常对照。给药4 w后,检测小鼠血清T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C及CRP水平,HE染色和油红O染色观察小鼠主动脉AS斑块情况,MASSON染色检测小鼠主动脉胶原含量,免疫荧光染色检测小鼠主动脉内皮细胞凋亡情况,免疫组织化学染色检测主动脉和斑块巨噬细胞及平滑肌细胞含量,进而统计各组小鼠AS斑块核帽比及易损指数。本研究结果表明,与正常对照组比较,模型组小鼠T-CHO、TG、LDL-C以及CRP水平均显着升高,HDL-C水平显着降低;主动脉内膜及内膜下细胞排列紊乱,大量胞质呈空泡状,且主动脉内膜隆起纤维斑块层,动脉壁炎细胞浸润、泡沫化严重;主动脉内皮细胞凋亡显着增多,动脉壁胶原纤维含量显着减少;主动脉及斑块部位巨噬细胞表达显着增多,平滑肌细胞显着减少,小鼠AS斑块核帽比及易损指数显着升高。首先,与模型组比较,Rg3+RSV组及RSV组均显着降低小鼠血清LDL-C水平,显着抑制小鼠主动脉内皮细胞凋亡,且两组水平无显着差异,同时Rg3+RSV组显着降低小鼠血清T-CHO水平,但较正常仍呈较高水平,RSV组小鼠血清TG水平显着下降,提示瑞舒伐他汀可能发挥主要降低小鼠血清脂蛋白及抗内皮细胞凋亡作用;其次,Rg3+RSV组和Rg3组均显着降低AS小鼠血清中CRP水平,两组无显着差异,提示Rg3可能发挥主要降低小鼠炎症水平作用;另外,Rg3+RSV组和RSV组小鼠主动脉的胶原纤维含量较模型均显着增加,Rg3+RSV组和Rg3组巨噬细胞表达较模型组减少更为显着,而Rg3+RSV组α-SMA阳性表达增多显着,使得Rg3+RSV组AS斑块核帽比及易损指数降低更为显着。综上所述,Rg3可增强血管内皮细胞愈合能力及抵御炎症细胞黏附的能力,降低炎症因子和促AS细胞因子水平,可能与调节PPARγ/FAK信号通路有关,且Rg3可降低AS小鼠炎症水平,降低主动脉内膜及AS斑块巨噬细胞浸润,表明其可能通过抑制炎症对内皮损伤发挥抗AS作用;瑞舒伐他汀除改善AS小鼠血脂水平外,具有抑制AS小鼠血管内皮细胞凋亡作用,可能与增强血管内皮细胞PI3K/Akt/eNOS通路活化以及抑制内质网应激相关通路有关;另外,Rg3显示出显着抑制ApoE-/-小鼠的AS发生发展的作用,且Rg3与瑞舒伐他汀联用抗AS效果更为显着,提示当临床应用他汀类药物治疗AS效果不理想或对他汀类药物不耐受时,联合应用Rg3可能更有效发挥治疗AS作用。
屈雅欣[5]（2020）在《敲降Bmal1基因对人脐静脉内皮细胞自噬和凋亡的影响》文中进行了进一步梳理研究背景:生物钟广泛存在于生物个体当中,对于维持机体正常的生理功能具有重要的作用。近年来,生物钟与心血管疾病之间的关系被广泛关注,据研究报道,生物钟紊乱会对脂质代谢、血压稳态、动脉硬化等产生影响,并对血管造成损伤。然而,有关核心钟基因Bmal1对于血管内皮自噬和凋亡的影响报道甚少。研究目的及意义:探究核心生物钟基因Bmall在人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）自噬和凋亡中的作用。以期为钟基因与血管损伤之间的联系提供新的思路。实验方法:以HUVEC为研究对象,1μM地塞米松（dexamethasone,DEX）同步1h,以4h为间隔,提取24h内的细胞mRNA,利用实时荧光定量PCR测定Bmal1基因的昼夜时间表达谱,确定Bmall基因表达的峰值时点,并在该时点进行siRNA干扰（脂质体2000转染）,测定不同时点Bmal1基因的敲降效率。保持Bmall基因敲降实验条件不变,MTT检测转染敲降对内皮细胞的活性影响。用单丹磺酰尸胺（Monodansylcadaverine,MDC）染色和荧光显微镜拍照观察细胞自噬情况变化;以实时荧光定量PCR检测敲降Bmal1基因后内皮细胞自噬相关基因Beclin-1、p62、LC3的表达量变化,用Western blot检测自噬相关蛋白p62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的相对表达量的变化。利用Hoechst染色方法,在荧光显微镜下拍照观察敲降Bmal1基因后内皮细胞凋亡的变化情况,实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达量变化,用Western blot检测Bcl-2、Bax以及Bcl-2/Bax的相对表达量。ROS（Reactive oxygen species,ROS）荧光探针检测Bmall基因敲降后内皮细胞活性氧水平的变化。实验结果:在HUVEC中,Bmal1基因呈现昼夜节律性表达,符合余弦函数曲线,峰值时刻出现于CT12。脂质体2000-siBmal1转染细胞后,MTT检测结果显示,转染过程并未造成内皮细胞活性的明显变化。在自噬方面,通过MDC染色观察发现,相比于阴性对照组（Negative control,NC）,敲降Bmal1基因后内皮细胞的自噬水平增加,并且qPCR检测自噬相关基因Beclin-1、LC3的表达量有明显增加,p62基因表达稍有下降,蛋白检测结果发现,p62表达量显着降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显着升高。在凋亡方面,Bmal1敲降的细胞更易被Hoechst染色,呈现出致密浓染的细胞核,基因检测显示,凋亡相关基因Bax、Caspase3的表达量均有所增加,Bcl-2的表达量也有所增加,细胞蛋白检测发现,促凋亡蛋白Bax未有明显变化,但抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量显着降低,Bcl-2/Bax比值显着降低。ROS染色发现,Bmal1基因敲降后增多内皮细胞超氧化物的产生。结论:血管内皮细胞Bmal1基因呈现昼夜节律性表达;下调Bmal1可提高血管内皮细胞的自噬和凋亡水平,可能与细胞超氧化物增多有关。
李记泉[6]（2020）在《针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究》文中提出目的:本文以急性心肌缺血（Acute Myocardial Ischemia,AMI）大鼠为研究对象,以针刺联合骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs）静脉移植为干预手段,旨在探讨针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。材料与方法:1.BM-MSCs的分离、培养、传代、鉴定和标记:健康雄性SD大鼠3只（SPF级,4周龄,体重150-160g）,采用7%水合氯醛（5 m L/kg）腹腔注射麻醉,浸泡于75%酒精消毒5min,无菌条件下取胫骨、股骨,PBS缓冲液冲洗出骨髓制成单细胞悬液,离心后接种于培养瓶,放置于培养箱中采用全骨髓贴壁法培养,及时更换培养基,待细胞铺满培养瓶底部并融合成单层时,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1:2传代培养,显微镜观察细胞形态变化,取第三代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标记（CD29、CD73、CD90、CD44、CD45）,并取第三代细胞Brd U标记后采用荧光显微镜观察阳性细胞标记率。2.AMI大鼠模型的制备:60只健康雄性SD大鼠,腹腔注射7%水合氯醛（5 m L/kg）麻醉,通过结扎冠状动脉左前降支复制AMI大鼠模型,将存活的大鼠随机分为模型组、干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组,每组10只;同时另有15只大鼠仅在相同部位穿刺手术缝合线而不结扎,随机挑选术后存活大鼠10只作为假手术组。3.针刺联合BM-MSCs静脉移植干预AMI大鼠:造模结束后1小时,干细胞组、针刺联合干细胞组大鼠经尾静脉注射0.5ml的BM-MSCs（2×106个/ml）,同时其余各组注射同等剂量的生理盐水。对针刺组、针刺联合干细胞组大鼠采取电针双侧内关、心俞穴,刺入皮下深度2-3mm,疏密波,频率2Hz,强度2m A左右,以局部肌肉出现轻度震颤收缩为度,留针30min,24h治疗一次,共治疗10次;其他各组不针刺,但在同时同地以同样方式进行抓取和固定。期间观察各组大鼠体重、毛发、体态、饮食、二便、运动等一般情况。治疗结束后检测各组大鼠心电图、心脏超声,随即处死各组大鼠,取腹主动脉全血,分离出血清备用;同时快速取出心脏,生理盐水冲洗干净,每组随机挑选1个心脏样本,在缺血区域切薄片5片,用于大鼠心肌缺血面积的测定,其他心脏样本—80℃超低温冰箱冻存备用。本文分两个部分讨论针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。（1）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究观察BM-MSCs传代培养时的形态学特征与变化,分析BM-MSCs的鉴定和标记结果,采集大鼠心电图和心脏超声数据并分析,采用氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法测定AMI后各组大鼠的心肌缺血面积。（2）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色法检测AMI后各组大鼠心肌细胞形态和炎症浸润情况;蛋白质印迹法（Western Blot,WB）技术检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、VEGF、b-FGF、TGF-β蛋白的相对表达量;酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）技术检测大鼠心肌TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10蛋白的相对表达量。结果:1.与假手术组比较,模型组大鼠LVDd、LVDs明显升高（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠LVDd、LVDs、LVEF、LVFS无明显差异（P>0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）。2.假手术组大鼠未见心肌缺血;与假手术组比较,模型组大鼠心肌缺血面积明显升高（P<0.01）,缺血区面积占左心室总面积的18.39%;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌缺血面积比例无明显变化,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积明显高于针刺组、干细胞组（P<0.01）。3.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01或P<0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）。4.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）。5.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显降低（P<0.01）;针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显低于针刺组、干细胞组（P<0.01）。6.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）。7.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）。结论:1.针刺联合BM-MSCs移植能够显着改善AMI大鼠心电图和心脏超声变化,降低AMI大鼠左心室心肌缺血面积,提高AMI大鼠心脏功能,为临床治疗本病提供了新思路。2.针刺联合BM-MSCs移植能够通过下调AMI大鼠NF-κB表达,降低炎症因子TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8水平,以及上调抑炎因子IL-10水平,减轻AMI后过度表达的炎症反应,从而减轻心肌细胞坏死;通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达,从而减少AMI后心肌细胞凋亡;通过调节细胞生长因子VEGF、b-FGF、TGF-β表达,诱导内皮细胞形成,从而改善心肌供血。
谢灵芝[7]（2020）在《大鼠脑梗死模型制备的优化及HSP70-hom+2437基因多态性对脑梗死模型作用机制的研究》文中指出[目 的]1、第一部分大鼠脑梗死模型制备的优化及大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的构建。2、第二部分研究HSP70-hom+2437 SNPs在SD大鼠MCAO模型中的作用,并进一步探究其作用机制。[方 法]1、第一部分（1）大鼠MCAO模型的制备:将50只体重在260-280g雄性SD大鼠（SPF级）分为两组,分别为假手术组和模型组,每组各25只。模型组大鼠全部予以线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉阻塞,阻断大脑中动脉的血流,形成永久性MCAO模型。假手术组不放置栓线、不结扎血管,余步骤相同。（2）神经功能缺损评分及TTC染色测脑梗死体积:MCAO模型制作后24h,采用Bederson法进行神经功能评分。评分后立即处死大鼠取脑组织,并将脑组织切为厚度为2mm薄片行TTC染色,分析各组大鼠脑梗死体积百分比。（3）HE染色观察组织细胞形态学改变:取各组大鼠第3片脑切片固定3d后行石蜡包埋切片,包埋好的石蜡切片进行脱蜡、苏木素染色、伊红染色、脱水封片后于尼康倒置荧光显微镜下观察细胞形态学改变并采集图像分析。2、第二部分（1）构建慢病毒:构建阴性对照病毒,过表达C等位基因慢病毒、过表达T等位基因慢病毒,采用有限稀释法测定上述慢病毒滴度。测定荧光感染效率为60%时,两组过表达慢病毒最佳滴度为（1E+5）×60%/（1E-1）=6E+5,单位为TU/μl,6E+8TU/ml。（2）侧脑室定位注射:将150只210-230g重雄性SD大鼠随机分为五组,分别为MCAO模型组、MCAO模型+生理盐水组、MCAO模型+阴性病毒对照组、MCAO模型+过表达C等位基因组、MCAO模型+过表达T等位基因组,每组各30只。单纯MCAO模型组不进行侧脑室注射;MCAO模型+生理盐水组、MCAO模型+阴性病毒对照组、MCAO模型+过表达C等位基因组、MCAO模型+过表达T等位基因组,分别注射生理盐水、阴性对照病毒,过表达C等位基因慢病毒、过表达T等位基因慢病毒。（3）侧脑室定位注射后,饲养大鼠至体重260-280g,构建大鼠MCAO模型,24h后对各组的神经功能损伤进行评分,采用TTC染色法测量各组脑梗死面积、HE染色法观察各组组织形态学的改变。（4）提取缺血半暗带脑组织总RNA及总蛋白后分析HSPA1L和凋亡相关因子的相对表达情况:采用qPCR与Western blot法测各组大鼠脑梗死周边区HSPA1L、促凋亡因子Bax与cleaved-caspase3、抑凋亡因子Bcl-2的mRNA及蛋白表达情况。[结 果]1.第一部分（1）验证大鼠MCAO模型的成功性:相对于假手术组,在模型组中出现了明显的神经功能损伤的症状,且模型组神经功能缺损评分明显增高,差异具有统计学意义（P<0.001）。（2）TTC染色验证梗死的部位和体积,TTC染色中梗死部位常位于皮质及皮质下区,模型组出现明显的梗死区,与正常组对比差异具有明显统计学意义（P<0.05）。（3）HE染色验证细胞水平的病理改变。实验结果显示,在模型组的梗死核心区神经细胞大多数坏死,而缺血半暗带中神经元多出现凋亡,进一步验证了脑梗模型的成功。2.第二部分（1）成功构建并转染过表达HSP70-hom+2437C、T等位基因慢病毒:实验中构建阴性对照病毒,过表达C等位基因慢病毒、过表达T等位基因慢病毒,并将其转染大鼠脑组织。qPCR、Western blot检测过表达C等位基因、T等位基因在脑组织内的表达情况:模型组、生理盐水组和阴性对照病毒之间HSP70-hom mRNA及HSPA1L蛋白水平无明显差异。而与模型组、生理盐水组和阴性对照病毒组相比,过表达C和T等位基因组HSP70-hom mRNA及HSPA1L蛋白含量均增高,差异具有统计学意义（p<0.05）,而C、T等位基因组之间mRNA和蛋白水平的差异无统计学意义（P>0.05）。（2）神经功能缺损评分:大鼠MCAO模型24h后,模型组、生理盐水组和阴性对照病毒组神经功能缺损评分未见明显差异（P>0.05）,与模型组、生理盐水组和阴性对照病毒组相比,过表达C、T等位基因组能明显降低神经功能缺损评分,差异具有统计学意义（P<0.01）。过表达C等位基因组与过表达T等位基因组两组间神经功能缺损评分无明显差异（P>0.05）。（3）TTC染色测梗死面积:各组大鼠MCAO模型24h后脑梗死体积百分比分别为43.28%、43.62%、42.52%、35.60%、30.81%,前三组脑梗死体积无统计学差异（P>0.05）,与前三组相比,转染过表达C、T等位基因后梗死体积缩小,差异具有统计学意义（P<0.05）,且过表达T等位基因组梗死体积比过表达C等位基因组减小更明显（P<0.05）。（4）HE染色观察组织形态学出现的病理改变:过表达C、T等位基因组缺血半暗带神经元胞膜皱缩染色加深、核固缩溶解及碎裂等形态学改变均较前三组减轻、神经元密度明显增高。（5）qPCR、Western blot测定HSPA1L、凋亡相关因子在脑组织内的表达情况:①qPCR实验中与模型组、生理盐水组、阴性对照病毒组相比,转染过表达C、T等位基因后促凋亡因子Bax的mRNA表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;过表达C、T等位基因两组间差异无统计学意义（P>0.05）。②蛋白检测实验中,与模型组、生理盐水组、阴性对照病毒组相比,转染过表达C、T等位基因后促凋亡蛋白Bax的表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与过表达C等位基因组相比,过表达T等位基因组Bax蛋白的降低更明显（P<0.05）。而Bcl-2、cleaved-caspase3 mRNA及蛋白的表达在五组间无明显差异（P>0.05）。[结论]第一部分:1、成功构建大鼠MCAO模型并验证模型制备成功;2、成功从术前准备、术中操作、术后护理各方面对大鼠MCAO模型的构建进行了改良,提高了大鼠MCAO模型的存活率及成模率。第二部分:1、转染过表达HSP70-hom+2437 C、T等位基因降低MCAO大鼠模型神经功能损伤评分、减轻缺血半暗带病理变化、减小梗死体积,且过表达T等位基因的上述作用较过表达C等位基因组更为明显。2.转染过表达HSP70-hom+2437 C、T等位基因可降低大鼠脑组织内促凋亡因子Bax的表达,且在过表达HSP70-hom+2437 T等位基因组中降低更为明显,提示过表达HSP70-hom+2437 C、T等位基因可能通过下调Bax表达来发挥对大鼠MCAO模型的保护作用。
赵坤霄[8]（2020）在《PI3K/AKT和Nrf2通路对糖尿病足细胞氧化损伤与凋亡的影响及肌肽的干预研究》文中研究表明第一部分PI3K/AKT与Nrf2在糖尿病大鼠肾组织中的表达及意义目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最主要的微血管并发症,并且也是终末期肾脏病最常见的病因。DN是以持续性和进行性蛋白尿并伴随肾小球滤过率下降,肾小球毛细血管和肾小管间质受损为主要特征。有研究证实在病变早期,足细胞损伤和丢失是导致蛋白尿的主要原因,而足细胞损伤主要来自高糖诱导发生的氧化应激。氧化应激反应中产生的过量活性氧（reactive oxygen species,ROS）长期蓄积,并激活参与DN发展的相关信号传导途径,导致细胞凋亡、炎症反应、纤维化、衰老等事件发生。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2）是细胞调控氧化应激的关键因子,是清除细胞内过量ROS以抗氧化应激最敏感的信号。它参与了细胞各种生命活动,包括维持氧化还原平衡、增殖、代谢及凋亡。有研究表明磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B,AKT）信号通路可调节Nrf2的活性。AKT磷酸化进一步帮助Nrf2实现核浆穿梭,从而使细胞内源性抗氧化增强。本部分旨在研究糖尿病大鼠肾脏组织中p-AKT、Nrf2蛋白的表达变化,并定位足细胞。初步明确其特点、相互关系及对细胞凋亡、氧化应激的影响,为进一步糖尿病肾病靶点治疗提供分子机制理论基础。方法:健康雄性SD大鼠被随机分为两组,一组为正常对照组（normal control group,NC）,另一组为糖尿病模型组（diabetic group,DM）,每组12只。DM组大鼠按65 mg/kg体重给予腹腔单次注射1%STZ溶液,NC组大鼠给予相当体积的0.1 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射72小时后,取尾静脉血检测血糖。将血糖≥16.7 mmol/L且尿糖阳性（+++～+++）即为糖尿病模型制备成功。两组动物分别于造模制备成功后12周末随机取6只采集标本。处死前予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,心脏取血用于检测血糖、血尿素氮和血肌酐值。打开腹腔取双侧肾脏,切取部分肾组织用OTC包埋,该部分用于冰冻切片免疫荧光染色。部分肾组织放于4%多聚甲醛溶液固定,用于后续HE染色。部分肾皮质用于制备组织匀浆提取蛋白,western blot检测Nox4蛋白的表达。结果:1.相较正常对照组,12W糖尿病大鼠生化指标检测结果显示,血糖、血肌酐和尿素氮水平明显增高（P<0.01）。2.肾组织切片HE染色可见,正常对照组大鼠肾脏结构未见明显改变,糖尿病组可见肾小球体积增大,系膜基质增多,肾小球部分毛细血管管腔狭窄,间质增宽,炎性细胞浸润。3.肾脏组织冰冻切片免疫荧光双染色结果可见,选择足细胞标志蛋白Nephrin对足细胞进行标记,与正常对照组相比较,促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3在糖尿病大鼠肾脏足细胞内表达显着升高。Nrf2、p-AKT在糖尿病大鼠肾脏足细胞内表达显着下降。4.Western blot结果显示,与正常对照组相比较,12周糖尿病大鼠肾脏皮质Nox4蛋白表达水平显着升高（p<0.05）。应用Mito sox red荧光探针检测肾脏组织线粒体内ROS水平,结果显示12周大鼠肾皮质线粒体ROS较正常对照组明显升高。第二部分PI3K/AKT与Nrf2对高糖诱导的足细胞氧化应激和凋亡的影响及机制目的:糖尿病肾病发病机制非常复杂,至今未能明确阐明。近年来大量研究表明,糖尿病肾病中蛋白尿的产生与足细胞的功能和形态学改变密切相关。高血糖诱导足细胞损伤后发生一系列病理改变,主要包括足细胞肥大、足细胞凋亡、足细胞上皮间充质转分化和足细胞脱离。高糖诱导产生的ROS是足细胞损伤触发因素。线粒体是ROS的产生中心,ROS过量产生刺激促凋亡蛋白的转运及线粒体呼吸链细胞色素C的释放,触发诱导线粒体介导的细胞凋亡途径。在多种研究中已被证实,抑癌基因p53作为一种重要的促凋亡蛋白,参与了细胞凋亡的调控。p53能够触发促凋亡基因的表达,例如Puma、Bax、Apaf-l、Noxa。此外,它抑制抗凋亡基因的表达,如Bcl-2家族（Bcl-2,Bcl-X,Bcl-In,Mcl-1）的表达;在p53转录非依赖的细胞凋亡是通过线粒体介导实现的,研究发现在仅细胞浆成分（不含细胞核但包含线粒体）的细胞中,发现p53蛋白能直接介导影响Caspase-3的活化。后续实验中应用免疫沉淀方法去除p53蛋白后,Caspase-3活化被抑制。通过第一部分实验结果,我们推测p-AKT及Nrf2参与了糖尿病的发病及进展,也同时参与了足细胞抗氧化应激和抗凋亡的过程。在本部分实验中,应用体外培养小鼠足细胞进一步观察足细胞PI3K/AKT对Nrf2通路的影响,明确Nrf2是否对高糖环境下足细胞凋亡及p53转录非依赖性信号通路产生影响。方法:1.检测抑制PI3K/AKT对Nrf2通路表达的影响,将足细胞分为正常糖组（5.5mM glucose,normal glucose,NG）、正常糖+LY294002（20μM）、高糖组（30mM glucose,high glucose HG）、高糖+LY294002（20μM）。LY294002预处理2小时,高糖刺激48小时。提取细胞总蛋白及总mRNA,通过 western blot 检测 AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO-1、SOD2、GCLC的蛋白表达。通过 qRT-PCR 检测 Nrf2、HO-1、NQO-1、SOD2、GCLC的mRNA表达。通过western blot检测Nrf2蛋白在细胞核中的表达。通过细胞免疫荧光检测Nrf2在足细胞中的分布情况。2.检测Nrf2-siRNA对Nrf2基因的敲低效果,将分化成熟的足细胞分为空载negtive control组（NC）和转染Nrf2-siRNA（siNrf2）分别培养,于48小时后收集细胞提取总蛋白,并通过western blot进行验证敲低效果。3.检测敲低Nrf2基因或抑制PI3k/AKT通路对高糖环境下足细胞氧化应激的影响。将分化成熟的足细胞分为正常糖组（5.5mM glucose,normal glucose,NG）、高糖组（30mM glucose,high glucose HG）、高糖+siNrf2、高糖+LY294002（20μM）。siNrf2进行转染,LY294002预处理2小时,各组均在高糖刺激48小时。应用荧光探针DCFH-DA染色对细胞内ROS进行检测,Mito sox red荧光探针染色检测线粒体内ROS水平,JC-1荧光探针染色明确线粒体膜电位情况。4.检测敲低Nrf2基因对高糖环境下足细胞凋亡的影响,将分化成熟的足细胞分为正常糖组（5.5mM glucose,normal glucose,NG）、高糖组（30mM glucose,high glucose HG）、高糖+阴性对照（negative control,NC）、高糖+siNrf2。转染成功后高糖刺激48小时。收集细胞提取总蛋白,通过western blot 检测 Bax、Bcl-2、Cytochrome c、Cleaved caspase-3 蛋白的表达。TUNEL染色检测阳性凋亡细胞。5.为了检测敲低Nrf2基因对高糖环境下p53转录非依赖性信号通路的影响,将实验细胞分为正常糖组（5.5mM glucose,normal glucose,NG）、高糖组（30mM glucose,high glucose HG）、高糖+阴性对照（negative control,NC）、高糖+siNrf2。siNrf2转染成功后,在高糖刺激48小时后收集细胞,分别提取总蛋白和细胞核蛋白,通过western blot检测p53的表达。通过Mito tracker red探针检测线粒体形态和细胞免疫荧光,定位p53在线粒体的分布。结果:1.高糖刺激下p-AKT和Nrf2及其下游蛋白表达明显降低。经过LY294002处理后,p-AKT和Nrf2及其下游蛋白表达降低更为显着,具有统计学意义。Nrf2及其下游基因mRNA表达也呈相同的变化趋势。此外,LY294002能够降低高糖刺激下细胞核内Nrf2的蛋白表达（P<0.05）,与Nrf2细胞免疫荧光结果变化一致。2.荧光探针DCFH-DA及Mito sox red染色结果显示,HG组荧光强度明显比NG组增强。与HG组相比,在HG+siNrf2组及HG+LY294002组荧光强度明显增强。JC-1探针染色显示,相较NG组,HG组JC-1绿色荧光则明显增强,经siNrf2及LY294002处理后绿色荧光相较HG组显着增强,红色荧光显着减弱。3.与 HG 组相比,HG+siNrf2 组 Bax/Bcl-2 比值、Cytochrome c 以及Cleaved caspase-3的蛋白表达升高较显着。TUNEL细胞染色也同样提示敲低Nrf2后高糖导致的阳性凋亡细胞数显着升高。4.Western blot结果显示,HG组p53蛋白在细胞质及线粒体中的表达较NG组明显升高。与HG组相比,HG+siNrf2组p53蛋白在线粒体中的表达显着升高。p53细胞免疫荧光与western blot结果一致。Mito tracker red荧光探针染色显示HG组线粒体明显变短,呈现出肿胀、碎片化表现,在HG+siNrf2组较HG组碎片化更为明显。在HG+siNrf2组,p53绿色荧光与Mito tracker red探针呈现的红色荧光所重合成黄色荧光明显增多。第三部分肌肽通过PI3K/AKT与Nrf2通路对高糖诱导的小鼠足细胞氧化应激和凋亡的影响目的:肌肽（Carnosine,CA）是一种内源性二肽,具有缓冲生理酸碱性、螯合金属离子和抗氧化应激、抑制多种炎症因子、抑制AGEs、促进脂质氧化终产物（advancing lipoxidation end products,ALEs）和抑制肾素-血管紧张素系统（RAS）等生物活性。据报道,肌肽可以通过降低血清肌肽酶-1的活性,防止STZ糖尿病大鼠肾小球细胞凋亡和足细胞丢失。通过前两部分研究,PI3K/AKT通路可能是参与肌肽对高糖诱导细胞凋亡保护作用的潜在分子机制。因此,在本部分实验中。我们将就肌肽能否通过PI3K/AKT和Nrf2信号通路干预高糖诱导的小鼠足细胞氧化应激和细胞凋亡进行研究。方法:1.检测肌肽对高糖环境下足细胞活性及氧化应激的影响,将分化成熟的足细胞分为:正常糖组（5.5mM glucose,normal glucose,NG）、高糖组（30mM glucose,high glucose HG）、高糖+肌肽（5mM Carnosine,CA）、高糖+肌肽（10mM Carnosine,CA）、高糖+肌肽（20mM Carnosine,CA）、高糖+肌肽（30mM Carnosine,CA）。各组均在刺激48小时后应用Cell Counting Kit-8实验检测各组细胞活性,荧光探针DCHF-DA和Mito sox red检测各组细胞内和线粒体ROS水平。2.检测肌肽对高糖环境下足细胞凋亡的影响,将分化成熟的足细胞分为:正常糖组（5.5mM glucose,normal glucose,NG）、高糖组（30mM glucose,high glucose HG）、高糖+肌肽（5mMCarnosine,CA）、高糖+肌肽（10mM Carnosine,CA）、高糖+肌肽（20mM Carnosine,CA）。各组均在高糖刺激48小时后收集细胞,提取蛋白后通过western blot检测Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 和 Nephrin 蛋白的表达。TUNEL 染色检测各组凋亡细胞。3.检测肌肽对高糖环境下足细胞PI3K/AKT和Nrf2通路的影响。将分化成熟的足细胞分为:正常糖组（5.5mM glucose,normal glucose,NG）、肌肽（20mM Carnosine,CA）、高糖组（30mM glucose,high glucose HG）、高糖+肌肽（20mM Carnosine,CA）。各组均在高糖刺激48小时后收集细胞,提取细胞总蛋白,通过western blot检测细胞AKT、p-AKT、Nrf2和HO-1的蛋白表达水平。提取细胞核蛋白,检测Nrf2蛋白的表达。应用细胞免疫荧光检测Nrf2在细胞的分布。4.检测抑制PI3K/AKT对Nrf2通路表达及肌肽抑制足细胞凋亡的影响。将分化成熟的足细胞分为:正常糖组（5.5mM glucose,normal glucose,NG）、LY294002（20μM）、高糖组（30mM glucose,high glucose HG）、高糖+肌肽（20mM Carnosine,CA）、高糖+肌肽（20mM Carnosine,CA）+LY294002（20μM）。LY294002预处理细胞2小时,各组均在高糖刺激48小时后收集细胞,提取细胞总蛋白,通过western blot检测细胞AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2 和 Cleaved caspase-3 的蛋白表达水平。TUNEL染色检测各组凋亡细胞。通过qRT-PCR检测Nrf2、HO-1的mRNA表达。5.明确在高糖环境下,足细胞中敲低Nrf2基因或抑制PI3K/AKT通路对肌肽抑制氧化应激和细胞凋亡的影响。将分化成熟的足细胞分为:高糖+肌肽（20mM Carnosine,CA）、高糖+肌肽（20mM Carnosine,CA）+LY294002（20μM）、高糖+肌肽（20mM Carnosine,CA）+siNrf2。LY294002预处理细胞2小时,转染成功后,各组均在高糖刺激48小时后收集细胞。提取蛋白后,应用 western blot 检测细胞 Bax、Bcl-2 和 Cleaved caspase-3的蛋白表达水平。TUNEL染色检测各组凋亡细胞。荧光探针DCHF-DA和Mito sox red检测各组细胞内和线粒体ROS水平。结果:1.高糖环境下,在肌肽浓度为5-20mM范围内,细胞活性呈剂量依赖性上升,在浓度为30mM时呈下降趋势。肌肽（5-20mM）可以降低HG诱导足细胞内和线粒体产生的ROS。2.在肌肽浓度范围为5-20mM内,TUNEL染色显示高糖诱导的足细胞凋亡降低并呈剂量依赖。Bax/Bcl-2比值和Cleaved caspase-3表达均呈剂量依赖性降低,Nephrin蛋白的表达呈剂量依赖性升高。3.高糖环境下,Nrf2、HO-1和p-AKT蛋白的表达相较NG组显着降低,而在HG+CA（20mM）组,Nrf2、HO-1及p-AKT蛋白表达水平较HG组升高。细胞免疫荧光结果显示HG组Nrf2在细胞核的荧光强度显着减弱,在HG+CA（20mM）组显着增强。在HG+CA（20mM）组细胞核Nrf2蛋白的表达明显高于HG组。4.TUNEL染色结果显示LY294002预处理过的HG+CA（20mM）组,凋亡细胞高于 HG+CA（20mM）组。Bax/Bcl-2 比值和 Cleaved caspase-3的表达和TUNEL染色结果一致。经LY294002预处理过的肌肽和高糖共同孵育组相较于HG+CA（20mM）组,Nrf2和HO-1蛋白表达明显降低（P<0.01）。qRT-PCR结果与蛋白表达变化保持一致。5.经siNrf2和LY294002处理后的肌肽和高糖共同孵育组细胞内和线粒体内ROS荧光、凋亡细胞明显增加,Bax/Bcl-2比值和Cleaved caspase-3蛋白表达均明显升高。结论:1.p-AKT、Nrf2在糖尿病大鼠肾足细胞和高糖环境下小鼠足细胞中的表达均降低,且伴随细胞凋亡和氧化应激增加,PI3K/AKT与Nrf2通路可能共同参与了糖尿病肾病中足细胞损伤的发生。2.PI3K/AKT通路可以通过介导Nrf2活化和核转位及下游蛋白HO-1、NQO-1、SOD2和GCLC的表达来抵抗糖尿病肾病中氧化应激的进展3.在高糖环境下足细胞存在线粒体损伤,Nrf2蛋白表达和活性降低以及p53水平增加可能是足细胞线粒体损伤的机制,敲低Nrf2基因后,p53转位线粒体增加,通过线粒体介导的凋亡途径启动细胞凋亡。4.肌肽可以抑制高糖刺激下足细胞的氧化应激和细胞凋亡。
潘政军[9]（2019）在《Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究》文中研究表明研究目的:探讨抑制细胞调亡的B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因（Bcl-xL）对人脐带血干细胞定向诱导分化的影响,观察Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞定向诱导分化以后修复兔关节软骨损伤的疗效。研究内容:（1）人脐带血干细胞的获取,分离培养、定向诱导分化成软骨细胞;（2）慢病毒编码的抑制细胞凋亡基因Bcl-xL转染人脐带血干细胞;（3）检测Bcl-xL基因过表达对干细胞凋亡的影响;（4）检测Bcl-xL基因过表达对干细胞分泌II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3和基质金属蛋白酶3等蛋白的影响;（5）制造兔膝关节软骨损伤模型;（6）海藻酸钠盐支架包被Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞,植入并修复兔软骨损伤;（7）检测植入的人脐带血干细胞是否能在异种动物体内存活;（8）HE、MASSON和改良蕃红O-固绿等染色方法观察软骨缺损的修复;（9）免疫组化、实时PCR、WB等方法检测Bcl-xL基因的表达对动物体内软骨细胞分泌II型胶原、半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3等蛋白影响。材料与方法:（1）在正常分娩过程中获得人脐带血,体外分离获取干细胞,贴壁培养。取P2代细胞用TGF-β1因子联合使用胰岛素样生长因-1和地塞米松诱导干细胞向软骨细胞方向分化,培养至细胞爬满玻片时,用甲苯胺蓝染色和免疫组化染色方法鉴定诱导分化的效果,并与对照组比较。（2）用编码Bcl-xL的慢病毒对人脐带血干细胞进行修饰,取第3代人脐带血干细胞接种于6孔板,当细胞融合达到5070%时,用编码Bcl-xL基因的慢病毒载体转染人脐带血干细胞。实验分四组进行,分别为对照组、诱导组、诱导+Bcl-xL慢病毒转染组、诱导+慢病毒空载组。对照组只分离培养干细胞,不加任何诱导因子;诱导组加入TGF-β1等诱导因子;诱导+Bcl-xL慢病毒转染组是在诱导组的基础上再加入编码Bcl-xL基因的慢病毒;空载组是在诱导组的基础上只加入未编码Bcl-xL基因的慢病毒。以上四组继续培养48h,在倒置显微镜下连续观察并记录细胞形态特征;甲苯胺蓝染色证实Bcl-xL基因转染后的干细胞仍具有软骨细胞的特征;通过流式细胞仪鉴定软骨细胞特征性的表面抗原如:CD90和CD105的表达。通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况,评价Bcl-xL基因对干细胞的凋亡的影响。实时PCR检测Bcl-xL基因在mRNA水平的表达;同时以β-actin为内参;Western blotting（WB）印迹法检测Bcl-xL基因在蛋白水平的表达;实时PCR及WB等方法检测Bcl-xL基因表达及其对II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3、基质金属蛋白酶3等蛋白表达的影响;SPSS17.0软件统计学分析比较各组间mRNA和蛋白水平表达的差异。（3）制备海藻酸钠支架,加入人脐带血干细胞形成细胞-支架复合物。将1.2%的海藻酸钠溶液滴入102m M氯化钙溶液在模具中凝固形成无细胞的海藻酸钠支架;将人脐带血干细胞加入1.2%的海藻酸钠溶液制成1×106/ml的单细胞悬液,滴入102m M氯化钙溶液在模具中凝固形成含人脐带血干细胞的海藻酸钠支架复合物。（4）制造兔软骨损伤模型,30只三个月大的日本大耳兔,分为5组,每组12只膝关节。麻醉后备皮,双侧后腿膝关节内侧切口进入膝关节,在股骨髁关节面用电钻造成一个直径4mm,深度约3mm柱状缺损,穿透软骨下骨,造成全层关节软骨损伤。按照5种不同的方式修复软骨缺损:假手术组（对照组）:只进行假手术,软骨无损伤;模型组:进行软骨损伤造模而未予其它治疗干预措施,然后直接缝合;空载体治疗组:慢病毒空载体转染人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域;干细胞治疗组:未经慢病毒转染的人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域。Bcl-xL基因修饰治疗组:Bcl-xL基因修饰慢病毒转染人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域。饲养8周后全部动物处死,获取膝关节标本。采用抗人细胞核特异性抗体鉴定植入软骨缺损处的干细胞在正常免疫功能的兔体内是否能存活;观察Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞移植治疗关节软骨损伤的效果,用HE、MASSON、改良番红O-固绿等染色方法观察关节软骨损伤的修复效果,用免疫组化、实时PCR及WB等方法检测动物体内Bcl-xL基因的表达及其对II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3等蛋白表达的影响;用SPSS 17.0软件统计学分析比较各组间mRNA和蛋白水平表达的差异。结果:1、人脐带血中可成功分离出具有多向分化潜能的干细胞,并可体外培养、定向诱导分化软骨细胞;2、用编码Bcl-xL的慢病毒对人脐带血干细胞进行修饰,干细胞增殖分化后仍具有软骨细胞特征。干细胞内的Bcl-xL基因在mRNA和蛋白水平的表达均上调;Bcl-xL基因可抑制干细胞的调亡,Bcl-xL基因可促进软骨细胞II型胶原蛋白在mRNA和蛋白水平的表达,显着抑制半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的表达,组间分析具有统计学意义,P<0.05。3、海藻酸钠盐支架-干细胞复合体植入动物体内,检测到干细胞存活;病理染色显示,各组软骨损伤均有修复,3种染色方式均显示:Bcl-xL基因修饰的干细胞组软骨结构修复最满意,而模型组的修复相对最不满意;免疫组化染色、实时PCR和WB检测结果基本一致:软骨损伤促进了II型胶原纤维在mRNA和蛋白水平的表达,而Bcl-xL基因修饰进一步增加了II型胶原纤维的表达;对于半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的检测结果显示:与假手术组比较,模型组的半胱氨酸蛋白酶-3和基质金属蛋白酶3表达均明显上调（P<0.05）,而Bcl-xl基因修饰组人脐带血干细胞相对模型组明显下调。组间分析差异显着（P<0.05）。此外,与正常人脐带血干细胞相比,Bcl-xL修饰的干细胞可进一步降低软骨损伤诱导的半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的表达,提高II型胶原蛋白的表达。结论:1、人脐带血干细胞可定向诱导分化成软骨细胞,Bcl-xL基因修饰可降低干细胞凋亡。2、移植人脐带血干细胞有利于修复软骨损伤,而Bcl-xL修饰则能提高人脐带血干细胞移植修复软骨损伤的疗效。
谢飞[10]（2019）在《慢病毒介导的E1A激活基因阻遏子（CREG）基因对661W细胞光损伤抗凋亡能力影响的实验研究》文中指出目的:将慢病毒介导的CREG基因转染至661W细胞,通过观察过表达CREG基因修饰的661W细胞在光损伤条件下的抗凋亡能力,评价CREG基因对光感受器细胞光损伤时的保护作用,探讨其作用机制。方法:1、培养细胞,对661W细胞株和293T细胞株进行复苏后传代培养、冻存并计数。2、构建慢病毒介导的CREG基因表达载体。3、转染661W细胞,Western blot验证慢病毒介导的CREG基因转染661W细胞的表达;获得慢病毒介导CREG基因稳定转染的CREG661W细胞和GFP空载体对照GFP661W细胞。4、制备CREG661W细胞和GFP661W细胞光损伤模型并将正常的661W细胞(Normal661W)设为正常空白组。5、Hoechst/PI染色法检测各组细胞形态学的改变情况,观察各组细胞形态学上的差异;BCA法测定各组细胞蛋白浓度,蛋白质免疫印迹法检测各组细胞中不同凋亡相关蛋白Caspase3/8/9、Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。6、应用P38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125及ERK抑制剂PD98059预处理各组细胞,Western blot检测光损伤后MAPK凋亡信号通路中关键蛋白P38、JNK、ERK及它们的磷酸化形式的表达量,对蛋白条带灰度值统计和定量分析,从而对CREG基因修饰的661W细胞是否对光损伤诱导的细胞凋亡有抑制作用及其作用机制进行评估。结果:1、pLvx-puro-CREG质粒成功转染至293T病毒包装细胞中且转染效率大于70%。2、慢病毒成功感染至661W细胞中,嘌呤霉素重复筛选后建立稳定的CREG661W细胞系。3、CREG蛋白的Western印迹分析证实了慢病毒介导的E1A激活基因阻遏子（CREG）基因感染的成功。4、细胞形态学检测分析LDCREG661W与其他组LDNormal661W和LDGFP661W相比较,细胞凋亡明显减少（P<0.05）。5、Western blot检测实验各组细胞凋亡相关蛋白的表达水平,光损伤实验组Caspase3/8/9及Bax的蛋白表达量均低于光损伤对照组（P<0.01）,而光损伤实验组Bcl-2的蛋白表达量显着高于光损伤对照组（P<0.01）。6、Western blot检测抑制剂预处理CREG661W细胞显示JNK、P38、ERK磷酸化与非磷酸化蛋白比值表达量较对照组有不同程度的降低,p-JNK/JNK及p-P38/P38相比差异较显着,p-ERK/ERK相比次之（P<0.05）。结论:1、通过慢病毒介导的CREG基因转染661W细胞可获得稳定转染的CREG661W细胞系。2、携带CREG基因的视网膜光感受器样细胞(CREG661W细胞)抑制光损伤凋亡能力明显增强。3、MAPK信号通路中的JNK及P38是抑制视网膜光损伤感光细胞凋亡的关键信号通路。
二、bcl-2基因对血管内皮细胞保护作用的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、bcl-2基因对血管内皮细胞保护作用的研究（论文提纲范文）
（1）沉默LMP2基因对OGD/R大鼠脑微血管内皮细胞血脑屏障蛋白表达影响（论文提纲范文）
| 附录 主要中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 一、沉默LMP2基因对OGD/R条件下大鼠脑微血管内皮细胞血脑屏障蛋白表达影响 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 目的 |
| 1.3 材料和方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 二、沉默β-catenin基因对OGD/R条件下RBMVECs血脑屏障蛋白表达影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 目的 |
| 2.3 材料和方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 本研究的创新性和局限性 |
| 综述 急性脑缺血后血脑屏障损伤的分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果与荣誉 |
| 致谢 |
（2）Nrf2-ARE信号通路抵御小鼠乳腺氧化应激的分子机制及槲皮素对其调控研究（论文提纲范文）
| 主要缩略语与符号一览表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 乳腺氧化应激与炎症 |
| 1 氧化应激的定义 |
| 2 引起乳腺氧化应激的因素 |
| 3 乳腺氧化应激与乳腺炎 |
| 4 乳腺氧化应激研究模型 |
| 第二节 乳腺氧化应激的防治措施 |
| 1 动物与饲养管理 |
| 2 常规饲料添加剂 |
| 3 生物活性物质 |
| 第三节 机体抗氧化防御系统及其作用机制 |
| 1 抗氧化防御系统 |
| 2 抗氧化相关信号通路 |
| 第四节 本研究的目的、意义与内容 |
| 1 本研究的目的与意义 |
| 2 主要研究内容 |
| 第二章 Nrf2 基因敲除对小鼠生长繁殖和乳腺健康的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 Nrf2-ARE信号通路抵御小鼠乳腺氧化损伤的作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 Nrf2-ARE通路介导槲皮素抵御乳腺上皮细胞氧化损伤的作用机制 |
| 第一节 槲皮素抵御乳腺上皮细胞氧化损伤的作用效果 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 Nrf2-ARE通路介导槲皮素抵御乳腺上皮细胞氧化损伤的分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 综合讨论 |
| 提示、创新点和研究展望 |
| 1 提示 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）HSP70调控Bcl-2/Bax对缺氧性肺高压新生大鼠肺血管内皮细胞凋亡及肺动脉压力的作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 样本含量 |
| 1.3 分组 |
| 2 主要仪器与试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 转染携带HSP70 的腺病毒至肺组织 |
| 3.2 构建HPH新生大鼠模型 |
| 3.3 评价HPH新生大鼠模型 |
| 3.4 观察携带绿色荧光的腺病毒在肺组织中的定位 |
| 3.5 观察肺血管内皮细胞凋亡变化情况 |
| 3.6 免疫组织测定肺组织HSP70、Bcl-2及Bax的表达 |
| 4 质量管理 |
| 4.1 选择实验新生大鼠的质量管理 |
| 4.2 构建新生大鼠HPH模型的质量管理 |
| 4.3 转染腺病毒HSP70 至新生大鼠肺组织的质量管理 |
| 4.4 测定新生大鼠右心室收缩压的质量管理 |
| 4.5 采集肺组织标本的质量管理 |
| 4.6 制作冰冻切片、石蜡切片的质量管理 |
| 4.7 免疫组化方法的质量管理 |
| 5 统计学分析 |
| 6 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 Notch信号通路在新生儿缺氧性肺动脉高压发病机制中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 新疆医科大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（4）基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化 |
| 1.1 氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化关系 |
| 1.2 氧化型低密度脂蛋白对血管内皮细胞的影响 |
| 1.2.1 氧化型低密度脂蛋白与内皮功能异常 |
| 1.2.2 氧化型低密度脂蛋白促内质网应激与内皮细胞凋亡 |
| 1.3 氧化型低密度脂蛋白对血管炎症细胞的影响 |
| 1.4 氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞的影响 |
| 2.抗动脉粥样硬化药物研究进展 |
| 2.1 他汀类药物在抗动脉粥样硬化治疗中的应用 |
| 2.2 人参皂苷Rg3抗动脉粥样硬化作用研究进展 |
| 2.3 药物联合应用治疗动脉粥样硬化 |
| 第二章 人参皂苷Rg3对ox-LDL诱导内皮功能异常的作用及机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液及配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 HUVECs的培养、传代和冻存 |
| 2.2 THP-1的培养、传代和冻存 |
| 2.3 Ox-LDL损伤HUVECs最佳浓度的确定 |
| 2.4 Rg3对HUVECs生存率的影响 |
| 2.5 Rg3对ox-LDL损伤HUVECs生存率的作用 |
| 2.6 划痕实验 |
| 2.7 THP-1细胞黏附实验 |
| 2.8 Transwell实验 |
| 2.9 免疫荧光检测 |
| 2.10 qPCR检测炎症因子表达的影响 |
| 2.11 Western Blot |
| 2.12 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 Ox-LDL损伤HUVECs最佳浓度 |
| 3.2 Rg3对HUVECs生存率的影响 |
| 3.3 Rg3对ox-LDL降低HUVECs细胞生存率的作用 |
| 3.4 Rg3对ox-LDL损伤HUVECs愈合能力的改善作用 |
| 3.5 Rg3对ox-LDL诱导THP-1对HUVECs黏附的抑制作用 |
| 3.6 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的影响 |
| 3.7 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs FAK磷酸化的影响 |
| 3.8 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs内MMP-2及MMP-9表达的影响 |
| 3.9 Rg3对ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表达的影响 |
| 3.10 GW9662抑制PPARγ表达的浓度确定 |
| 3.11 GW9662和Rg3对ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表达的作用 |
| 3.12 GW9662和Rg3对ox-LDL导致HUVECs迁移抑制、THP-1黏附及相关信号通路的作用 |
| 4.小结 |
| 第三章 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 瑞舒伐他汀对HUVECs生存率的影响 |
| 2.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL损伤HUVECs生存率的作用 |
| 2.3 试剂盒检测NO和氧化应激水平 |
| 2.4 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡 |
| 2.5 DAPI染色 |
| 2.6 qPCR检测 |
| 2.7 Western Blot |
| 2.8 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 瑞舒伐他汀对HUVECs生存率的影响 |
| 3.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL导致HUVECs损伤的改善作用 |
| 3.3 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECs NO分泌的影响 |
| 3.4 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导HUVECs氧化应激的影响 |
| 3.5 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECse NOS磷酸化的影响 |
| 3.6 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECs PI3K/Akt磷酸化的影响 |
| 3.7 瑞舒伐他汀对各组细胞Bcl-2/Bax表达的影响 |
| 3.8 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导HUVECs凋亡的影响 |
| 3.9 瑞舒伐他汀对各组HUVECs内CHOP、sXBP1及Caspase-12 mRNA水平的影响 |
| 3.10 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导的HUVECs内质网应激的影响 |
| 4.小结 |
| 第四章 人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀联合应用对高脂饮食诱导的ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化作用研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 动物的饲养 |
| 2.3 动脉粥样硬化模型复制及给药 |
| 2.4 血脂四项指标检测 |
| 2.5 Elisa试剂盒检测小鼠血清CRP水平 |
| 2.6 小鼠主动脉分离及主动脉大体油红O染色 |
| 2.7 HE及MASSON染色 |
| 2.8 免疫组织化学及免疫荧光染色 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 药物对AS小鼠体重及一般状态的影响 |
| 3.2 药物对AS斑块水平对影响 |
| 3.3 药物对AS小鼠血清脂蛋白水平的影响 |
| 3.4 药物对AS小鼠血清CRP水平的影响 |
| 3.5 药物对AS小鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响 |
| 3.6 药物对AS小鼠主动脉纤维斑块层及胶原纤维水平的影响 |
| 3.7 药物对AS小鼠主动脉CD68及α-SMA表达的影响 |
| 4.小结 |
| 第五章 讨论 |
| 1.体外实验研究 |
| 1.1 Rg3对ox-LDL诱导内皮功能异常的作用及机制研究 |
| 1.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究 |
| 2.体内实验研究 |
| 2.1 Rg3与瑞舒伐他汀联用对AS小鼠血清脂蛋白水平的影响 |
| 2.2 Rg3与瑞舒伐他汀联用对AS小鼠血清CRP水平的影响 |
| 2.3 Rg3与瑞舒伐他汀联用对ApoE~(-/-)小鼠AS病理改变的影响 |
| 结论及创新点 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得科研成果 |
| 致谢 |
（5）敲降Bmal1基因对人脐静脉内皮细胞自噬和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| (一) 实验细胞 |
| (二) 主要试剂 |
| (三) 主要仪器 |
| 二、实验方法 |
| (一) 人脐静脉内皮细胞的培养 |
| (二) 细胞不同处理方式 |
| (三) MTT测定细胞活性 |
| (四) Western blot |
| (五) 实时荧光定量PCR |
| (六) Hoechst染色检测细胞凋亡 |
| (七) 单丹磺酰尸胺染色检测细胞自噬 |
| (八) ROS活性氧检测 |
| (九) 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 一、Bmal1基因在HUVEC中的昼夜节律性表达 |
| 二、不同时间点Bmal1基因的敲降效率 |
| 三、Bmal1基因敲降对血管内皮细胞活性的影响 |
| 四、Bmal1敲降对血管内皮细胞自噬的影响 |
| 五、Bmal1基因敲降对内皮细胞凋亡的影响 |
| 六、Bmal1基因敲降对活性氧(ROS)表达水平的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 生物钟紊乱对疾病的产生和细胞程序性死亡的影响 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 读研期间学术会议交流 |
| 致谢 |
（6）针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 针刺治疗心肌缺血及相关分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（7）大鼠脑梗死模型制备的优化及HSP70-hom+2437基因多态性对脑梗死模型作用机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分: 大鼠脑梗死模型的制备及优化 |
| 前言 |
| 材料方法与技术路线 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分: HSP70-hom+2437基因多态性对大鼠MCAO模型的作用的机制研究 |
| 前言 |
| 材料方法与技术路线 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 CD93在脑梗死中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）PI3K/AKT和Nrf2通路对糖尿病足细胞氧化损伤与凋亡的影响及肌肽的干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 PI3K/AKT与Nrf2在糖尿病大鼠肾组织中的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PI3K/AKT与Nrf2对高糖诱导的小鼠足细胞氧化应激和凋亡的影响和机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肌肽通过PI3K/AKT与Nrf2通路对高糖诱导的小鼠足细胞氧化应激和凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 糖尿病肾病足细胞损伤机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人脐带干细胞定向诱导分化软骨细胞的实验研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二部分 过表达Bcl-x L基因慢病毒载体对人脐带血干细胞的调控机理研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 海藻酸钠支架负载人脐带血干细胞复合物移植治疗兔关节软骨损伤 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间发表的论文与成果 |
| 致谢 |
| 综述一 Bcl-x L 基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 干细胞定向诱导分化成软骨细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
（10）慢病毒介导的E1A激活基因阻遏子（CREG）基因对661W细胞光损伤抗凋亡能力影响的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 药物及试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 培养细胞 |
| 3.2 慢病毒介导的CREG基因表达载体的构建 |
| 3.2.1 慢病毒包装 |
| 3.2.2 病毒感染、筛选及建立稳定细胞系 |
| 3.3 CREG基因感染661W细胞表达的检测 |
| 3.4 661W细胞光损伤模型的制备与分组 |
| 3.4.1 661W细胞光损伤实验模型的制备 |
| 3.4.2 实验分组 |
| 3.5 检测各组细胞形态学的改变及差异 |
| 3.5.1 Hoechst/PI染色法检测细胞凋亡 |
| 3.6 Western blot检测各组相关凋亡蛋白的表达 |
| 3.6.1 细胞蛋白样品的制备 |
| 3.6.2 细胞蛋白浓度的测定 |
| 3.6.3 Western blot检测 |
| 3.7 数据的处理与分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 慢病毒载体包装于293T细胞后转染效率的检测结果 |
| 4.2 慢病毒感染、筛选结果 |
| 4.3 CREG蛋白的表达效果 |
| 4.4 正常与光照状态下细胞形态学的染色结果 |
| 4.5 Western blot检测各组凋亡相关蛋白的表达量 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 人E1A激活基因阻遏子的生物学功能及其对细胞凋亡的抑制作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、bcl-2基因对血管内皮细胞保护作用的研究（论文参考文献）
- [1]沉默LMP2基因对OGD/R大鼠脑微血管内皮细胞血脑屏障蛋白表达影响[D]. 万绍芬. 福建医科大学, 2021
- [2]Nrf2-ARE信号通路抵御小鼠乳腺氧化应激的分子机制及槲皮素对其调控研究[D]. 李泳欣. 浙江大学, 2021(02)
- [3]HSP70调控Bcl-2/Bax对缺氧性肺高压新生大鼠肺血管内皮细胞凋亡及肺动脉压力的作用研究[D]. 赵倩. 新疆医科大学, 2021(09)
- [4]基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究[D]. 耿嘉男. 吉林大学, 2020(01)
- [5]敲降Bmal1基因对人脐静脉内皮细胞自噬和凋亡的影响[D]. 屈雅欣. 苏州大学, 2020(02)
- [6]针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究[D]. 李记泉. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [7]大鼠脑梗死模型制备的优化及HSP70-hom+2437基因多态性对脑梗死模型作用机制的研究[D]. 谢灵芝. 昆明医科大学, 2020(02)
- [8]PI3K/AKT和Nrf2通路对糖尿病足细胞氧化损伤与凋亡的影响及肌肽的干预研究[D]. 赵坤霄. 河北医科大学, 2020(01)
- [9]Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究[D]. 潘政军. 安徽医科大学, 2019(07)
- [10]慢病毒介导的E1A激活基因阻遏子（CREG）基因对661W细胞光损伤抗凋亡能力影响的实验研究[D]. 谢飞. 内蒙古民族大学, 2019(01)