一、树突状细胞在抗原特异性皮炎中的作用（论文文献综述）
张颖[1]（2021）在《力学特性对肿瘤免疫响应影响的建模分析》文中认为癌症仍然被认为是全球范围内主要的死亡原因。癌症的发展与进化涉及到多种细胞群和细胞外环境之间跨越多个空间和时间尺度的复杂过程。免疫系统是肿瘤生物学的关键调节剂,是免疫应答以及免疫反应的重要系统,具有支持或抑制肿瘤发展,生长,侵袭和转移的能力。然而,由于肿瘤细胞具有较低的免疫特性,可以让肿瘤细胞能够有效的逃避免疫系统的识别以及清除。因此,通过研究影响肿瘤-免疫系统间相互作用的因素,了解肿瘤免疫系统的三种状态:肿瘤被免疫系统清除、肿瘤与免疫系统间达到平衡状态以及肿瘤细胞发生逃逸。至今,已有许多研究设计了数学计算模型以及实验来描述影响肿瘤生长和肿瘤免疫系统的生物学机制。研究结果表明肿瘤生长及进展与细胞和肿瘤微环境中的力学特性有着密不可分的关系。细胞外基质硬度,细胞间粘附力大小以及免疫检查点的变化往往与肿瘤的发展及扩散情况相关联。本文基于Cellular Potts Model的理论建立数学模型,通过数学建模方式分析研究了细胞间的力学特性对于肿瘤自身进展以及肿瘤和适应性免疫系统之间交互作用的影响。第二章中,通过建立细胞刚度以及细胞-ECM间黏附力对迁移影响的模型,研究了细胞外基质的动态变化对肿瘤细胞与基质间黏附力大小的影响,模拟结果表明肿瘤细胞的迁移速度与ECM刚度存在双相依赖性,ECM刚度的增加促进肿瘤细胞在较低刚度下的迁移。但在刚度较大的ECM上,肿瘤细胞需要聚集足够数量的整合素,增加的整联蛋白的表达会增加表面张力和细胞-ECM的黏附能。所以ECM刚度的进一步增加抑制了肿瘤细胞的迁移。在第三章中,我们加入了肿瘤免疫反应模型,通过结合肿瘤细胞进展以及免疫发展,建立肿瘤细胞与免疫细胞间的交互作用,利用该模型研究了免疫检查点如何影响细胞间的相互作用以及细胞间的粘附力变化对于肿瘤在免疫反应过程中的影响。结果表明,免疫检查点CTLA-4会通过作用T细胞的下游信号通路,影响细胞间粘附力的大小,有利于肿瘤细胞免疫逃逸的发生。
蒙玉娇[2]（2021）在《清热除湿汤及活性成分对特应性皮炎小鼠与肥大细胞的调控作用和机制探讨》文中进行了进一步梳理研究背景特应性皮炎（Atopic dermatitis,AD）为常见的慢性炎症性皮肤疾病,临床表现为剧烈瘙痒、渗出倾向和湿疹样皮损,常高概率出现过敏性鼻炎、哮喘、食物过敏等特应性表现。目前AD儿童患病率已经超过20%,成人患病率为3%～5%,随着城市化发展,发病率呈逐年上升趋势,给患者和家庭带来巨大负担。AD治疗药物集中于糖皮质激素类、抗组胺类、钙调磷酸酶抑制剂和生物制剂,或价格昂贵,或长期使用可引发皮肤萎缩、色素沉着、停药复发和药物依赖等副作用。AD在中医属“奶癣”“血风疮”范畴,历代医家认为该病由于先天禀赋不足、胎毒遗热,素体偏盛;或后天脾土不足,健运失常,湿热内蕴,外感风、湿、热邪,内外合邪,相搏于皮肤而发病。中医皮外科泰斗赵炳南先生认为内在湿热与湿热外邪相搏结,为本病实质,“湿”邪贯穿始终,湿性重浊,难于去除,久之则湿郁化热,湿热二邪互为因果,导致迁延难愈。赵炳南教授根据三十余年临床经验将“龙胆泻肝汤”化裁得清热除湿汤（Qingre Chushi decoction,QRCSD）,治疗AD急性期,湿热雍盛、蕴结皮肤、热重于湿的湿热证,有效改善AD发作期患者皮损表现,减轻渗出、糜烂和瘙痒,且安全、有效。中药复方治疗疾病具有多成分、多靶点和多通路特点,机制探索往往举步维艰。为了实现复方优化,采用药物分子、基因和蛋白网络药理学分析,通过现代生物信息学技术,揭示中药复方的有效成分及对机体网络的调控作用。AD的发病与遗传背景、环境刺激、皮肤屏障功能、机体免疫和细菌感染等密切相关,作为过敏性炎症性皮肤疾病,肥大细胞的效应地位不可取代,在受到刺激后活化脱颗粒,释放大量炎症介质,趋化炎症细胞,引起毛细血管扩张、增加血管通透性,引起组织损伤,出现红斑、水肿、糜烂、渗出和瘙痒等表现,与“湿热搏结于皮肤”引发的皮损表现不谋而合。肥大细胞在AD患者皮损部位检测有明显升高,并且活化脱颗粒比例升高。目前尚无QRCSD及活性成分对肥大细胞活化脱颗粒作用的文献报道。本研究首先建立不同品系AD小鼠模型并进行评价,为后续模型选择提供依据;再运用体内外实验,多角度阐述QRCSD在治疗AD小鼠模型和调控肥大细胞脱颗粒的作用;接下来通过网络药理学探索QRCSD活性成分和治疗AD的“成分-疾病-靶点”网络,为中药复方的作用机制探索指明方向;最后观察有效成分对AD小鼠模型和肥大细胞活化脱颗粒的作用,以期为后续组方优化研究和临床应用提供理论基础和方向。研究目的1.采用不同品系小鼠建立AD模型并进行比较,为后续模型选择和应用提供依据。2.评价QRCSD对AD小鼠模型和肥大细胞脱颗粒模型的干预作用。3.挖掘QRCSD活性成分和治疗AD的潜在靶点,为机制研究提供方向。4.评价QRCSD有效活性成分对AD小鼠模型的干预作用,结合靶点预测,对可能作用机制进行验证,明确QRCSD有效活性成分和作用环节,为QRCSD组方优化和临床疗效提供理论支持。5.评价QRCSD有效活性成分对肥大细胞活化脱颗粒的干预作用,靶向信号通路,明晰有效活性成分发挥作用的可能分子机制,丰富活性成分的药效学研究,为医学转化和临床治疗新策略的提出提供新思路。研究方法实验一:采用Nc/Nga小鼠与BALB/c小鼠,背部/耳部涂抹DNCB的方式建立AD模型并进行比较和评价。12只Nc/Nga小鼠随机分为2组,每组6只,分别为正常对照组和模型组,模型组小鼠采用背部和耳部涂抹DNCB的方式建立AD模型,第1周1～3d,每日连续背部（耳部）涂抹1%（0.5%）DNCB激发炎症反应,休息4d;在第2周和第3周,每周背部（耳部）涂抹0.5%（0.25%）DNCB 3次,维持皮肤炎症反应,造模第22d取材。12只BALB/c小鼠随机分为2组,每组6只,分别为正常对照组和模型组,模型组小鼠第1周的第1、4、7d各组小鼠背部涂抹1%DNCB溶液100μl,或右耳部涂抹0.5%DNCB溶液20μl,进行致敏,第2周休息,第3周开始,隔天背部涂抹0.25%DNCB溶液100μl,或右耳部涂抹0.25%DNCB溶液20μl,激发和维持背部皮肤炎症反应,持续2周,造模第29d取材。正常对照组均在相同时间点同位置涂抹等量基质。观察指标:（1）观察小鼠一般情况、搔抓行为和炎症程度评分;（2）HE染色、甲苯胺蓝染色观察小鼠皮损病理形态学变化;（3）ELISA法检测血清中IgE、IL-4和IFN-γ水平;（4）计算脾指数并采用流式细胞术检测脾脏Th1/Th2比例。实验二:采用Nc/Nga小鼠建立AD模型,观察QRCSD对AD的作用;采用IgE和C48/80分别刺激诱导RBL-2H3和P815建立肥大细胞活化脱颗粒模型,研究QRCSD对肥大细胞活化的影响。48只Nc/Nga小鼠随机分为6组,每组8只,分别为正常对照组、模型组、泼尼松龙（阳性药）组、QRCSD高、中、低剂量组。除正常对照组,其他组小鼠采用背部和耳部涂抹DNCB的方式建立AD模型,第1周1～3d,每日连续背部（耳部）涂抹1%（0.5%）DNCB激发炎症反应,休息4d;在第2周和第3周,每周背部（耳部）涂抹0.5%（0.25%）DNCB 3次,维持皮肤炎症反应。从第2周起,治疗组小鼠给予对应药物灌胃治疗,正常对照组、模型组给予等体积蒸馏水,每天1次,造模第22d取材。观察指标:（1）观察小鼠一般情况和皮损表现并评分;（2）HE染色、甲苯胺蓝染色观察小鼠皮损病理形态学变化;（3）ELISA法检测血清中IgE水平;（4）免疫组化法检测皮损中紧密连接跨膜蛋白Claudin-1（CLDN1）和Occludin（OCLN）表达水平;（5）多因子蛋白芯片技术检测皮损中40种相关炎症因子差异表达;（6）qPCR法验证差异表达因子转录水平mRNA表达情况;（7）采用IgE和C48/80两种方法分别诱导RBL-2H3和P815肥大细胞脱颗粒模型;（8）采用CCK-8法检测QRCSD的细胞毒性,根据细胞活力筛选QRCSD安全浓度。（9）ELISA法检测QRCSD对活化肥大细胞上清中β-氨基己糖苷酶（β-HEX）、组胺（HIS）、IL-4和TNF-α释放水平的影响。实验三:通过数据库挖掘（Drug Bank、OMIM、Gene Cards等）和文献检索的方式,获得炎症性皮肤疾病（关键词为银屑病、特应性皮炎、湿疹、炎症）的靶点交集,构建相关靶点数据库。利用TCMSP数据库获取QRCSD有效化合物和靶标基因,根据药物分子ADME性质,结合QRCSD组方配伍,筛选QRCSD水煎剂有效成分。通过QRCSD靶标基因与炎症性皮肤疾病靶标交集,获得QRCSD-疾病靶点,构建PPI网络,绘制蛋白互作网络。利用DAVID数据库可视化分析核心靶点,并通过GOBP分析和KEGG富集,获得QRCSD治疗炎症性皮肤疾病信号通路,揭示QRCSD治疗AD的可能机制,并解析分析结果。实验四:采用BALB/c小鼠建立AD模型验证清热除湿汤有效成分龙胆苦苷（Gentiopicroside）、黄芩苷（Baicalin）和木犀草素（Luteolin）治疗AD的作用和机制。66只雄性BALB/c小鼠随机分为11组,每组6只,分别为正常对照组,模型组,泼尼松龙（阳性药）组,龙胆苦苷高、中、低剂量组,黄芩苷高、中、低剂量组,木犀草素高、中、低剂量组。除正常对照组,60只BALB/c小鼠第1周的第1、4、7d各组小鼠背部涂抹1%DNCB溶液100μl,或右耳部涂抹0.5%DNCB溶液20μl,进行致敏,第2周休息,第3周开始,隔天背部涂抹0.25%DNCB溶液100μl,或右耳部涂抹0.25%DNCB溶液20μl,激发和维持背部皮肤炎症反应,持续2周,造模第29d取材。从第3周起,治疗组小鼠给予对应药物灌胃治疗,正常对照组、模型组给予等体积蒸馏水,每天1次,造模第22d取材。观察指标:（1）观察小鼠一般情况和皮损表现并评分;（2）HE染色、甲苯胺蓝染色观察小鼠皮损病理变化;（3）ELISA法检测血清中IgE水平;（4）流式细胞术检测脾脏中Th1/Th2比例;（5）qPCR法检测皮损中炎症因子IL-4、IL-5、IL-6和IL-17mRNA表达水平;（6）Western blot法检测皮损组织中MAPK信号通路蛋白（p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK）表达水平。实验五:采用IgE和C48/80分别刺激诱导RBL-2H3和P815建立肥大细胞活化脱颗粒模型,研究Gent对肥大细胞活化的影响,对可能机制进行探索。（1）采用IgE和C48/80两种方法分别诱导RBL-2H3和P815肥大细胞脱颗粒模型。（2）采用CCK-8法检测Gent的细胞毒性,根据细胞活力筛选Gent安全浓度。（3）ELISA法检测Gent对活化肥大细胞上清中β-氨基己糖苷酶（β-HEX）、组胺（HIS）、IL-4和TNF-α释放水平的影响。（4）qPCR法检测Gent对活化肥大细胞炎症因子IL-4和TNF-α mRNA表达水平的影响。（5）Western blot法检测Gent对活化肥大细胞MAPK信号通路蛋白（p-p38/p38,p-ERK/ERK）表达的影响。研究结果实验一:Nc/Nga小鼠和BALB/c小鼠涂抹DNCB后,均逐步出现湿疹样皮损、水肿和渗出,并且随着时间的推移而加重,红斑、痂皮陆续出现,有瘙痒搔抓表现,均与AD的临床表现相符。组织病理显示,模型组小鼠炎性细胞浸润明显,表皮厚度增加,肥大细胞数目增加,与AD皮损病理特点一致。模型组小鼠脾指数升高明显,脾脏Th1/Th2比例失衡,以Th2型为主,ELISA结果显示,模型组小鼠血清IgE、IL-4和IFN-γ水平升高。Nc/Nga小鼠与BALB/c小鼠皮损表现相比,Nc/Nga小鼠皮损表现更早出现,红斑更明显,但差异无统计学意义。实验二:与正常对照组比较,模型组小鼠皮肤出现红斑、糜烂、皮肤增厚等AD样皮损表现,伴随搔抓次数增加（P<0.005）。与模型组比较,QRCSD治疗组小鼠皮损症状均有所缓解,SCORAD评分降低,表皮层厚度减少,肥大细胞浸润减少（P<0.05）,且以QRCSD高剂量组疗效最为明显。免疫组化结果显示模型组小鼠紧密连接蛋白（OCLN、CLDN1）表达水平下降,QRCSD高剂量组紧密连接蛋白水平升高（P<0.05）。模型组小鼠血清IgE水平升高,脾指数升高,脾脏Th1/Th2比例失衡（降低）,QRCSD高剂量治疗可降低IgE表达,降低脾指数,扭转Th1/Th2比例失衡状态（P<0.05）。与正常对照相比,多因子蛋白芯片检测显示模型组皮损部位差异表达因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-17和Eotaxin等,且IL-4和IL-6mRNA相对表达升高（P<0.05）,QRCSD高剂量组能抑制炎症因子IL-4和IL-6在分泌水平和基因转录水平的表达（P<0.05）。CCK-8法筛选QRCSD安全浓度范围为0～2000mg/ml,QRCSD可以抑制肥大细胞炎症介质（β-HEX、HIS）释放水平,且呈剂量依赖性。实验三:通过数据挖掘获得OB≥30%和DL≥0.18的QRCSD化合物75个,中药潜在靶标蛋白100个,与炎症性皮肤疾病（银屑病、特应性皮炎、湿疹、炎症）取交集,获得AD相关靶标19个,构建QRCSD-疾病-靶点可视化网络,获得排名前10位的靶点如下:PTGS2、BCL2、MAPK8、TNF、AKT1、TP53、IL6、CASP3、ICAM1 和NFKBIA,表明这些靶点在AD免疫失衡和炎症反应的病理过程发挥作用。基于DAVID数据库靶点生物信息学分析发现QRCSD主要参与调控炎症反应、调节免疫效应过程和对抗原刺激的炎症反应等。通过GOBP和KEGG富集分析可知,MAPK信号通路是QRCSD治疗AD参与的重要信号通路之一。同时,结合QRCSD组方配伍,获得有效活性成分包括龙胆苦苷、黄芩苷和木犀草素等。实验四:与正常对照组比较,模型组小鼠皮肤出现红斑、糜烂、皮肤增厚等AD样皮损表现,伴随搔抓次数增加（P<0.005）。与模型组比较,龙胆苦苷、黄芩苷和木犀草素各组小鼠皮损症状均有所缓解,SCORAD评分降低,表皮层厚度减少,肥大细胞浸润减少（P<0.05）,均以高剂量组疗效最为明显,且龙胆苦苷效果最佳。流式检测显示龙胆苦苷组Th1/Th2比例升高（P<0.05）,qPCR结果龙胆苦苷组能抑制炎症因子IL-4和IL-6 mRNA表达（P<0.05）。Western blot显示AD小鼠皮损组织中p-ERK和p-p38表达水平升高（P<0.05）,龙胆苦苷可抑制p-ERK和p-p38表达水平（P<0.05）,但p-JNK表达无差异（P>0.05）。实验五:IgE诱导RBL-2H3细胞脱颗粒模型条件为:DNP-IgE单抗（100μg/ml）过夜,DNP-BSA（500μg/ml）,刺激时间为1h;C48/80诱导P815细胞脱颗粒模型条件为:10μg/ml,刺激时间为30min。肥大细胞活化脱颗粒后,与不处理的空白对照组细胞相比,上清中β-HEX、HIS、IL-4和TNF-α的释放水平升高,细胞IL-4和TNF-αmRNA表达增加,p38/ERK MAPK信号通路蛋白磷酸化水平增强（P<0.05）。Gent对RBL-2H3的生物安全浓度为0～100μM,对P815的生物安全浓度范围为0～200μM,此范围内无细胞毒性。100μMGent可抑制RBL-2H3肥大细胞脱颗粒,减少脱颗粒细胞上清中β-HEX、HIS、IL-4和TNF-α的释放水平（P<0.05）,降低活化肥大细胞炎症因子IL-4和TNF-α mRNA表达（P<0.05）,且p38/ERKMAPK通路蛋白磷酸化水平（P<0.05）。200μMGent可抑制P815肥大细胞脱颗粒,减少脱颗粒细胞上清中β-HEX、HIS、IL-4和TNF-α的释放水平（P<0.05）,并且能够降低肥大细胞炎症因子IL-4和TNF-α mRNA表达（P<0.05）,抑制ERK通路蛋白的磷酸化。结论1.采用Nc/Nga小鼠与BALB/c小鼠均可构建AD模型,并且皮损表现符合临床特征;但Nc/Nga小鼠皮损出现时间早,红斑更明显,存在遗传背景,可用于对AD遗传因素的研究。而BALB/c小鼠价格低、来源广,可被广泛应用。在后续研究中可根据需求选择模型。2.QRCSD能显着改善DNCB诱导Nc/Nga小鼠AD湿疹样皮损,减轻水肿、渗出和瘙痒,减少肥大细胞浸润,减轻表皮厚度,降低血清IgE水平,修复皮肤屏障,降低脾指数,改善Th1/Th2免疫失衡,抑制皮损中炎症因子表达;QRCSD能改善肥大细胞脱颗粒,抑制炎症介质释放,明确QRCSD抑制炎症和免疫调控功能。3.龙胆苦苷、黄芩苷和木犀草素可显着改善DNCB诱导BALB/c小鼠AD湿疹样皮损,减轻水肿、渗出和瘙痒,减少肥大细胞浸润,减轻表皮增厚,以龙胆苦苷效果最佳。龙胆苦苷可降低血清IgE水平,抑制皮损中炎症因子表达,明确了龙胆苦苷对AD的治疗作用,并且可能通过抑制p38 MAPK和ERK信号通路活化,达到抑制炎症、调节免疫的目的。4.龙胆苦苷对IgE和C48/80两种途径诱导的RBL-2H3和P815肥大细胞活化脱颗粒反应均具有抑制作用,能降低炎症介质的释放,并可抑制MAPK家族（p38和ERK）蛋白磷酸化水平,这可能是其治疗AD的机制之一,丰富了龙胆苦苷的抗炎、抗过敏和免疫调节作用,并且为治疗与AD发病机制类似的免疫炎症性、过敏性皮肤疾病提供思路。
张颖慧[3]（2021）在《粘蛋白MUC1在结肠癌中诱导免疫抑制的作用机制研究》文中提出[目的]粘蛋白Mucin1（MUC1）在结肠癌中表达高低与肿瘤的进展阶段和患者预后相关,表达上调表明疾病处于晚期阶段且提示预后较差。MUC1的过表达和异常糖基化可促进肿瘤细胞的增殖,同时MUC1相关的唾液酸（Mucin-associated sialyl-Tn）抗原与树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞上存在的多种受体结合,通过抑制免疫细胞的抗肿瘤效应有助于肿瘤细胞逃避免疫监视。我们通过比较MUC1阳性和阴性的结肠癌细胞在野生型和免疫缺陷型小鼠上的生长情况,发现只有在野生型小鼠中生长速度存在明显差异,数据表明MUC1可能通过影响肿瘤微环境中的免疫应答状态,促进肿瘤生长。本论文的研究目的是通过构建MUC1过表达荷瘤模型和收集MUC1高表达的结肠癌组织,分析肿瘤微环境中免疫细胞的功能,阐明MUC1在抗结肠癌免疫应答中的功能。[方法]（1）构建稳定表达人MUC1的人和小鼠肿瘤细胞系SW480/MUC1和CT26/MUC1,将其注射至BALB/c鼠和免疫系统缺陷鼠腹部皮下。每3天测量一次肿瘤的直径。荷瘤小鼠肿瘤最长径大于12mm时,被认为死亡,获得荷瘤小鼠的生存曲线。（2）收集CT26/MUC1荷瘤小鼠的肿瘤组织,通过酶联免疫吸附法测定肿瘤组织匀浆液中细胞因子的分泌;流式细胞仪检测浸润至肿瘤组织中的CD4+T细胞,调节性T细胞（Regulatory T cells）,CD8+T细胞,骨髓来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells）,肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophage）的比例。通过细胞胞内细胞因子检测测定T细胞的杀伤功能。（3）PDL1抗体治疗CT26/MUC1荷瘤小鼠,分析荷瘤小鼠的生存曲线,评价PDL1抗体治疗效果,同时收集抗体治疗小鼠的肿瘤组织,检测组织中T细胞,MDSC,TAM的浸润情况。测定T细胞的活性改变,分析肿瘤组织中程序性死亡分子PD1及其配体PDL1的表达情况。（4）利用CD8抗体,封闭荷瘤小鼠体内CD8+T细胞功能,通过动物体内T细胞耗竭实验,研究抗体发挥作用的细胞依赖机制。（5）收集结直肠癌患者术后的肿瘤组织样本,同过分析MUC1表达情况,分为MUC1高表达组和MUJC1低表达组。通过酶联免疫吸附法检测肿瘤组织中细胞因子的分泌,通过流式细胞仪分析肿瘤组织免疫细胞的比例,T细胞的活化状态,程序性死亡分子PD1及其配体PDL1的表达情况。（6）利用TCGA结肠癌数据库,分析粘蛋白MUC1在结肠癌患者肿瘤组织中的转录水平与肿瘤患者生存时间的关系。[结果]（1）在免疫系统完整的野生型小鼠中,MUC1阳性的肿瘤细胞生长速度快于MUC1阴性的肿瘤细胞生长（p<0.05）,但是在免疫系统缺陷的裸鼠中,MUC1阳性和阴性的肿瘤细胞的生长速度没有显着差异。（2）MUC1阳性肿瘤组织中炎性细胞因子增加。与MUC1阴性或低表达的肿瘤组织相比,MUC1阳性或者高表达的肿瘤组织中炎性细胞因子IL-17A和IFN-γ水平明显升高,而抑炎性因子如IL-10,TGF-β和TNF-α水平没有显着变化（p<0.05）。流式细胞仪分析荷瘤小鼠和患者的肿瘤组织中CD45+CD3+CD4+T细胞、CD45+CD3+CD8+T细胞胞内细胞因子分泌情况,发现MUC1阳性和MUC1高表达的肿瘤组织内,CD4+、CD8+T细胞诱导产生的IL-17A和IFN-γ的水平明显升高,但与MUC1阴性或者低表达的肿瘤组织相比,CD8+T细胞分泌granzyme B的水平并没有显着增加。（3）MUC1阳性肿瘤组织中免疫抑制性细胞增加。流式细胞仪分析发现MUC1 阳性和MUC1 高表达的肿瘤组织中 Tregs（CD4+Foxp3+）,MDSC（CD11b+Gr1+）,TAM（CD11b+F4/80+）的浸润明显增加（p<0.05）。MUC1 高表达的人结肠癌组织或MUC1阳性的小鼠肿瘤组织中MDSC、TAM和肿瘤细胞表面PDL1表达升高（p<0.05）。然而,在转染了表达MUC1质粒的CT26和SW480细胞中,MUC1并没有促进肿瘤细胞表面PDL1的表达。而IL-17A和IFN-γ刺激可促进CT26细胞和CT26/MUC1细胞上PDL1的表达。结果还显示,在MUC1阳性的小鼠肿瘤组织中以及高表达MUC1的人结肠癌组织中的CD8+T细胞上PD1的表达均显着增加（p<0.05）。（4）MUC1阳性的荷瘤小鼠模型中靶向PDL1治疗可诱导抗肿瘤免疫反应。与同型抗体治疗的荷瘤小鼠相比,PDL1抗体治疗的小鼠,肿瘤组织中浸润的CD8+T细胞比例显着升高,CD4+/CD8+T细胞比例明显下降,MDSC和TAM的比例也显着降低。CD8+T细胞分泌IFN-γ和granzyme B的能力,CD4+T细胞产生IFN-γ的能力增强（p<0.05）。表达PD1的CD8+T细胞的百分比也明显更高（p<0.05）。（5）靶向PDL1可抑制肿瘤生长。与对照组相比,PDL1抗体治疗组的肿瘤体积明显缩小,生存期显着延长。而CD8+T细胞缺失的小鼠则失去了 PDL1抗体诱导的抗肿瘤保护作用。注射PDL1抗体治疗后,MUC1阳性的荷瘤小鼠则显示出更强的抗肿瘤免疫应答效应。（6）在TCGA结肠癌数据库中,通过MUC1的拷贝数来确定其在肿瘤组织中表达。分析MUC1的表达与患者的生存之间的关系。数据显示,MUC1低表达患者组较MUC1高表达患者组生存时间显着延长（p<0.05）。[结论]在MUC1阳性或MUC1高表达的肿瘤组织中发现了更多的炎性细胞因子和抑制抗肿瘤免疫应答的免疫细胞。在炎性细胞因子作用下,抑制性免疫细胞MDSC,Treg,TAM和肿瘤细胞上调免疫检查点分子PDL1的表达,抑制了肿瘤微环境中T细胞的抗肿瘤免疫应答。在MUC1阳性肿瘤细胞荷瘤小鼠模型中,利用PDL1抗体,阻断PDL1-PD1抑制性信号通路,减少了肿瘤微环境中Treg细胞,MDSC和TAM的细胞百分比,增强了 T细胞的细胞毒性并抑制了肿瘤的生长,最终使MUC1阳性荷瘤小鼠的生存时间得以延长。因此,本研究阐明了 MUC1在肿瘤免疫逃逸中的作用,并为PDL1抗体在MUC1阳性结直肠癌患者的治疗中的应用提供了理论基础。
王铂文[4]（2021）在《利用环状RNA FSCN1沉默的树突状细胞预防心脏移植中的异体免疫排斥反应》文中提出背景与目的:自人类心脏移植手术成功以来以及环孢素等免疫抑制剂应用于临床,全世界范围内的心脏移植手术开始普及。随着人民社会生活水平的不断提高,现阶段心血管疾病已经成为威胁人类生活质量和生命权益的主要问题,对于内科治疗无法改善的严重终末期心血管疾病,心脏移植成为了提高患者生存质量并延长患者生存时间的重要手段。虽然现阶段临床上心脏移植被用作心力衰竭的标准治疗方法,但移植后排斥与日渐稀缺的移植物来源,使得心脏移植仍然是一个亟待解决的医学挑战。现阶段,移植排斥依然继续是阻碍心脏移植物免疫耐受性建立的重要因素,最为理想的治疗方法是能够诱导心脏移植受者的异体移植特异性耐受,同时产生相较目前的免疫抑制疗法更少的不良副作用。因此我们将研究方向转向机体的免疫系统,树突状细胞是生物体免疫调节中的重要一环,是连接固有免疫与获得性免疫的重要桥梁。其重要的抗原呈递作用,细胞因子分泌作用以及对机体免疫系统监视调控作用都是各项免疫反应中至关重要的。尤其在移植免疫中,受体免疫系统对移植物源性抗体的识别过程,主导因素即是树突状细胞。树突状细胞,自发现以来,对其研究不断深入,是现被学界认为抗原提呈功能最强的免疫细胞。其形态学上多树突多伪足的结构,加上细胞表面的多形性决定了其高效摄取并加工处理和提呈抗原的功能特性。其因形态决定的极大细胞接触面积,使其为表面上极为丰富的各类分子提供了表达位点并提升了接触信息交换的效率,其中包括多种粘附因子以及多种细胞共刺激分子和多种抗原呈递分子。树突状细胞在被抗原或相应细胞因子或其他刺激因素激活后可转变为成熟的树突状细胞,成熟后的树突状细胞各项免疫相关表面分子表达迅速升高且伴随刺激性细胞因子分泌,转变为免疫刺激性极强的抗原呈递细胞。现阶段,树突状细胞被认为是能够激活未接触抗原的幼稚T细胞的唯一抗原呈递细胞。此外,部分研究证实,利用药物处理或分子调节后的树突状细胞还可向另一方向转化,即免疫耐受态。在该状态下,其对T细胞及其他淋巴细胞的调节能力体现反向性,即多方面抑制各淋巴细胞在免疫反应中的作用,起到稳定下调机体免疫敏感性的作用。针对上述的两点特征,已经有大量有关树突状细胞免疫治疗的研究被报道,例如在肿瘤免疫治疗领域等。而本研究中的治疗方式则为诱导树突状细胞的免疫耐受态从而降低免疫排斥反应的影响。在移植免疫中,免疫反应主要由树突状细胞处理提呈和介导。移植物在进入受体内后,移植物中的树突状细胞会与受体内的T细胞相结合,待受体T细胞识别了移植物抗原后,受体体内的免疫系统便开始针对移植的异源性抗原发起强烈的免疫反应。这正是发生急性免疫排斥反应的最关键原因。那么,如果能在移植物进入受体前,利用免疫耐受态的移植物源性树突状细胞对受体免疫系统进行预处理,或许能降低受体对移植物的免疫敏感性。这一思路在近些年的研究中不断被证实。但大多数基于药物或细胞因子的调节机制均缺乏强效性与特异性,针对树突状细胞分子水平改变的研究逐渐兴起,在探讨全新治疗靶点的同时也进一步加深了我们对树突状细胞生长发育的分子机制的理解。最近的证据表明,环状RNA是细胞发育中的一种新型基因调节因子。其中心脏也是环状RNA高度表达的器官之一。在前期实验中我们发现了成熟树突状细胞与未成熟树突状细胞间相比较,环状RNA表达谱差异极大（circFSCN1便是其中之一）,为了探究其背后的潜在分子机制。我们的目的是证明在心脏移植中,用环状RNA FSCN1（circFSCN1）沉默后产生的免疫抑制性树突状细胞（Immunosuppressive Dendritic Cells）治疗处理可以防止异体免疫排斥,延长心脏移植存活率。材料与方法:在体外用circFSCN1 siRNA转染小鼠骨髓来源的树突状细胞。通过设计环状RNA特异性的反向引物进行定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,q RTPCR）来测定circFSCN1的表达水平,以确定其下调效果。而后通过流式细胞仪来测定树突状细胞的特异性表面分子（CD40,CD80和CD83等）,以判断其对树突状细胞发育成熟度的影响。我们还设计了生物素化的特异性DNA探针,利用RNA原位杂交技术在荧光显微镜下确定了环状RNA在树突状细胞中的表达位置。另外,为判断circFSCN1表达下调后的树突状细胞除表型变化外,其对T细胞的刺激功能是否发生相应改变,我们进行了混合淋巴细胞反应（Mixed Lymphocyte Reaction;MLRs）以进行评估树突状细胞激活T细胞和产生调节性T细胞（Regulatory T cells;Tregs）的功能。除此之外,为了判断免疫耐受性树突状细胞预处理移植受体治疗方法的可行性,本研究还进行了异位小鼠心脏移植实验,受者预先用供体衍生的circFSCN1沉默的免疫抑制性树突状细胞进行处理,在处理后第七天进行心脏移植手术,术后短期内给予低剂量雷帕霉素,而后转为正常饲养,同期监测心跳以评估免疫排斥,以移植物心跳停止计算免疫排斥发生时间。待术后100天后,统一收集心脏移植物样本,进行固定包埋切片,而后进行HE以及Trichrome染色,以判断组织损伤情况和组织纤维化情况。并提取了受体小鼠脾脏,并对Treg细胞组分进行了流式细胞检测。结果:外显子环状RNA circFSCN1在树突状细胞的细胞质中表达。随着树突状细胞的生长发育逐渐成熟,树突状细胞内表达的circFSCN1水平逐渐升高。利用不同药物对树突状细胞进行处理,可以使树突状细胞停留在不成熟树突状细胞阶段,而抑制态的树突状细胞环状RNA circFSCN1的表达明显下降,相反的,若使用刺激性药物处理树突状细胞,可以使其处于激活态,此时树突状细胞内的circFSCN1表达显着上升。使用siRNA沉默circFSCN1可使其停留在不成熟状态下,损害树突状细胞激活T细胞的能力,而且该途径获得的低反应性T细胞,其免疫抑制效果是特异性的。不仅如此,circFSCN1沉默后的树突状细胞,在混合淋巴细胞培养中明显增强了Treg的转化和产生。使用circFSCN1沉默的免疫耐受性树突状细胞治疗可防止异体免疫排斥,延长异体移植存活期,减少心脏移植物的损伤和纤维化,并在受体体内诱导调节性T细胞。结论:使用相应siRNA沉默circFSCN1在树突状细胞中的表达可以诱导免疫耐受性树突状细胞,使用这些免疫耐受性树突状细胞,对心脏移植受体进行预处理治疗可以有效预防异体免疫排斥,延长异体移植存活期。这是一个未来可能转化为应用的潜在治疗靶点,可以对抗心脏移植中的移植排斥,与此同时也增加了我们对免疫系统中circRNA的了解。
黄涛[5]（2021）在《细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究》文中进行了进一步梳理CRL4作为E3泛素连接酶,可以结合不同的接头蛋白（称为DCAFs）,这些接头蛋白通过招募各自特定的底物到CRL4 E3泛素连接酶上发挥多种生理学功能。DCAF2（又称为CDT2或DTL）是CRL4的底物接头蛋白之一。CRL4DCAF2泛素连接酶是公认的细胞周期关键调节蛋白,对于促进细胞周期顺利通过S期和有丝分裂具有重要调控作用。CRL4DCAF2可以引发染色质复制起始蛋白（CDT1,SETD8）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21发生泛素化修饰并降解,从而促进细胞从S期顺利进入G2期。但由于缺乏可行的动物模型,CRL4DCAF2在体内尤其是免疫系统中的功能仍然未知。固有淋巴细胞和适应性免疫细胞在受到外来刺激后,会对细胞周期的进程产生不同的影响。T细胞接受到TCR和共刺激分子信号后,需要经历多个细胞周期进行快速增殖,而树突状细胞在经历模式识别受体介导的活化后,会退出细胞周期,并启动凋亡程序,这也体现在DCAF2的表达在树突状细胞激活地过程中迅速降低。NEDD靶向药物MLN4929,可以使CRL失活,其已经进行过多种类型的淋巴瘤和急性髓系白血病的治疗性临床试验。用MLN4924处理小鼠,会增加小鼠银屑病模型的严重程度,这与树突状细胞中缺失DCAF2造成的表型一致,说明DCAF2在自身免疫病中具有重要的负调控功能。通过转录组比对,我们发现DCAF2的缺失在树突状细胞中导致促炎细胞因子IL-23的表达特异性升高。进一步研究发现树突状细胞中的CRL4DCAF可以调节非经典NF-κB通路关键因子NIK的蛋白稳定性,进而负调节IL-23的产生。CRL4DCAF2会促进NIK的多聚泛素化修饰和随后的降解,我们发现这个过程不依赖于经典的TRAF2或TRAF3介导的NIK降解途径。另外,树突状细胞中条件性敲除DCAF2的年老小鼠表现出自身免疫性疾病倾向,在Aldara诱导的银屑病样皮肤炎症模型和实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中,该小鼠相较于野生型小鼠也具有更高的敏感性。我们的研究表明,细胞周期分子CRL4DCAF2除了作为细胞周期调控因子外,在先天免疫细胞中对于非经典NF-κB通路关键蛋白NIK的稳定性也有至关重要的调控作用。我们的研究揭示了CRL4DCAF2在树突状细胞中特异性调控促炎细胞因子IL-23的表达,并进一步引发相关自身免疫疾病的分子机制,为自身免疫性疾病和炎症性疾病提供了潜在的治疗靶点。
李思哲[6]（2021）在《胸腺基质淋巴生成素在大疱性类天疱疮中作用机制的研究》文中研究指明背景:大疱性类天疱疮（bullous pemphigoid,BP）是一种经典的自身免疫性皮肤病,自身抗体和2型辅助T细胞（helper T cell,Th）相关免疫反应在发病机制中发挥重要作用。胸腺基质淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin,TSLP）是一种上皮来源的细胞因子,具有活化树突状细胞（dendritic cell,DC）、促进B细胞增殖与抗体产生,促进Th2免疫反应等功能。研究发现TSLP参与众多自身免疫与炎症性疾病。目前已有研究揭示BP与TSLP具有相关性,但具体作用机制仍不明确。此外,TSLP在各类炎症相关皮肤病中尚没有全面性的研究。本课题首先研究TSLP与不同反应类型的炎症性皮肤病的相关性,然后着眼于TSLP与DC在BP发病中的作用,探究TSLP在BP发病机制中的功能。目的:1.探究TSLP在扁平苔藓（lichen planus,LP）、盘状红斑狼疮（discoid lupus erythematosus,DLE）、湿疹、BP、寻常型银屑病（psoriasisvulgaris,PsV）、结节病和蕈样肉芽肿（mycosisfungoides,MF）皮损中的表达水平,分析TSLP与以上疾病的相关性;2.探究TSLP与BP的相关性,以及TSLP在BP中的作用是否与DC具有相关性;3.探究TSLP是否通过DC促进Th2免疫反应,参与BP的发病机制。方法:1.选取北京协和医院皮肤科LP、DLE、湿疹、BP、PsV、结节病和MF的皮损石蜡切片,通过免疫组化的方法检测TSLP在这些皮肤组织中的表达情况;2.选取北京协和医院皮肤科就诊的BP患者,收集血清、疱液及皮肤组织,并收集其他皮肤疾病引起的水疱疱液和健康对照人群的外周血血清,通过ELISA、免疫组化、免疫荧光等方法,检测样本中TSLP及皮肤组织中DC、朗格汉斯细胞;3.培养人外周血DC,通过使用BP患者疱液刺激及抗TSLP抗体中和,检测细胞CCL-17、CCL-22表达、分泌情况。检测BP患者及对照人群疱液CCL-17和CCL-22水平。结果:1.TSLP在DLE、BP、PsV、结节病和MF表皮中表达均升高,在PsV和结节病的真皮中,也有明显表达;2.TSLP在BP血清、疱液、皮损组织中均表达升高;在BP皮损中,TSLP分布与DC-SIGN阳性的DC分布具有一定相关性,且DC-SIGN阳性DC细胞表面同时表达TSLP受体,而朗格汉斯细胞与TSLP无明显相关性,且细胞表面不表达TSLP受体;3.使用TSLP中和抗体中和后,人外周血DC表达CCL-17的水平下降,但CCL-22水平下降不明显。BP患者疱液中CCL-17、CCL-22水平相较非皮炎对照组显着升高,但与皮炎湿疹患者疱液含量无显着差异。BP患者疱液中TSLP水平与CCL-17水平显着相关。结论:1.TSLP与各类炎症性皮肤病均有一定相关性,可能广泛参与各类炎症性皮肤病的发病机制;2.TSLP与BP具有明显的相关性,且可能通过作用于DC-SIGN阳性的DC参与到BP的发病机制中;3.TSLP可以通过作用于DC,促进CCL-17分泌,促进BP发病过程中的Th2免疫反应。
周子琦[7]（2021）在《单次大剂量放射治疗对树突状细胞淋巴结归巢及T细胞激活能力的影响及机制的研究》文中研究指明背景:X射线大分割放疗临床应用日益增多,其免疫效应亦被广泛认同。树突状细胞（DC）是最重要的抗原呈递细胞之一,主要分布在外周组织中,发挥免疫监视功能。然当其受到抗原性刺激时,则可脱离实质组织束缚,迁移至淋巴组织发挥抗原递呈作用。由此可知,DC可否高效迁移至T细胞富集区是决定其功能发挥的关键步骤。然而,目前对X射线照射是否影响DC的淋巴结归巢能力及其具体分子机制尚未形成一致性结论。目的:本课题旨在探究单次大剂量X射线照射对DC向淋巴组织归巢及T细胞激活能力的影响,并揭示其分子机制。方法:为贴近临床,本课题采用医用直线加速器作为照射源,对DC进行2、5、10、15或20Gy照射。随后,采用流式细胞术分析X射线照射对DC成熟表型的影响;采用免疫荧光法分析照射对DC细胞骨架的影响;采用活性氧探针检测照射对DC中活性氧的诱导情况;采用Western Blot检测照射激活DC细胞骨架重排相关信号通路;采用小动物活体成像技术检测DC体内淋巴结归巢能力;采用过继性DC免疫法检测DC激活T细胞能力。结果:在72小时观察时间内,2-20Gy梯度剂量照射均不影响DC存活。然而DC表面CD40、CD80、CD86、CXCR4和CCR7均呈剂量依赖性上调表达,同时促炎因子TNF-a分泌增加。此外,相较于2Gy常规照射剂量组,单次20Gy大剂量照射可显着促进外周组织DC和循环DC向淋巴组织归巢。进一步研究发现,DC细胞骨架重排能力的增强及其表面趋化因子受体的上调表达是大剂量照射促进DC迁移能力增加的主要因素。同时,放射引起的活性氧增加进而RhoA/ROCK1信号通路的激活是DC细胞骨架重排的主要机制。最后,相较于2Gy常规照射剂量组,20Gy照射后DC具有更强的在体T细胞激活能力,表现为OVA257-264特异性CD8+T细胞数量和比例的增加和反应性CD8+T细胞表面激活标志物CD44/CD69及细胞内TNF-α上调表达。最后,抑制DC内ROS产生将极大降低在体T细胞激活程度,提示大剂量放射引起的ROS的累积仍是其促进DC激活T细胞的关键。结论:单次大剂量照射在促进DC向淋巴结归巢和T细胞激活方面与常规分割剂量照射相比有明显优势。
刘芹芹[8]（2020）在《树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究》文中认为急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是恶性的血液系统疾病,其特征是骨髓造血干祖细胞克隆性增生、分化异常及凋亡受阻,在外周血、骨髓内及其他组织内大量增殖及浸润。AML骨髓微环境以免疫抑制为特征,与AML的发生发展相关,可促进免疫耐受和白血病细胞免疫逃逸。近年来虽然AML的治疗方法不断改进,但是许多患者仍然出现耐药、难治及复发,长期生存及预后不容乐观。树突状细胞（dendritic cells,DCs）是机体重要的抗原提呈细胞,在机体免疫应答中发挥重要的核心作用。DCs是连接机体适应性免疫和先天性免疫重要的桥梁,具有强大的抗原提呈能力,可以“驾驭”B细胞和T细胞两种重要的免疫细胞,在机体对病原体和抗肿瘤的保护性免疫应答中发挥重要的作用。DCs可以刺激体内的T细胞产生免疫应答,并在对肿瘤细胞杀伤的免疫反应中起重要作用。DCs具有免疫调节特性可以克服骨髓的免疫耐受,增强骨髓微环境免疫并诱导抗白血病特异性T细胞的增殖。活化的T细胞能够识别AML细胞上表达的抗原,并随后介导AML细胞杀伤。可以通过DCs免疫刺激自体T细胞减少或消除残留的白血病细胞预防AML复发,因此基于DCs的免疫疗法可能在根除AML患者残留白血病细胞方面更加成功。炎症小体是参与固有免疫的主要成分之一,NLRP3炎症小体是目前为止研究最多、最透彻的。NLRP3炎症小体在感染性疾病和免疫性疾病中影响Th亚群分化,但在AML中的研究很少。NLRP3炎症小体活化后,释放IL-1β活性细胞因子,可以诱导T细胞产生并释放细胞因子IL-2,维持T细胞的存活和促进T细胞增殖。T细胞是机体抗肿瘤反应的重要免疫细胞,通过释放细胞因子和细胞毒性物质来清除白血病细胞,NLRP3炎症小体通过调节T细胞增殖和分化,最终达到调控肿瘤的作用。尽管多数AML化疗后病情会缓解,但长期生存率并不理想。免疫抑制的骨髓微环境有利于白血病细胞的生长和免疫逃逸,具有免疫调节特性的治疗可以克服免疫耐受,提高骨髓微环境的免疫力,增强肿瘤的免疫原性,改善AML的预后。因此探究AML骨髓DCs细胞NLRP3炎症小体对骨髓微环境免疫的作用,研究免疫相关基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）与AML的关系,探索骨髓微环境免疫在AML发生发展中的作用及其机制,从而进一步探索抗白血病细胞免疫治疗的方法,为AML的免疫治疗提供策略。第一部分树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病骨髓Th1亚群分化的作用及机制研究背景急性髓系白血病（AML）机体免疫功能异常在其发生发展和耐药中发挥重要作用,免疫紊乱的骨髓微环境促进了免疫耐受,有利于白血病细胞逃逸,其作用机制可能与骨髓Th亚群失衡有关。免疫细胞主要包括T细胞、B细胞和NK细胞,是骨髓微环境免疫的重要组成部分,其中T细胞中的Th细胞免疫失衡引起了研究者的高度关注。AML骨髓中T细胞增殖和产生细胞因子的能力明显降低,AML白血病细胞通过骨髓髓系来源的抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）对T细胞发挥抑制作用,或阻止T细胞进入细胞周期或分泌Th1相关细胞因子。Th1细胞参与机体细胞免疫,在细胞免疫中发挥重要作用。Th1细胞与AML发病及预后密切相关,但其分子机制尚未明确。NLRP3炎症小体是一种细胞内传感器,感受“危险”信号后将细胞因子IL-1β和IL-18前体转变成其活性形式,该信号可以是宿主或病原体。NLRP3炎症小体是参与机体免疫的多蛋白复合物,其作用机制可能与介导Th亚群分化有关。NLRP3炎症小体在肿瘤微环境中能诱导Th1、Th2、Th17细胞及CTL细胞的分化并能抑制肿瘤的免疫逃逸。AML骨髓微环境免疫失衡及功能失调可以导致白血病的发生,且与治疗后残留白血病细胞的免疫逃逸相关,免疫功能紊乱的骨髓微环境可导致AML的复发及难治。研究发现AML骨髓Th1/Th2及Th17/Treg免疫失衡参与了白血病细胞的免疫逃逸,在AML发生发展和耐药中发挥重要作用。但是,目前树突状细胞NLRP3炎症小体是否参与了 AML骨髓T细胞分化尚未明确,尤其是Th1亚群分化的机制尚待研究。研究目的本研究旨在研究Th1亚群在AML骨髓微环境中是否存在免疫失衡;探索树突状细胞NLPR3炎症小体对AML骨髓中Th1亚群分化的影响及机制;研究树突状细胞NLRP3炎症小体对Th1相关细胞因子IFN-γ水平及相关转录因子表达的影响,进而分析NLRP3炎症小体对骨髓Th1亚群分化影响的关键分子,通过对关键分子的干预观察对Th1亚群的影响,明确NLRP3炎症小体参与AML免疫失衡尤其是Th1亚群分化的作用机制。研究方法（1）临床标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院的37例AML患者、30例AML治疗完全缓解（CR）患者、23例难治复发AML患者及16例对照的骨髓液,分离骨髓单个核细胞和CD4+T细胞,留取骨髓上清。（2）Th1细胞与AML患者临床特征的关系:收集、整理AML患者白细胞计数、治疗疗效等临床资料,流式细胞术检测骨髓中Th1细胞比例,分析骨髓Th1细胞比例与临床资料的相关性。（3）IFN-γ细胞因子水平与AML患者关系:酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测骨髓上清中的IFN-γ细胞因子水平,分析与AML的临床相关性。（4）树突状细胞及CD4+T细胞培养:AML患者骨髓单个核细胞（BMMCs）用IL-4和GM-CSF诱导培养为树突状细胞,并用流式细胞术检测树突状细胞CD14、CD11c、CD80、CD83、CD86分子表达情况及诱导DCs转化率。MACS分选骨髓BMMCs中的CD4+T细胞并用流式细胞术检测分选率。（5）树突状细胞NLRP3炎症小体活化及抑制:将诱导培养的树突状细胞分成三组:①实验组（LPS+ATP,LA）:树突状细胞先用脂多糖LPS预处理6小时,然后加ATP激活45分钟;②NLRP3炎症小体抑制组:LPS处理前,LPS处理前先加入炎症小体抑制剂MCC950作用1小时（MLA）;③对照组:加入对应量的无菌PBS。检测树突状细胞NLRP3炎症小体相关分子NLRP3、ASC、IL-18、Caspase-1、IL-1β及 NF-κB 的表达情况。（6）树突状细胞NLRP3炎症对CD4+T细胞分化影响:将以上3组DCs与CD4+T细胞共培养,7天后流式细胞术检测Th1、Th2、Th17及Treg细胞比例。（7）细胞因子检测:用多细胞因子阵列检测树突状细胞培养上清液中IL-12p70、IL-10、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-2、IL-8等细胞因子水平,用ELISA方法再次检测相关细胞因子水平。（8）IL-1β对Th1细胞分化的影响:在BMDCs和CD4+T细胞共培养对照组和抑制组加入重组人IL-1β细胞因子,在实验组加入人IL-1β中和抗体,流式细胞术检测Th1细胞比例。（9）树突状细胞NLRP3炎症小体促进Th1细胞分化的方式:将树突状细胞与CD4+T细胞进行接触或用小室分离共培养,流式细胞术检测CD4+T细胞中Th1比例,ELISA方法检测DCs与CD4+T细胞共培养上清液中IFN-y及IL-1β细胞因子水平。（10）IL-1β影响Th1细胞分化的机制:将分离的CD4+T细胞分为3组:①单独加入IL-12;②IL-12联合重组人IL-1β细胞因子;③加入对应量无菌PBS,RT-PCR检测各组CD4+T细胞中IFN-γ、IFN-γ受体和STAT1的表达。（11）树突状细胞NLRP3炎症小体对体内Th1细胞分化的影响:体外培养野生型（WT）或Nlrp3-/-C57BL/6J小鼠的树突状细胞,将WT小鼠树突状细胞分为3组:①实验组:LPS和ATP处理;②抑制组:炎症小体抑制剂MCC950作用1小时后LPS和ATP处理;③对照组:加入对应量的无菌PBS。Nlrp3-/-小鼠的树突状细胞分为实验组和对照组,然后将各组DCs通过尾静脉注入WT小鼠体内,观察树突状细胞NLRP3炎症小体对小鼠Th1亚群的影响,流式细胞检测小鼠骨髓、脾脏中Th1细胞比例。（12）IL-1β对小鼠Th1细胞分化的影响:将鼠IL-1β中和抗体注射到实验组小鼠体内,观察IL-1β对小鼠体内Th1亚群影响,流式细胞检测小鼠骨髓和脾脏中Th1细胞比例。研究结果:（1）AML初诊患者骨髓中Th1细胞比例与对照组相比显着降低,治疗达CR后患者骨髓Th1细胞比例明显增高;骨髓中Th1细胞比例与AML初诊患者外周血白细胞计数呈负相关,Th1细胞比例≤10%的AML患者外周血白细胞计数明显高于Th1>10%AML患者。（2）AML初诊患者骨髓上清液中细胞因子IFN-γ水平明显低于对照组,患者治疗骨髓达CR后骨髓上清液中细胞因子IFN-γ水平升高。（3）树突状细胞培养及CD4+T细胞:流式细胞仪检测结果为树突状细胞表达CD11c,不表达CD80和CD14,少量表达CD83和CD86,DCs诱导转化率在>90%。利用CD4+MACS磁珠分选骨髓中CD4+T细胞的分离纯度>90%。（4）树突状细胞NLRP3炎症小体活化及抑制:RT-PCR检测实验组较对照组树突状细胞NLRP3炎症小体激活后caspase-1和IL-1β的表达增加,抑制组caspase-1和IL-1β的表达较实验组有降低趋势。ELISA检测实验组与对照组相比BMDCs上清液中的IL-1β水平升高,而MCC950抑制组IL-1β分泌明显较实验组降低。此外,western blot结果表明,IL-1β的活化形式IL-1β（p17）蛋白在实验组树突状细胞NLRP3炎症小体活化后表达增加。（5）树突状细胞NLRP3炎症小体对CD4+T细胞分化影响:流式细胞术检测结果显示:实验组NLRP3炎症小体激活的BMDCs促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,而NLRP3炎症小体被MCC950抑制后促进Th1细胞分化的作用明显降低。Th2、Th17和Treg细胞比例无明显变化。（6）细胞因子检测:多细胞因子阵列检测树突状细胞培养上清液,发现实验组NLRP3炎症小体激活后上清液中的IL-1β显着升高,MCC950抑制组较实验组明显降低。用ELISA方法检测验证了 12例AML患者树突状细胞NLRP3炎症小体激活后上清中的IL-1β水平升高,而MCC950抑制后降低。（7）IL-1β对Th1细胞分化的影响:在对照组和抑制组加入重组人IL-1β细胞因子后Th1细胞比例升高,IL-1β可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,并且IL-1β可逆转抑制组MCC950的抑制作用,在实验组加入人IL-1β中和抗体后Th1细胞比例降低,IL-1β中和抗体可抑制NLRP3炎症小体激活的DCs促进CD4+T细胞向Th1细胞分化的作用。（8）树突状细胞NLRP3炎症小体促进Th1细胞分化的方式:树突状细胞和CD4+T细胞无论是接触共培养还是小室分离共培养,DCs NLRP3炎症小体激活促进CD4+T细胞向Th1分化的作用是一样的,而且共培养上清液中细胞因子IFN-y和IL-1β的水平没有显着差异。（9）IL-1β影响Th1细胞分化的机制:RT-PCR检测CD4+T细胞IFN-γ、IFN-γ受体和STAT1表达在IL-1β和IL-12联合组明显升高,IL-12单独刺激或PBS组升高不明显。（10）树突状细胞NLRP3炎症小体在体内对Th1细胞分化的影响:WT小鼠树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进WT小鼠骨髓或脾脏中Th1细胞的分化,Th1细胞比例高于对照组,而抑制组MCC950可抑制这种作用。但是Nlrp3-/-小鼠树突状细胞无论在实验组还是对照组均不能促进WT小鼠中Th1细胞分化。（11）IL-1β对小鼠Th1细胞分化的影响:将鼠IL-1β中和抗体注射到实验组小鼠体内,与未注射IL-1β中和抗体的实验组小鼠相比Th1细胞比例明显降低。研究结论1.AML初诊患者骨髓Th1细胞比例及IFN-γ水平降低,且Th1细胞比例降低与白细胞计数呈负相关,提示AML骨髓微环境中存在免疫失衡。2.树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进的Th1细胞分化需要一个有功能的炎症小体,该结果为纠正AML骨髓微环境的免疫失衡提供新的研究方向。3.树突状细胞NLRP3炎症小体激活不依赖于细胞接触通过IL-1β分泌的方式促进Th1细胞分化,表明IL-1β是促进Th细胞分化的关键分子,可以通过干预IL-1β提高骨髓微环境的免疫。第二部分树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病抗白血病作用及机制的研究研究背景急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性致命的血液系统恶性肿瘤,为成人急性白血病最常见的一种,占儿童白血病的20%。AML标准诱导化疗方案可使50%到75%的AML患者得到缓解,由于化疗耐药性克隆的出现,标准疗法通常不足以维持持久缓解,细胞遗传学不良的AML即使采用积极的化疗效果也较差,大多数患者会复发并死于自身疾病,其5年生存率约为25%。但是年龄大于65岁的患者其预后并没有得到改善,最新报道其生存率低于10%,因此,迫切需要新的治疗方案,正是在这种情况下,免疫疗法在近年来脱颖而出。近年来基于免疫的治疗方法已经使某些晚期癌症患者的生存率得到意想不到的提高。免疫疗法治疗的前提是肿瘤会抑制免疫系统,肿瘤微环境中的T细胞功能受到抑制,并且可能与AML发病有关,而且新诊断的AML患者骨髓微环境中的T细胞浸润与总生存期之间存在显着关联。使用AML/树突状细胞融合的疫苗接种可引起白血病特异性T细胞的扩增,预防疾病复发,因此新型的个性化树突状细胞疫苗是一种新的治疗方法,产生防止疾病复发的免疫记忆,具有治疗AML的潜力。通过DCs刺激可以使T细胞产生免疫应答,并在针对肿瘤杀伤的免疫应答反应中起重要作用。活化的T细胞能够识别AML细胞上表达的抗原,并随后介导对AML细胞杀伤作用。近年来,DCs作为AML免疫治疗的工具引起了人们的极大兴趣,通过DCs免疫刺激自体T细胞是一种创新策略,可减少或消除残留的白血病细胞来预防AML复发,因此基于DCs的免疫疗法可能在根除AML患者中残留白血病细胞方面更加成功。AML患者在接受相当数量的DCs治疗后,可以获得非特异性和抗原特异性的免疫效应。NLRP3炎症小体在癌症发生和发展中的作用具有争议性。NLRP3炎症小体及其成分促进了恶性肿瘤如黑素瘤、肺癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤的生长、增殖、侵袭和转移。但是,在NLRP3基因敲除动物模式中使用氧化偶氮甲烷（AOM）及葡聚糖硫酸钠（DSS）（AOM/DSS）诱发结肠癌的实验研究中,NLRP3炎症小体对癌变具有保护作用。NLRP3炎症小体在不同肿瘤中的功能也突出了炎症小体的治疗潜力。前期我们研究结果显示AML患者骨髓中Th1细胞比例降低,存在骨髓微环境免疫抑制,树突状细胞炎症小体激活可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,Th1细胞效应细胞因子为IFN-γ,IFN-γ具有抗肿瘤免疫的作用,然而树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进AML骨髓Th1细胞分化对白血病细胞是否具有杀伤作用及其机制尚待研究。研究目的本研究旨在探究树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进AML骨髓Th1细胞分化是否对白血病细胞增殖和凋亡有影响;研究影响AML白血病细胞增殖和凋亡的关键分子,通过干预关键分子分析其对白血病细胞增殖和凋亡影响的机制,从而明确NLRP3炎症小体参与AML骨髓免疫促进Th1亚群分化抗白血病的作用机制。研究方法（1）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病细胞增殖和凋亡的影响:将AML患者BMDCs分成三组:①NLRP3炎症小体激活实验组（LA）:DCs先用脂多糖LPS预处理6小时,再加ATP作用45分钟,激活NLRP3炎症小体;②抑制组（MLA）:LPS处理前,预先加入炎症小体抑制剂MCC950作用1小时,抑制NLRP3炎症小体活性;③对照组:加入对应量的无菌PBS。用小室将CD4+T细胞与三组BMDCs共培养,共培养后的CD4+T细胞再与THP-1或U937 AML细胞系共培养,流式细胞术检测THP-1及U937白血病细胞的凋亡,用CCK-8检测细胞增殖试剂盒检测白血病细胞的增殖。（2）影响白血病细胞增殖和凋亡的机制:ELISA方法检测共培养细胞上清液中的Th1细胞主要效应细胞因子IFN-γ水平。在实验组共培养体系中加入人IFN-γ中和抗体,流式细胞术检测THP-1及U937白血病细胞的凋亡,CCK-8检测细胞增殖试剂盒检测白血病细胞的增殖,探讨细胞因子IFN-γ对影响白血病细胞的凋亡和增殖的影响。（3）树突状细胞NLRP3炎症小体对AML白血病小鼠的影响:体外培养WT或Nlrp3-/-C57BL/6J小鼠的树突状细胞,将WT小鼠树突状细胞分为3组:①激活NLRP3炎症小体实验组:LPS和ATP处理;②抑制NLRP3炎症小体抑制组:先用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950作用1小时后LPS和ATP处理;③对照组:加入对应量的无菌PBS。Nlrp3-/-小鼠的树突状细胞分为实验组和对照组。先通过WT小鼠尾静脉注射了 MLL-AF9-GFP白血病细胞,3天后将各组BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,7天后检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏及肝脏中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。（4）IFN-y对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:将MLL-AF9-GFP白血病细胞通过WT小鼠尾静脉注射入小鼠体内,3天后将对照组和实验组WT/BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,将鼠IFN-γ中和抗体在第4、6和8天注射入部分实验组小鼠体内,第10天检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠脾脏、肝脏及骨髓中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。（5）IL-1β对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:将MLL-AF9-GFP白血病细胞通过WT小鼠尾静脉注射入小鼠体内,3天后将对照组和实验组WT/BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,将鼠IL-1β中和抗体连续4天注射入部分实验组小鼠体内,第10天检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠脾脏、肝脏及骨髓中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。研究结果（1）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病细胞增殖和凋亡的影响:与对照组相比,实验组CD4+T细胞与THP-1或U937白血病细胞共培养后白血病细胞凋亡明显增加,而抑制组MCC950会降低这种促凋亡作用。与对照组或抑制组的BMDCs组共培养的CD4+T细胞相比,实验组CD4+T细胞使THP-1或U937白血病细胞的增殖明显降低。（2）影响白血病细胞增殖和凋亡的机制:ELISA检测实验组NLRP3炎症小体激活的BMDCs与CD4+T细胞共培养上清液中的细胞因子IFN-γ水平明显高于对照组,而抑制组IFN-γ的水平显着降低。在实验组共培养体系中加入人IFN-γ中和抗体后THP-1或U937白血病细胞的凋亡显着降低。同样,在实验组共培养体系中加入IFN-γ中和抗体后THP-1或U937白血病细胞的增殖较未加入IFN-γ的实验组明显增加。（3）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病小鼠肿瘤影响:与对照相比,注射NLRP3炎症小体激活WT/BMDCs的实验组白血病小鼠的脾脏和肝脏的体积和重量显着降低,且骨髓、脾脏和肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例低于对照组,而MCC950可逆转WT/BMDCs NLRP3炎症小体激活抑制白血病细胞增殖的这种作用。但是Nlrp3-/-小鼠的实验组BMDCs NLRP3炎症小体激活后注射入白血病小鼠体内后,未观察到对白血病小鼠白血病细胞的抑制作用。（4）IFN-γ对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:与未注射鼠IFN-γ中和抗体的实验组小鼠相比,注射鼠IFN-γ中和抗体的实验组小鼠的脾脏体积或肝脏重量和体积显着增加,小鼠中骨髓、脾脏或肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例显着增加。（5）IL-1β对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:实验组小鼠注射鼠IL-1β中和抗体后,与未注射鼠IL-1β中和抗体的实验组小鼠相比白血病小鼠的脾脏和肝脏的体积和重量显着增加,且骨髓、脾脏和肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例显着增加。研究结论1.NLRP3炎症小体激活的BMDCs促进Th1细胞分化有抗白血病的作用,为AML的免疫治疗提供新的研究方向。2.IFN-γ是BMDCs NLRP3炎症小体激活抗白血病作用重要的效应分子。3.NLRP3炎症小体通过IL-1β/Th1/IFN-γ参与抗白血病作用,调节树突状细胞NLRP3炎症小体和IL-1β有望成为AML治疗新的靶点。第三部分免疫相关基因单核苷酸多态性在急性髓系白血病中的研究研究背景急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是髓系原始幼稚细胞在骨髓内大量增殖导致正常造血功能受损,并伴有遗传学异常,是成人发病率最高的血液系统恶性肿瘤。恶性肿瘤存在免疫失衡,AML患者骨髓存在免疫系统损伤,免疫系统最重要的组成部分T细胞存在数量和功能上的缺陷。免疫T细胞是至关重要的抗肿瘤免疫细胞,通过释放细胞因子和细胞毒性物质消灭AML白血病细胞。同时,AML白血病细胞也会影响T细胞的分化和增殖,并通过释放抑制性细胞因子等方式发挥免疫抑制作用。T辅助（Th）细胞在T细胞免疫系统网络中起着举足轻重的作用,Th1/Th2及Th1 7/Treg失衡与实体瘤的发病机理以及血液系统恶性肿瘤有关,但是Th细胞在AML骨髓微环境中研究不多。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）是最常见的遗传变异类型,其功能在生物学的许多领域被发现,特别是在人类各种疾病方面的研究最多。炎症相关的SNPs在AML患者中的作用已已有相关研究,并且发现SNPs与化疗敏感性、疾病预后和生存时间相关的SNPs。例如IL-1β（rs16944）GA基因型与AML遗传学预后良好相关,而含有IL-18（rs1946518）GT基因型的AML患者生存率较差。Zhu等报道IL-17F的G单突变体和GG突变纯合子与AML易感性有关。TNF-α、IL-10、TGF-β1等功能性变异可能与AML的发病机制有显着相关性。我们在前期研究中发现AML骨髓中Th亚群失衡及其相关细胞因子分泌紊乱,并发现失衡的Th亚群与紊乱的细胞因子可能共同参与AML的发生和发展。因此,我们进一步研究免疫相关基因（包括促炎或抗炎细胞因子以及T细胞亚群的关键调节因子）的SNPs与AML的关系,探索SNPs在AML发病过程中涉及一些尚未发现的功能及病理机制,寻找新的治疗AML重要的免疫靶点。研究目的本研究旨在探索免疫相关基因的单核苷酸多态性与AML易感性、预后危险分层和生存分析之间的关系;分析免疫相关基因的单核苷酸多态性不同基因型与AML临床特征之间的关系;结合相关基因mRNA表达和功能分析,进一步确定了潜在的信号通路,寻找AML新的免疫治疗靶点。研究方法标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院的269例初诊AML患者及200例健康对照标本,分离单个核细胞并提取DNA及RNA。收集整理患者临床相关资料。（1）将AML患者及健康对照标本进行质谱SNPs分型信息采集及分析。Sequenom MassARRAY平台对21个候选SNPs进行了引物延伸质谱的基因分型,得出269例AML病例和200例健康对照的基因分型准确性结果。本研究利用Hardy-Weinberg平衡和微小等位基因频率（MAF）对21个候选SNPs的适用性进行了评价。（2）实时荧光定量PCR检测AML骨髓单个核细胞中IL-12 mRNA的表达。研究结果:（1）免疫相关基因SNPs与AML易感性的关系:IL4（rs2070874、rs2243250）和IL22 rs1179251在显性模式下基因型频率与AML易感性显着相关;单因素logistic回归分析显示,调整年龄和性别后,在显性模式下只有IL4（rs2243250）与AML的易感性显着相关,但是经过Bonferroni多重校正后,没有SNPs与AML的易感性相关。（2）免疫相关基因SNPs与骨髓原始幼稚细胞的关系:在隐性模式下IL2（rs2069762）基因型频率在骨髓高幼稚细胞（≥42%）和低幼稚细胞（<42%）组间差异有统计学意义。（3）免疫相关基因SNPs与外周血白细胞的关系:IL22（rs2227491）在显性、共显性和等位基因模式下的基因型频率与白细胞计数显着相关;另外IL4（rs2243250）等位基因频率也与白细胞计数显着相关;rs2227491在显性和等位模式下的基因型频率经Bonferroni多重校正后与白细胞计数也显着相关;在调整年龄和性别后,IL22（rs2227491）在显性模式下AML患者携带TT基因型发生高白细胞计数的风险是TC/CC基因型携带患者的4.2倍,IL22 rs2227491等位基因的分布也有统计学差异。（4）免疫相关基因SNPs与血红蛋白、血小板及乳酸脱氢酶的关系:在共显性和显性模式下STAT6（rs324011）和IL12A（rs2243115）的基因型频率在高血红蛋白（≥80g/L）和低血红蛋白（<80/L）间差异有统计学意义;在共显性和隐性模式下IFN-γ（rs2069718）等位基因频率和基因型频率与血红蛋白高低也显着相关;在调整年龄和性别后,IL6R（rs2228145）基因型频率仅在显性模式下与高乳酸脱氢酶（LDH）显着相关性,但是在Bonferroni多重校正后,SNPs与血红蛋白、LDH无显着相关性。未发现SNPs与血小板高低相关。（5）免疫相关基因SNPs与WHO分型重现性遗传学异常的关系:STAT5B（rs6503691）在共显性和隐性模式下与AML重现性遗传学异常（RGAs）显着相关,即使Bonferroni多重校正后,rs6503691与重现性遗传学异常之间的相关性也具有统计学意义;调整年龄和性别后进行单变量逻辑回归分析,rs6503691 CC基因型（共显性模式）或CC/CT基因型（隐性模式）被作为参考时,TT或CT基因型（共显性模式）和TT（隐性模式）与重现性遗传学异常显着相关。（6）免疫相关基因SNPs与AML危险度分层的关系:在共显性、显性和隐性模式下TGF-β1（rs1800469）与AML危险度分层显着相关,但是经多元回归调整年龄和性别因素后rs1800469在共显性、显性和隐性模式下差异无统计学意义。（7）AML缓解组和难治组总生存时间（OS）:对191名化疗诱导治疗患者的治疗效果进行OS的单因素分析,结果显示完全缓解（CR）组和难治组之间的结果有显着差异,中位OS分别为39个月和18个月。（8）免疫相关基因SNPs与AML非M3诱导化疗敏感性的关系:在共显性和隐性模式下STAT1（rs3771300）的等位基因频率和基因型频率在治疗敏感组、中等组和无效难治组间差异有统计学意义;在共显性模式下GATA3（rs3824662）等位基因频率和基因型频率在三组间均有显着相关性,但是经过Bonferroni多重校正后无SNPs与诱导化疗敏感性相关。（9）免疫相关基因SNPs与AML生存的关系:在显性和共显性模式下STAT3（rs744166）基因型频率与AML患者生存期显着相关;IL12A（rs6887695）在等位基因、隐性和共显性模式下的与AML患者的生存期显着相关;在Bonferroni多重校正后IL12A（rs6887695）只有在共显性和隐性模式下的与AML患者的生存显着相关;在IL12A（rs6887695）共显性模式下AML患者携带CC基因型的比GG基因型的携带患者OS降低22个月;IL12A（rs6887695）在GC/CC下的生存期（22.0个月）明显短于隐性模式下GG（33.0 个月）。（10）rs6887695与IL12 mRNA表达水平的关系:在共显性模式下,CC基因型患者IL12mRNA表达水平高于GG基因型患者;与GG基因型相比,CG杂合子患者的IL12水平也升高;在隐性模式下,与CG/GG基因型相比,GG基因型的样本中IL12表达显着降低;而在显性模式下,CC/CG基因型和GG基因型的IL12 mRNA表达无差异。研究结论1.IL22（rs2227491）与白细胞计数显着相关,提示IL22与AML预后有相关性。2.STAT5B（rs6503691）与AML患者重现性遗传学异常密切相关,提示STAT5B与AML预后关。3.IL12A（rs6887695）与 AML 患者的 IL12 mRNA 表达及 OS 相关,对 AML的预后有独立的负面影响。
马占川[9]（2020）在《MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究》文中研究指明研究背景与目的:在炎症性肠炎（Inflammatory bowel disease,IBD）中,多种免疫细胞和肠道菌群相互影响共同导致肠炎进展。其中,由于Th17细胞在肠炎中的关键作用成为近年来研究的热点。我们先前的研究结果表明髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）通过分泌 Ⅰ 型精氨酸酶（arginase-1,Arg-1）促进Th17细胞的分化,从而加重系统性红斑狼疮的进展。但是在炎症性肠炎中,MDSC与Th17细胞的关系仍不明确,阻碍了肠炎治疗的研究。此外,橡黄素在肠炎治疗中的表现出一定功效,但其作用机制还有待于进一步研究。因此,本研究以髓系细胞Arg-1敲除（ArgmyeKO）小鼠构建肠炎模型,研究MDSC对Th17细胞功能的影响,并探究橡黄素在肠炎治疗中的作用机制,为炎症性肠炎的治疗提供新的思路。研究方法:（1）3.5%葡聚糖硫酸钠喂养ArgmyeKO小鼠或野生型小鼠8～12天得到肠炎小鼠。从喂养之日起每天记录小鼠体重,对粪便硬度,粪便潜血水平进行评分,直至小鼠死亡,测量结直肠长度。以时间为横坐标评分为纵坐标绘制肠炎小鼠疾病得分曲线,以时间为横坐标存活率为纵坐标绘制肠炎小鼠生存曲线,对比两组肠炎小鼠结直肠长度,借此评估肠炎状态下Arg-1对小鼠的影响。（2）流式分选纯化肠炎小鼠脾脏MDSC,与带有CFSE标记的CD3、CD28刺激的小鼠T细胞共培养3天,流式检测评估Arg-1敲除对MDSC功能的影响。（3）在肠炎发病前后收集小鼠外周血,脾脏细胞以及派氏集合淋巴结细胞检测MDSC、Th17细胞、Treg细胞以及γδT细胞的比例。取肠炎小鼠结直肠做HE染色评估免疫细胞浸润状态和肠粘膜屏障受损情况。（4）流式检测肠炎小鼠MDSC Arg-1的分泌,检测Th17细胞IL-17A、IL-17F以及IL-22的分泌;荧光定量PCR检测肠炎小鼠结直肠组织中ACTI、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。（5）流式分选纯化野生型小鼠脾脏MDSC,转输给ArgmyeKO小鼠,记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测转输MDSC后肠炎小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。（6）在第0,3,5,7天给肠炎小鼠腹腔注射橡黄素,橡黄素用量按0.5 μM/g体重计算。记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测肠炎小鼠外周血,脾脏以及肠道固有层中MDSC 比例以及Arg-1和pSTAT3的水平,分选脾脏MDSC荧光定量PCR检测ESRI、ESR2的水平,检测小鼠脾脏和外周血派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδT细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。荧光定量PCR检测橡黄素治疗后肠炎小鼠结直肠组织中ACT1、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。研究结果:（1）肠炎期间Argmye KO小鼠体重下降明显,便血严重,肠组织中大量免疫细胞浸润,死亡率高于WT组小鼠。（2）肠炎期间ArgmyeKO小鼠结直肠组织IL-17A表达水平低于WT组小鼠;IL-17F表达水平高于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结中Th17细胞IL-17A的分泌量低于WT组小鼠,而IL-17F表达量则高于WT组小鼠。（3）肠炎期间ArgmyeKO小鼠肠组织和外周血中MDSC L比例低于WT组小鼠;其中M-MDSC 比例显着低于WT组,G-MDSC 比例组间无统计学意义。脾脏MDSC 比例在组间无统计学意义。此外,ArgmyeKO小鼠MDSC三个抑制分子Arg-1,iNOS,IDO表达水平低于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠结直肠中ACT1和COX-2表达量高于WT组小鼠;IL-22,IL-23,OCLN表达量在ArgmyeKO小鼠结直肠中更低。（4）转输WT来源的MDSC后,ArgmyeKCO小鼠便血减轻,体重流失程度减轻,结直肠比对照组小鼠更长。流式结果显示转输MDSC后,ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞分泌更多的IL-17A;而IL-17F的表达量低于对照组。（5）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠疾病评分降低,体重降低程度减轻,结直肠长度比对照组小鼠更长。流式结果显示治疗组小鼠外周血,脾脏和肠组织中MDSC 比例明显升高。MDSC表面雌激素受体表达量上升,胞内pSTAT3水平提高,MDSC分泌更多Arg-1。（6）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠结直肠组织IL-17A、IL-17F表达量升高。流式结果显示派氏集合淋巴结,肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδ T细胞分泌更多IL-17A;而IL-17F水平也高于对照组小鼠。治疗组小鼠结直肠中ACT1,IL-22,IL-23和OCLN表达量高于对照组小鼠;COX-2表达水平下降。结论:本研究发现在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中,激活MDSC中ESR/STAT3信号通路可以上调MDSC Arg-1的分泌水平。经橡黄素治疗后,肠炎小鼠体内MDSC 比例显着升高并分泌大量Arg-1。Arg-1提高Th17细胞IL-17A的表达同时抑制IL-17F的水平,促进肠粘膜修复相关因子的表达,从而缓解肠炎。我们的数据强调了 MDSC来源的Arg-1在小鼠肠炎中对Th17细胞IL-17A和IL-17F的调节作用,揭示了橡黄素缓解肠炎发病的机制,并为肠炎的治疗提供了新的思路。
朱丽珺[10]（2020）在《加倍剂量依巴斯汀不能影响皮肤斑贴试验阳性结果 ——一项多中心自身对照研究》文中研究说明目的:观察抗组胺药物依巴斯汀20mg/天对皮肤斑贴试验阳性结果的影响。方法:选取六家不同门诊皮肤斑贴试验一项或多项变应原强阳性（++）的手部湿疹/皮炎患者180例,予依巴斯汀20mg 口服2周,每天一次,在第11天进行第2次斑贴试验,在斑贴试验后第48小时、第72小时、第96小时判读斑贴试验结果。实验数据采用等级资料样本比较秩和检验。结果:共174位受试者完成试验,5种变应原,第一次斑贴试验共184个单元呈强阳性（++）,第二次斑贴试验后,174个单一元呈强阳性（++）反应,5个单元由强阳反应（++）变为阳性反应（+）,5个单元由强阳反应（++）变为极阳反应（+++）。对两次斑贴试验阳性结果反应程度进行秩和检验,|Z|=0.31,P=0.757,差异无统计学意义。结论:抗组胺药物依巴斯汀20mg/天对于皮肤斑贴试验阳性结果反应程度无影响。
二、树突状细胞在抗原特异性皮炎中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、树突状细胞在抗原特异性皮炎中的作用（论文提纲范文）
（1）力学特性对肿瘤免疫响应影响的建模分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 癌症的免疫特性 |
| 1.1.1 癌症的发展 |
| 1.1.2 免疫系统 |
| 1.1.3 肿瘤免疫系统 |
| 1.1.4 免疫编辑 |
| 1.2 细胞力学特性 |
| 1.2.1 细胞基质的刚度对肿瘤的影响 |
| 1.2.2 细胞间粘附力对肿瘤的影响 |
| 1.3 肿瘤免疫反应建模 |
| 1.3.1 肿瘤的数学模型 |
| 1.3.2 肿瘤与免疫作用的数学模型 |
| 1.4 本章小结及主要研究内容 |
| 第2章 基质刚度调节细胞与基质间的黏附对肿瘤迁移的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 细胞-ECM黏附的影响 |
| 2.3.2 细胞外基质刚度变化改变细胞-细胞外基质黏附对肿瘤细胞迁移的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 细胞毒性T淋巴细胞抗原-4 调节T细胞-DC间黏附对肿瘤杀伤的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 T 细胞的免疫特性 |
| 3.3.2 CTLA-4可调节T细胞-DC粘附力大小 |
| 3.3.3 CTLA-4影响T细胞的增殖 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 肿瘤生长-免疫系统模型代码 |
| 附录1 Main Python Script部分 |
| 附录2 XML Script部分 |
| 附录3 Python部分 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）清热除湿汤及活性成分对特应性皮炎小鼠与肥大细胞的调控作用和机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 特应性皮炎现代医学病因及发病机制的研究进展 |
| 1. 遗传与基因突变促使AD发生 |
| 2. 免疫功能异常诱发炎症反应 |
| 2.1 T淋巴细胞比例失衡是AD发生的关键 |
| 2.1.1 Th1/Th2失衡 |
| 2.1.2 T辅助17细胞 |
| 2.2 B细胞抗体产生是AD特征性改变 |
| 2.3 树突状细胞参与AD炎症反应的发生、发展和维持 |
| 2.4 肥大细胞是AD炎症反应的放大器 |
| 2.5 角质细胞积极参与AD炎症反应的发生和维持 |
| 3. 皮肤屏障功能障碍是AD的核心问题 |
| 4. 环境污染触发AD发生 |
| 5. TSLP、细菌感染等其他引起AD发生和发展的重要因素 |
| 6. 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 特应性皮炎中医病因病机的认识与发展 |
| 1. 特应性皮炎病名的历史沿革 |
| 2. 特应性皮炎病因病机的研究概况 |
| 2.1 古代文献病因病机阐述 |
| 2.2 现代医家对病因病机的认识与治疗 |
| 2.3 “内湿”与“外湿”搏结诱发AD |
| 2.3.1 湿邪的来源与致病特点 |
| 2.3.2 湿邪所致AD的机理 |
| 2.4 AD急性期病人多为湿热蕴结,以清热除湿为治则 |
| 3. AD“湿热蕴结”的现代病理基础 |
| 4. 结语 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 特应性皮炎小鼠模型的建立与评价 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 小鼠一般情况与皮损表现 |
| 3.2 皮损炎症评分与搔抓计数 |
| 3.3 皮损组织病理 |
| 3.3 真皮层肥大细胞浸润明显 |
| 3.4 血清IgE、IL-4和IFN-γ表达升高 |
| 3.5 脾脏Th1/Th2比例失衡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 清热除湿汤对DNCB诱导的Nc/Nga小鼠特应性皮炎模型和肥大细胞的干预作用研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 QRCSD缓解AD小鼠皮损炎症反应 |
| 3.2 QRCSD改善AD小鼠皮损病理表现 |
| 3.3 QRCSD减少真皮肥大细胞浸润和血清IgE水平 |
| 3.4 QH提高AD小鼠紧密连接蛋白表达 |
| 3.5 QH降低AD小鼠脾指数和升高脾脏Th1/Th2比例 |
| 3.6 QH抑制AD小鼠皮损多种炎症因子表达 |
| 3.7 QH降低AD小鼠皮损IL-4和IL-6 mRNA相对表达 |
| 3.8 QRCSD安全浓度筛选 |
| 3.9 QRCSD降低肥大细胞脱颗粒释放HIS和β-HEX水平 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 清热除湿汤活性成分及潜在治疗靶点分析 |
| 1. 方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 网络药理学为中药复方研究提供方向 |
| 3.2 QRCSD多靶点多通路调控免疫-抑制炎症反应 |
| 3.3 MAPK信号通路在AD发病中的具有重要作用 |
| 3.4 龙胆苦苷、黄芩苷和木犀草素是QRCSD重要活性成分 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 实验四 清热除湿汤有效成分对DNCB诱导BALB/c小鼠特应性皮炎模型炎症免疫反应的调控作用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 龙胆苦苷、黄芩苷和木犀草素减轻AD小鼠皮损严重程度 |
| 3.3 龙胆苦苷、黄芩苷和木犀草素缓解AD小鼠模型皮损病理表现 |
| 3.4 龙胆苦苷、黄芩苷和木犀草素减轻AD小鼠肥大细胞浸润 |
| 3.5 龙胆苦苷降低AD小鼠血清IgE水平 |
| 3.6 龙胆苦苷调节AD小鼠脾脏Th1/Th2比例 |
| 3.7 龙胆苦苷降低AD小鼠皮损IL-4和IL-6 mRNA相对表达 |
| 3.8 龙胆苦苷抑制AD小鼠皮损中p38 MAPK/ERK磷酸化水平 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 龙胆苦苷对肥大细胞活化脱颗粒的影响及机制研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 肥大细胞脱颗粒 |
| 3.2 不同浓度龙胆苦苷对肥大细胞活性的影响 |
| 3.3 龙胆苦苷降低RBL-2H3脱颗粒释放炎症介质水平 |
| 3.4 龙胆苦苷降低P815脱颗粒释放炎症介质水平 |
| 3.5 龙胆苦苷降低RBL-2H3脱颗粒IL-4和TNF-α mRNA表达水平 |
| 3.6 龙胆苦苷降低P815脱颗粒IL-4、IL-1β和TNF-α mRNA表达水平 |
| 3.7 龙胆苦苷抑制RBL-2H3脱颗粒模型p-p38/p38、p-ERK/ERK蛋白表达 |
| 3.8 龙胆苦苷降低P815脱颗粒模型p-ERK/ERK蛋白表达 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 存在的问题与不足 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（3）粘蛋白MUC1在结肠癌中诱导免疫抑制的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 MUC1在小鼠结肠癌模型中诱导的免疫抑制作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 WUC1高表达的人结肠癌肿瘤组织中免疫细胞的功能变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 局限性与展望 |
| 附表 |
| 综述 癌症相关粘蛋白MUC在肿瘤免疫调节和转移中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章及科研项目情况 |
| 致谢 |
（4）利用环状RNA FSCN1沉默的树突状细胞预防心脏移植中的异体免疫排斥反应（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 心脏移植现状 |
| 1.2 心脏移植免疫抑制药物使用现状 |
| 1.3 树突状细胞在器官移植中的作用 |
| 1.4 环状RNA简介 |
| 1.4.1 环状RNA的来源 |
| 1.4.2 环状RNA的生成 |
| 1.4.3 环状RNA的分类 |
| 1.4.4 环状RNA的特性及作用 |
| 1.5 环状RNA在树突状细胞生物调节中的作用 |
| 1.6 环状RNA CIRCFSCN1 简介 |
| 第2章 实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要药品与试剂 |
| 2.1.3 实验器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 树突状细胞培养 |
| 2.2.2 Si RNA的设计合成及转染 |
| 2.2.3 树突状细胞完全培养基及无抗生素转染培养基配方 |
| 2.2.4 生物素化的DNA探针的合成 |
| 2.2.5 RNA原位杂交技术 |
| 2.2.6 免疫共沉淀技术 |
| 2.2.7 动物处理以及异位心脏移植 |
| 2.2.8 H&E染色及trichrome染色 |
| 2.2.9 定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR) |
| 2.2.10 Western蛋白印迹实验 |
| 2.2.11 流式细胞术 |
| 2.2.12 混合淋巴细胞培养 |
| 2.2.13 T细胞的丝裂霉素C处理 |
| 2.2.14 数据统计 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 结果 |
| 3.1.1 环状RNA circFSCN1 在树突状细胞中随细胞逐渐发育成熟,表达逐渐升高。 |
| 3.1.2 在免疫抑制剂或激活剂作用下,circFSCN1 在树突状细胞中表达水平存在差异 |
| 3.1.3 circFSCN1 主要分布于树突状细胞的细胞质中 |
| 3.1.4 siRNA下调树突状细胞中的circFSCN1 的表达水平 |
| 3.1.5 使用针对Circ FSCN1的siRNA不影响主基因FSCN1 的正常表达 |
| 3.1.6 树突状细胞内circFSCN1 表达降低后,各细胞表面标志物变化 |
| 3.1.7 树突状细胞内circFSCN1 表达水平降低后,EF-1A及 P-P65蛋白的表达水平也相应下调 |
| 3.1.8 circFSCN1 沉默后的树突状细胞能抑制异体T细胞增殖 |
| 3.1.9 circFSCN1 沉默后的树突状细胞能诱导异体T细胞出现低反应性且具有特异性 |
| 3.1.10 circFSCN1 沉默后的树突状细胞能促进异体T细胞向Treg细胞转化 |
| 3.1.11 使用circFSCN1 沉默的树突状细胞预处理受体小鼠,有效延长异位移植心脏存活时间 |
| 3.1.12 使用circFSCN1 沉默的树突状细胞预处理受体小鼠,心脏移植物所受免疫排斥损伤更小 |
| 3.1.13 使用circFSCN1 沉默的树突状细胞预处理受体小鼠,能诱导受体小鼠体内产生Treg细胞 |
| 3.2 总结 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 非经典NF-κB信号通路的组成与调控 |
| 1.2 非经典NF-κB信号在树突状细胞中的功能 |
| 1.3 树突状细胞在自身免疫病中的作用 |
| 1.4 细胞周期的调控机制 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DCAF2的表达在树突状细胞激活后下调 |
| 3.2 树突状细胞中DCAF2 的缺失破坏免疫稳态并导致自身免疫反应 |
| 3.3 树突状细胞中DCAF2 的缺失促进实验性自身免疫病的发展 |
| 3.4 DCAF2在DC中特异性抑制IL-23 表达 |
| 3.5 DCAF2 负调控非经典NF-κB信号的活化 |
| 3.6 DCAF2 的缺失通过非经典NF-κB信号引发过度的炎症反应 |
| 3.7 DCAF2 负调控NIK的蛋白质稳定及下游信号通路 |
| 3.8 DCAF2 诱导NIK的泛素化修饰和降解 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 细胞周期蛋白参与调控免疫反应的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 答辩决议 |
（6）胸腺基质淋巴生成素在大疱性类天疱疮中作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分: 炎症相关皮肤病皮损中胸腺基质淋巴生成素表达研究 |
| 引言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分: 胸腺基质淋巴生成素通过树突状细胞参与大疱性类天疱疮发病机制 |
| 引言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分: 大疱性类天疱疮疱液中胸腺基质淋巴生成素对外周血树突状细胞的影响 |
| 引言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 胸腺基质淋巴生成素与自身免疫性疾病研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（7）单次大剂量放射治疗对树突状细胞淋巴结归巢及T细胞激活能力的影响及机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一章：搭建基于医用直线加速器照射细胞的照射平台和树突状细胞在体无创示踪平台等关键性技术平台 |
| (一) 树突状细胞体内示踪平台的建立 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| (二) 基于医用直线加速器的细胞照射平台的搭建 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二章：单次大剂量X射线照射对树突状细胞淋巴结归巢能力的影响及机制的探索 |
| 1.材料方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第三章：单次大剂量X射线照射树突状细胞对其T细胞激活能力的影响的研究 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 放射治疗产生免疫效应的机制及其临床应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表的第一作者论文 |
| 参加的主要学术会议 |
（8）树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病骨黼Thl亚群分化的作用及机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病抗白血病作用及机制的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 免疫相关基因单核苷黢多态性在急性醢系白血病中的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学位论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章 |
（9）MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 炎症性肠炎 |
| 1.2.1 炎症性肠炎概述 |
| 1.2.2 炎症性肠炎的机制 |
| 1.2 Th17细胞 |
| 1.2.1 Th17细胞概述 |
| 1.2.2 Th17细胞的起源和发育 |
| 1.2.3 Th17细胞的可塑性 |
| 1.2.4 Th17细胞在IBD中的功能 |
| 1.3 调节性免疫细胞概述 |
| 1.3.1 调节性T细胞 |
| 1.3.2 调节性B细胞 |
| 1.3.3 调节性红细胞 |
| 1.3.4 调节性的髓系细胞 |
| 1.4 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.1 MDSC的起源 |
| 1.4.2 MDSC的功能 |
| 1.4.3 MDSC扩增的调控机制 |
| 1.4.4 MDSC功能的调控机制 |
| 1.4.5 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.6 MDSC在炎症性肠炎中的作用 |
| 1.5 自身免疫病中MDSC与Th17细胞的关系 |
| 1.6 炎症性肠病中MDSC和Th17细胞的展望 |
| 第2章 肠炎小鼠中MDSC影响Th17细胞IL-17A和IL-17F的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 2.3.2 炎症性肠炎小鼠模型的构建 |
| 2.3.3 肠炎分级评分标准 |
| 2.3.4 外周血单个核细胞的分离 |
| 2.3.5 脾脏单细胞悬液制备 |
| 2.3.6 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 2.3.7 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 2.3.8 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 2.3.9 体外刺激PBMC实验 |
| 2.3.10 细胞表面染色 |
| 2.3.11 细胞内染色 |
| 2.3.12 抑制实验 |
| 2.3.13 抑制实验检测 |
| 2.3.14 荧光定量PCR |
| 2.3.15 转输实验 |
| 2.3.16 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠Th17细胞IL-17A表达降低,IL-17F表达升高 |
| 2.4.2 肠炎条件下Arg~(myKO)小鼠MDSC比例下降 |
| 2.4.3 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 2.4.4 转输WT小鼠来源的MDSC缓解Arg~(myeKO)小鼠肠炎 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 橡黄素通过ESR/STAT3通路促进MDSC存活 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 数据库 |
| 3.2.2 软件 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 试剂耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 3.3.2 体外实验橡黄素处理髓系细胞 |
| 3.3.3 橡黄素治疗肠炎小鼠 |
| 3.3.4 肠炎分级评分标准 |
| 3.3.5 橡黄素互作基因的预测 |
| 3.3.6 基因富集和通路分析 |
| 3.3.7 小鼠骨髓细胞的分离 |
| 3.3.8 荷瘤小鼠脾脏细胞的分离 |
| 3.3.9 人脐带血单个核细胞的分离 |
| 3.3.10 细胞表面染色 |
| 3.3.11 细胞内染色 |
| 3.3.12 荧光定量PCR |
| 3.3.13 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MDSC雌激素受体的激活通过STAT3通路上调Arg-1的分泌 |
| 3.4.2 扩增的MDSC减轻DSS诱导的小鼠肠炎 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 在肠炎小鼠中橡黄素通过MDSC产生的Arg-1调节Th17细胞因子分泌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 4.3.2 橡黄素治疗实验 |
| 4.3.3 外周血单个核细胞的分离 |
| 4.3.4 脾脏单细胞悬液制备 |
| 4.3.5 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 4.3.6 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 4.3.7 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 4.3.8 体外刺激PBMC实验 |
| 4.3.9 细胞表面染色 |
| 4.3.10 细胞内染色 |
| 4.3.11 荧光定量PCR |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 橡黄素通过上调ESR/pSTAT3促进MDSC促进Arg-1分泌 |
| 4.4.2 MDSC分泌的Arg-1促进Th17细胞IL-17A的表达,抑制IL-17F的水平 |
| 4.4.3 MDSC来源的Arg-1促进小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（10）加倍剂量依巴斯汀不能影响皮肤斑贴试验阳性结果 ——一项多中心自身对照研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 对象与方法 |
| 1、受试者来源 |
| 2、实验设计 |
| 2.1 入选标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 2.3 操作方法 |
| 2.4 斑贴试验的判断标准: (ICDRG) |
| 2.5 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 变应性接触性皮炎中的免疫效应 |
| 1. 第一阶段: 致敏阶段 |
| 1.1 半抗原 |
| 1.2 皮肤屏障 |
| 1.3 半抗原的固有免疫机制 |
| 2. 第二阶段: 激发阶段 |
| 2.1 角质形成细胞、中性粒细胞和肥大细胞——非抗原特异性炎症 |
| 2.2 抗原特异性T细胞——抗原特异性炎症 |
| 2.3 效应T细胞 |
| 2.4 调节性T细胞 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
四、树突状细胞在抗原特异性皮炎中的作用（论文参考文献）
- [1]力学特性对肿瘤免疫响应影响的建模分析[D]. 张颖. 太原理工大学, 2021(01)
- [2]清热除湿汤及活性成分对特应性皮炎小鼠与肥大细胞的调控作用和机制探讨[D]. 蒙玉娇. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]粘蛋白MUC1在结肠癌中诱导免疫抑制的作用机制研究[D]. 张颖慧. 昆明医科大学, 2021
- [4]利用环状RNA FSCN1沉默的树突状细胞预防心脏移植中的异体免疫排斥反应[D]. 王铂文. 吉林大学, 2021
- [5]细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究[D]. 黄涛. 浙江大学, 2021(01)
- [6]胸腺基质淋巴生成素在大疱性类天疱疮中作用机制的研究[D]. 李思哲. 北京协和医学院, 2021(02)
- [7]单次大剂量放射治疗对树突状细胞淋巴结归巢及T细胞激活能力的影响及机制的研究[D]. 周子琦. 北京协和医学院, 2021(02)
- [8]树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究[D]. 刘芹芹. 山东大学, 2020(04)
- [9]MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究[D]. 马占川. 吉林大学, 2020(08)
- [10]加倍剂量依巴斯汀不能影响皮肤斑贴试验阳性结果 ——一项多中心自身对照研究[D]. 朱丽珺. 苏州大学, 2020(02)
标签：白血病论文; 树突状细胞论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 细胞免疫论文; 细胞分化论文;